Nuôi cấy huyền phù tế bào

Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh ra

Nhóm 7:Nuôi cấy huyền phù tế bào

• Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh

ra Cho nên mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn năng Thực vật bậc cao là một nguồn cung cấp các hợp chất hóa học và dược liệu rất quan trọng Tuy nhiên trong những năm gần đây sản lượng các thực vật đó rất khó đảm bảo ở mức ổn định do hậu quả của một số yếu tố như:

• - Điều kiện tự nhiên không thuận lợi.

• - Chi phí lao động ngày càng tăng.

• - Khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong trồng trọt.

• Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào (dịch lỏng) của thực vật có khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên.

NỘI DUNG

V Các chỉ tiêu xác định tốc độ sinh trưởng

I KHÁI NIỆM

♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures):

Phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng.

♣ Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy.

♣ Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng.

♣ Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.

I KHÁI NIỆM

♣ 1949: Caplin và Steward đã nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trường lỏng có khuấy.

♣ Muis (1954) và Nickell (1956) cho thấy rằng các tế bào thực vật có thể sinh trưởng được như các cơ thể vi sinh vật.

♣ 1959, Melches và Beckman đã tách và nuôi cấy thành công tế bào đơn và huyền phù tế bào.

II LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU

Nuôi cấy huyền phù tế bào Khoai tây

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

♣ Tùy điều kiện và mục đích mà có các phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù khác nhau Chủ

yếu là phương pháp: Nuôi cấy dịch thể động.

Trong nuôi cấy dịch thể động có hệ thống cung

cấp khí (thổi khí), các khí đều được “vô trùng”.

3.1 Nuôi cấy dịch thể động

3.1.1 Nuôi cấy chìm liên tục

♣ Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng

do chúng được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường.

♣ Sự thông khí được thực hiện nhờ máy lắc chạy ở tốc

độ 100 - 150 vòng/phút Khí đưa vào phải đảm bảo

vô trùng Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

♣ Theo Thomas và Davey

(1975), nuôi cấy huyền

với kích thước bình nuôi

cấy, thường chiếm 20%

thể tích bình

Máy lắc tròn

♣ Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong những thời gian ngắn, có thể sử dụng máy khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian cho quá trình nuôi cấy thường

3.1.2 Nuôi cấy chìm tuần hoàn

♣ Các tế bào được nhúng chìm vào môi trường dịch thể, xen kẽ với những khoảng thời gian được đưa ra ngoài môi trường.

♣ Quá trình được thực hiện nhờ sự chuyển động “bập bênh” của các bình nuôi cấy.

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

♣ Khi chuyển động:

 Khối tế bào ở đầu này được

đưa vào môi trường

 Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

3.2 Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào bằng Bioreactor:

♣ Hệ thống nuôi cấy được thông khí hoặc được trao đổi khí

♣ Môi trường nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới theo từng thời kỳ

♣ Tế bào thực vật nhạy cảm với stress hơn vi khuẩn nên hệ thống bioreactor cho nuôi cấy tế bào thực vật yêu cầu thường xuyên cải thiện hệ thống thông khí và hệ thống trộn môi trường

♣ Tế bào thực vật cần ánh sáng cho quang hợp nên cần có

Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo

♣ Takayama và Miasawa là những người đầu tiên sử dụng bioreactor vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly, hoa lan hồ điệp.

♣ Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa.VD: 1 bioreactor vibro-mixer trang bị với các ống silicone

có khả năng sản xuất 100.000 phôi vô tính của cây trạng nguyên trong 1lit dịch huyền phù nếu như dung dịch đó được đặt trên 1tấm giấy lọc và phát triển trong 4 tuần

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

♣ Bioreactor sử dụng

trong nuôi cấy mô

tế bào thực vật

được cải tiến từ các

loại bioreactor trong

nuôi cấy tế bào vi

sinh.

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

hay thổi khí để duy

trì nuôi cấy gần như

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

Hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ

tơ nhân sâm Hàn Quốc

 Khi thao tác nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy

và môi trường vật lí có thể được kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng Điều này không thể thực hiện với hệ thống nuôi cấy bình tam giác.

♣ Nhược điểm: đòi hỏi thiết bị hiện đại và đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt là khâu chống nhiễm cho huyền phù nuôi cấy.

III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

Bioreactor trong phòng Nuôi cấy mô tế bào và công

nghệ tế bào thưc vật -Viện DT nông nghiệp

♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ 2 – 3 g/100ml dung dịch môi trường (Helgeson, 1979).

♣ Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

♣ Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được điều chỉnh bởi thành phần môi trường.

VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế bào xốp.

♣ Theo King và Street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào.

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

♣ Sinh trưởng và phát triển của tế bào nuôi cấy:

 Pha lag: bắt đầu khi đưa mô sẹo vào môi trường, kéo dài cho tới lần phân bào đầu tiên

 Pha tăng tốc: các tế bào bắt đầu phân chia và số lượng

tế bào tăng dần

 Pha hàm số mũ: số lượng tế bào tăng theo hàm số mũ

 Pha ổn định: số lượng tế bào đạt cực đại và không đổi

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

♣ Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn sớm của pha ổn định.

