Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào

Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào

Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 1 PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO 1. ðặc ñiểm tế bào ñộng vật 1.1 Sự ñiều hòa trao ñổi chất Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào. Sự chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại của cơ thể sống. Ở tế bào động vật, ngoài tác động của hoạt động enzyme, hệ dịch quanh tế bào, chúng còn bị tác động rất mạnh bởi hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá trình trao đổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất chặt chẽ đến sự điều khiển của hệ thần kinh. Do đó, việc trao đổi chất của tế bào động vật ở cơ thể sống là hết sức phức tạp. Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, giống như quá trình trao đổi chất ở tế bào vi sinh vật. Khi đó, tế bào động vật trở thành một thực thể độc lập không tuân theo các qui luật của mô và qui luật của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và điều khiển các hoạt động của enzyme. Sự hoạt động của enzyme cũng như quá trình tổng hợp enzyme sẽ quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản phẩm trao đổi chất của tế bào cũng như khả năng phân chia tế bào. Hai vấn đề mang tính chất quyết định trong việc điều khiển quá trình tổng hợp và hoạt động của tế bào: Bản chất tự nhiên – nguồn gốc – của tế bào giúp định hướng sản phẩm cuối. Yếu tố môi trường quyết định tính trạng riêng biệt của tế bào giúp tính trạng đó được biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy. Mọi tác động của môi trường đến tế bào nuôi cấy in vitro đều là những tác động trực tiếp, xảy ra rất nhanh và rất mãnh liệt; do đó khi tiến hành kỹ thuật nuôi cấy in vitro cần tạo ra sự hài hòa trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được nuôi cấy. 1.2 Tính chất cơ học yếu Tế bào động vật không có thành tế bào, chúng chỉ được bao bọc bởi một màng tế bào. Màng tế bào như một thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với tế bào trong mô. Các tế bào động vật trong mô liên kết với nhau qua gian bào. Sự liên kết các tế bào trong mô này thường ở những vị trí đặc biệt. Trong những điểm kết nối chứa đầy các phân tử protein có tên khoa học là glycoprotein. Các protein này kết nối với sợi actin trong tế bào chất. Kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10µm, lại không có vách tế bào nên có tính chất cơ học yếu. Do đó, nên khi thiết kế các thiết bị lên men hay trong quá trình vận hành nuôi cấy cần phải sử dụng máy mắc hay cánh khuấy có tốc độ rất thấp để tránh sự phá vỡ tế bào. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 2 1.3 Khả năng phân chia và tốc ñộ tăng trưởng chậm Ở động vật, một chu trình tế bào thường kéo dài khoảng 20 – 70 giờ. Thời gian phân chia của tế bào có liên quan đến sự đấu tranh sinh tồn và sự bảo toàn tính di truyền của một loài; do đó nó mang tính chất loài. Các yếu tố môi trường bên ngoài thường tác động gián tiếp đến tế bào động vật. Sự phát triển của tế bào trong các mô của động vật thường xảy ra một cách hài hòa giữa các mô trong toàn bộ cơ thể, giúp tạo ra hình thái riêng biệt cho từng loài và từng cá thể. Nếu trong một điều kiện nào đó, một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất thường, cơ thể sẽ chuyển sang trạng thái bệnh lý. Ngoài khả năng tăng chậm về số lượng tế bào, sự phát triển của tế bào động vật xảy ra cũng rất chậm, gây khó khăn cho việc nuôi cấy tế bào động vật in vitro. 