Nuôi cấy huyền phù tế bào

Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh ra

1 Nhóm 7:Nuôi cấy huyền phù tế bào • Bản thân mỗi tế bào thực vật là một đơn vị độc lập, nó chứa đựng tất cả những thông tin di truyền đặc trưng của cơ thể từ đó nó sinh ra. Cho nên mỗi tế bào có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể mới nhờ tính toàn năng. Thực vật bậc cao là một nguồn cung cấp các hợp chất hóa học và dược liệu rất quan trọng. Tuy nhiên trong những năm gần đây sản lượng các thực vật đó rất khó đảm bảo ở mức ổn định do hậu quả của một số yếu tố như: • - Điều kiện tự nhiên không thuận lợi. • - Chi phí lao động ngày càng tăng. • - Khó khăn kỹ thuật và kinh tế trong trồng trọt. • Phương pháp nuôi cấy huyền phù tế bào (dịch lỏng) của thực vật có khả năng góp phần giải quyết những khó khăn trên. 2 NỘI DUNG I. Khái niệm nuôi cấy huyền phù tế bào II. Lịch sử nghiên cứu III. Các phương pháp nuôi cấy IV. Đặc trưng của tế bào nuôi cấy huyền phù V. Các chỉ tiêu xác định tốc độ sinh trưởng VI. Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào VII. Công trình nghiên cứu cụ thể VIII. Kết luận 3 I. KHÁI NIỆM ♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures): Phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng. ♣ Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy. 4 ♣ Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng. ♣ Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. I. KHÁI NIỆM 5 ♣ 1949: Caplin và Steward đã nuôi cấy tế bào thực vật trên môi trường lỏng có khuấy. ♣ Muis (1954) và Nickell (1956) cho thấy rằng các tế bào thực vật có thể sinh trưởng được như các cơ thể vi sinh vật. ♣ 1959, Melches và Beckman đã tách và nuôi cấy thành công tế bào đơn và huyền phù tế bào. II. LỊCH SỬ NGHIÊN CỨU 6 Nuôi cấy huyền phù tế bào Khoai tây 7 III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ♣ Tùy điều kiện và mục đích mà có các phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù khác nhau. Chủ yếu là phương pháp: Nuôi cấy dịch thể động. Trong nuôi cấy dịch thể động có hệ thống cung cấp khí (thổi khí), các khí đều được “vô trùng”. 8 3.1. Nuôi cấy dịch thể động 3.1.1. Nuôi cấy chìm liên tục ♣ Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do chúng được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường. ♣ Sự thông khí được thực hiện nhờ máy lắc chạy ở tốc độ 100 - 150 vòng/phút. Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng. Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dính của các tế bào với nhau. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 9 III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ♣ Theo Thomas và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25 ml, tốc độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 – 120 vòng/phút. ♣ Thể tích của môi trường lỏng cũng phải phù hợp với kích thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình. Máy lắc tròn 10 ♣ Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong những thời gian ngắn, có thể sử dụng máy khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian cho quá trình nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày. ♣ Sau đó, các mẫu nuôi cấy phải được cấy chuyển sang môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào. III. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY [...]... nhiễm cho huyền phù nuôi cấy 18 Bioreactor trong phòng Nuôi cấy mô tế bào và công nghệ tế bào thưc vật -Viện DT nông nghiệp 19 IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ ♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ 2 – 3 g/100ml dung dịch môi trường (Helgeson, 1979) ♣ Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và... bình nuôi cấy đặc biệt theo phương pháp nuôi cấy chìm tuần hoàn Hệ thống nuôi cấy chìm tuần hoàn 12 III CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 3.2 Nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào bằng Bioreactor: ♣ Hệ thống nuôi cấy được thông khí hoặc được trao đổi khí ♣ Môi trường nuôi cấy có thể dễ dàng thay mới theo từng thời kỳ ♣ Tế bào thực vật nhạy cảm với stress hơn vi khuẩn nên hệ thống bioreactor cho nuôi cấy tế bào. .. xấp xỉ số tế bào chết đi 22 IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ Pha ổn định Số lượng tế bào Pha hàm số mũ Pha lag Pha tăng tốc Thời gian 23 IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ ♣ Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn sớm của pha ổn định  Thời điểm cấy truyền cụ thể dựa vào kinh nghiệm, nói chung là nên bắt đầu khi mật độ tế bào cực đại... trưởng được VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acer pseudoplatanus) mật độ thích hợp 9 – 15.103 tb/ml 25 IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ ♠ Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy, sinh trưởng và trao đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào Đặc điểm của dòng tế bào:  Khả năng tách tế bào cao  Hình thái tế bào đồng nhất  Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc  Nhiều... độ tế bào cực đại trong khoảng 18 – 25 ngày, với huyền phù sinh trưởng mạnh có thể ngắn hơn, từ 6 – 9 ngày 24 IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ ♣ Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần được lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn, các mảnh từ mẫu cấy ban đầu, sau đó dùng pipet để lấy dịch cấy truyền ♣ Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm bảo mật độ tế bào, vì khi thấp quá các tế bào. .. CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ ♣ Sinh trưởng và phát triển của tế bào nuôi cấy:  Pha lag: bắt đầu khi đưa mô sẹo vào môi trường, kéo dài cho tới lần phân bào đầu tiên  Pha tăng tốc: các tế bào bắt đầu phân chia và số lượng tế bào tăng dần  Pha hàm số mũ: số lượng tế bào tăng theo hàm số mũ  Pha ổn định: số lượng tế bào đạt cực đại và không đổi theo thời gian, số tế bào sinh ra (do phân bào) ... các tế bào chết 20 IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ ♣ Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được điều chỉnh bởi thành phần môi trường VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ Auxin/Cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế bào xốp ♣ Theo King và Street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào 21 IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ... ỨNG DỤNG ♣ Tại sao phải nuôi cấy huyền phù tế bào thu sinh khối?  Tàn phá môi trường và sự xói mòn di truyền  Sự cung cấp nguồn nguyên liệu không đều đặn, không vững chắc, chất lượng không ổn định  Nhiễm bẩn do thuốc trừ sâu, bệnh hại, chất phóng xạ hay kim loại nặng … ♣ Nuôi cấy huyền phù tế bào khắc phục được các nhược điểm trên 34 VI ỨNG DỤNG Ngoài ra, nuôi cấy huyền phù tế bào còn có một số ưu... đậm đặc  Nhiều hạt tinh bột 26 IV ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ  Tương đối ít các yếu tố mạch  Có khả năng nhân đôi trong 24 – 72h  Mất tính toàn năng  Quen với chất sinh trưởng  Tăng mức đa bội thể Tế bào trong nuôi cấy huyền phù 27 V CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG 5.1 Số lượng tế bào ♣ Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 – 10... lượng tế bào/ ml dung dịch nuôi cấy 28 V CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG 5.2 Thể tích tế bào ♣ Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/phút trong thời gian 5 phút ♣ Thu tế bào và đem xác định thể tích ♣ Kết quả:  Số ml tế bào/ thể tích môi trường nuôi cấy  Tỷ lệ % 29 V CÁC CHỈ TIÊU XÁC ĐỊNH TỐC ĐỘ SINH TRƯỞNG 5.3 Khối lượng tươi và khối lượng khô tế bào ♣ Khối . DUNG I. Khái niệm nuôi cấy huyền phù tế bào II. Lịch sử nghiên cứu III. Các phương pháp nuôi cấy IV. Đặc trưng của tế bào nuôi cấy huyền phù V. Các chỉ tiêu. huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết. IV. ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO TRONG NUÔI CẤY