 Thời điểm cấy truyền cụ thể dựa vào kinh nghiệm, nói chung là nên bắt đầu khi mật độ tế bào cực đại.

 Mật độ tế bào cực đại trong khoảng 18 – 25 ngày, với huyền phù sinh trưởng mạnh có thể ngắn hơn, từ

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

♣ Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần được lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn, các mảnh từ mẫu cấy ban đầu, sau đó dùng pipet để lấy dịch cấy truyền.

♣ Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm bảo mật độ tế bào, vì khi thấp quá các tế bào sẽ không sinh trưởng được.

VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acer pseudoplatanus) mật độ thích hợp 9 – 15.103 tb/ml.

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

♠ Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy, sinh trưởng và trao đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào Đặc điểm của dòng

tế bào:

 Khả năng tách tế bào cao.

 Hình thái tế bào đồng nhất.

 Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc.

IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ

 Tương đối ít các yếu

5.1 Số lượng tế bào

♣ Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút.

♣ Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu.

♣ Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy.

V CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ

SINH TRƯỞNG

5.3 Khối lượng tươi và khối lượng khô tế bào

 Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định.

 Rửa bằng nước cất vô trùng

 Làm khô trong chân không.

 Cân để xác định khối lượng.

V CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ

SINH TRƯỞNG

5.4 Xác định thành phần Protein

♣ Thu thập tế bào, chuyển lên lọc qua giấy Whatman.

♣ Rửa tế bào trong ethanol 70% đang sôi.

♣ Làm khô với Aceton rồi chuyển vào dung dịch NaOH 1M.

6.1 Sản xuất sinh khối tế bào và

các hợp chất thứ cấp

♣ Sản phẩm của nuôi cấy huyền phù tế bào thường đặc trưng là những chất có giá trị cao và cần ở lượng nhỏ.

♣ Có thể chia thành các nhóm dựa theo công dụng:

 Hợp chất thứ cấp trong y học.

 Hợp chất thứ cấp trong hóa mỹ phẩm.

 Hợp chất thứ cấp trong công nghiệp.

VI ỨNG DỤNG

♣ Tại sao phải nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối?

 Tàn phá môi trường và sự xói mòn di truyền.

 Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không đều đặn, không vững chắc, chất lượng không ổn định.

 Nhiễm bẩn do thuốc trừ sâu, bệnh hại, chất phóng xạ hay kim loại nặng …

VI ỨNG DỤNG

 Tỷ lệ % khối lượng khô các hợp chất thứ cấp cao hơn

so với nguyên liệu thực vật thu hái trong tự nhiên

 Không tốn nhiều diện tích gieo trồng

 Thu sinh khối tế bào lớn trong thời gian ngắn

♣ Một số hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật:

 Diosgenin: Tác dụng chống viêm; chữa sốt, đái buốt, đái vàng, thấp khớp, đau lưng, đau dây thần kinh

- Việc nuôi cấy Dioscorea deltoidea Wall ex Griseb (cây Củ

nâu) trong bioreactor đã thu được năng suất diosgenin cao hơn so với hiệu suất có được từ nguyên liệu tự nhiên

VI ỨNG DỤNG

- Sản xuất morphin đã được

thực hiện bằng việc nuôi

cấy huyền phù tế bào tế

bào Papaver somniferum.

VI ỨNG DỤNG

 Steviol:

- Chất tạo vị ngọt được biết

đến rộng rãi, thu nhận từ

cây Stevia rebaudiana.

- Nuôi cấy callus là giai

đoạn tiền đề để nuôi cấy

huyền phù tế bào trong

tích lũy steviol

VI ỨNG DỤNG

 Taxol:

- Là một nhóm chất trong hóa trị

liệu ung thư, điều trị ung thư

buồng trứng, ung thư vú, ung

thư phổi, khối u ác tính, và các

dạng u bướu khác

- Nuôi cấy tế bào các loài Taxus

được xem như là một phương

pháp ưu thế để cung cấp ổn

định nguồn taxol và dẫn xuất

taxane của nó (T cuspidata, Cây thông đỏ (Taxus brevifolia)

- Nuôi cấy huyền phù tế bào

Scopolia japonica có bổ sung

VI ỨNG DỤNG

 Saponin và sapogenin:

- Là một dược phẩm quý giá, có

nhiều trong rễ cây nhân sâm

(Panax ginseng), có tác dụng chữa

bệnh rối loạn tiêu hóa, chống suy

nhược cơ thể, tăng cường sinh lực.

- Nuôi cấy huyền phù tế bào cây

P ginseng đang tiến hanh trên quy

mô công nghiệp

- Đây là một trong các đối tượng

được các nhà khoa học trên thế

- Thành tựu nuôi cấy cơ quan

cây Beta vulgaris, nuôi cấy

callus và huyền phù của

6.2 Trong công tác chọn giống cây trồng:

♣ Sử dụng để chọn lọc các dòng tế bào mong muốn

qua các test thanh lọc.

♣ Sau đó tái sinh các tế bào đã chọn lọc thành cây hoàn chỉnh.

♣ Cây hoàn chỉnh sẽ trở thành vật liệu khởi đầu quan trọng trong công tác giống.

♣ Ngoài ra, tách protoplast hoặc là nguồn để sản xuất các phôi vô tính.

VI ỨNG DỤNG

♣ Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây

Bắt ruồi Drosera indica L cho mục tiêu thu nhận

Plumbagin (Quách Diễm Phương).

♣ Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây

Bèo đất Drosera burmalni Vahl cho mục tiêu thu

nhận 1 hợp chất Anthraquinone Quách Diễm Phương (đề tài NCCB của ĐH Quốc gia TP HCM)

VII CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

♣ Nghiên cứu nuôi cấy mô sẹo và dịch huyền phù cây

Mãn Đình Hồng Althaea rosea L nhằm thu nhận

Rutin trong điều trị tim mạch (Quách Diễm Phương).

♣ Nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào họ

cây Drosera.sp để thu nhận các hợp chất Quinone

có hoạt tính sinh học (Quách Ngô Diễm Phương).

VII CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

♣ Thành công trong quy trình tạo sinh khối tế bào rễ sâm Ngọc Linh bằng ứng dụng công nghệ Biomass – Học viện Quân Y.

♣ Các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học (Viện khoa học và Công nghệ Việt nam) đã hoàn chỉnh quy trình nhân nhanh sinh khối mô của cây Hoàng Liên

gai (Berberis Wallichiarna DC) bằng công nghệ tế

bào thực vật để làm nguồn dược liệu sản xuất thuốc becberin.

VII CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

Tuy nhiên, do những khó khăn trong việc tìm kiếm tài liệu nên nhóm chúng em không đưa ra được một quy trình sản xuất dựa trên nuôi cấy huyền phù tế bào, mà chỉ đưa ra được một công trình nghiên cứu

ở giai đoạn đầu:

ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU HÒA SINH TRƯỞNG

THỰC VẬT VÀ ĐƯỜNG SACCHAROSE LÊN DỊCH NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

DỪA CẠN CATHARANTHUS ROSEUS

Tác giả:

Bùi Văn Lệ, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG-HCM

Nguyễn Ngọc Hồng, Trường Đại học Bán công Tôn Đức Thắng

VII CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

1 ĐẶT VẤN ĐỀ

♣ Dừa cạn Catharanthus roseus.G.Don thuộc họ Trúc

đào Apocynaceae là một trong những dược liệu chứa nhiều alkaloid

♣ Từ dừa cạn người ta chiết được chất chữa ung thư

như vinblastin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin

♣ Tuy nhiên hàm lượng của những chất này có trong

cây là rất thấp Việc nuôi cấy tế bào cây dừa cạn để VII CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

• Cây dừa cạn Catharanthus roseus

• Ajmalicin

2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

♣ Mô sẹo màu xanh được nuôi trong điều kiện chiếu sáng

từ lá dừa cạn in vitro 4 tháng tuổi được chuyển vào 100

ml môi trường cảm ứng trong erlen 250 ml

♣ Môi trường cảm ứng gồm môi trường MS + Vitamin Morel + Hormon tăng trưởng thực vật (NAA hoặc 2,4-D và Kin hoặc BAP) + 30g/l đường sucrose

♣ Sau đó đặt vào máy lắc 200 vòng/phút ở nhiệt độ 25± 2oC trong điều kiện chiếu sáng liên tục 16 giờ/ngày

VII CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

♣ Xác định sinh khối bằng phương pháp cân.

♣ Chiết tách alkaloid toàn phần từ sinh khối tế bào Dừa cạn theo phương pháp của Kutney và cộng sự (1983)

♣ Xác định alkaloid toàn phần bằng phương pháp acid-baz

- khan theo dược điển Việt Nam và dược điển Anh

VII CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

VII CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

Cây dừa cạn tự

nhiên

Khử trùng và nuôi cấy trong

Sinh khối

Định lượng alkaloid toàn phần

Nuôi cấy trong 28 ngày

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ cytokinin đến sự tạo sinh khối

Kết luận:

 Ở bảng trên cho thấy môi trường chỉ bổ sung NAA có sự tạo sinh khối thấp hơn so với môi trường bổ sung NAA kết hợp với Kin

 Môi trường K4 (MS + NAA (1mg/l) + Kin (0.5 mg/l) và K8 (MS + NAA (1mg/l) + BAP (0.5 mg/l) cho sinh khối tươi và

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sinh khối

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sinh khối

3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.2 Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến việc tạo sinh khối

Kết luận:

 Môi trường có bổ sung 2,4-D tạo sinh khối tươi nhiều hơn

so với môi trường bổ sung NAA nhưng trọng lượng khô lại rất thấp Môi trường K3 và K4 có trọng lượng tươi thấp hơn môi trường K1 và K2 nhưng cho sinh khối khô nhiều hơn Môi trường K3 cho sinh khối tươi và khô đều cao hơn môi trường K3 nhưng xét về mặt thống kê, hai môi trường này không có sự khác biệt ở mức ý nghĩa α = 0.01