1.4 Nhân ñôi trong quá trình phát triển cần giá ñỡ Trong cơ thể người và động vật tồn tại hai loại tế bào: Loại tế bào tự do: tế bào máu, tế bào sinh dục. Loại tế bào ở dạng liên kết trong các mô. Tế bào máu là loại tế bào hoàn toàn tự do, tồn tại trong hệ tuần hoàn. Nhờ trạng thái tự do này mà tế bào máu có chức năng rất riêng biệt. Tế bào sinh dục thuộc loại tế bào bán tự do. Có nghĩa chỉ tồn tại tự do ở trạng thái sinh lý nhất định. Các tế bào còn lại tồn tại trong mô, chúng chỉ có thể tăng số lượng và phát triển trên một giá đỡ nào đó. 1.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao ñổi chất của tế bào Các nhà khoa học gọi cơ chế này là cơ chế kìm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (feed back). Thực ra, bất kỳ tế bào sinh vật nào đều cũng biểu hiện cơ chế này. Điểm khác biệt của tế bào động vật là ở chỗ quá trình tổng hợp thừa ít xảy ra và hiện tượng các sản phẩm trao đổi chất từ trong tế bào thoát ra khỏi tế bào thường rất chậm. 1.6 Khả năng tiếp nhận gen lạ Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên. Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ở trạng thái tự do, khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (thông tin di truyền từ virus…) hoặc khi cho những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau (nhân khác nhau) ở gần nhau, sẽ xảy ra hiện tượng trao đổi vật chất di truyền. Hiện tượng này tạo ra các tế bào lai (hybridoma). Hiện tượng lai này có ý nghĩa rất lớn trong việc tạo ra dòng lai mới. 1.7 Khả năng bảo quản trong ñiều kiện nhân tạo Tế bào động vật cần phải được bảo quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ được những đặc tính riêng của nó. Người ta thường sử dụng nitrogen lỏng hoặc bơm những chất phụ gia vào các dòng tế bào động vật và bảo quản chúng ở nhiệt độ - 70 o C. Bằng biện pháp này, tế bào động vật vẫn duy trì được đặc tính của chúng trong thời gian rất dài. Khi sử dụng, tế bào động vật được Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 3 tiến hành giải đông và được hoạt hóa để phục hồi lại khả năng tăn trưởng và phân chia như trước khi đem bảo quản. Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trường, rất nhạy cảm với kim loại. Trong quá trình phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết thanh, hormone. 2. Tế bào mầm (Stem Cell) Trong cơ thể động vật có một loại tế bào luôn luôn sẵn sàng bù đắp những mất mát, tổn thương bất kỳ nào đó của cơ thể: sự tạo máu, liền cơ, xương, da, mọc tóc,… nhưng trước đây người ta không chú ý đến tiềm năng và vai trò của tế bào này. Tế bào mầm là những tế bào có khả năng phân chia ở những giai đoạn không xác định trong quá trình nuôi cấy và có thể biệt hóa tạo ra những tế bào chuyên biệt. Định nghĩa tương đối về tế bào mầm như sau: tế bào mầm là những tế bào có khả năng cho sự tái tạo kéo dài vô hạn, và vì vậy, có thể giúp tạo ra ít nhất là một kiểu tế bào hậu duệ có khả năng biệt hóa cao. Thông thường còn có một loại tế bào trung gian giữa tế bào mầm và tế bào đã biệt hóa (tế bào đích): Một số ñặc ñiểm sinh học của tế bào mầm 2. 1 ðặc ñiểm chức năng Luôn phân chia để tạo ra tế bào mới. Là nguồn gốc của sự gia tăng số lượng tế bào trong cơ thể. Có khả năng tạo nhiều kiểu tế bào đích khác nhau. Có cơ chế điều hòa gen đặc biệt. Dễ dàng thích nghi. 2.2 ðặc ñiểm tiến hóa Các nhà khoa học cho rằng tế bào mầm là nguồn gốc của sự tiến hóa, tuy nhiên người ta vẫn chưa xác định được thời điểm xuất hiện của các tế bào mầm trong các tổ chức sinh học, cũng như những yếu tố điều khiển sự khác biệt đó. 2.3 Hai phương thức tái tạo và biệt hóa của tế bào mầm. Sự tái tạo trực tiếp xảy ra bằng cách phân chia bất đối xứng: một tế bào gốc ra hai tế bào con, trong hai tế bào con đó sẽ có một tế bào gốc và một tế bào tiền biệt hóa, và chỉ có tế bào tiền biệt hóa mới tiếp tục phân chia hoặc biệt hóa tiếp theo. Cơ chế điều hòa mức độ cao: o Tế bào mầm tạo ra hai tế bào con đều có khả năng tiền biệt hóa như nhau. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 4 o Các tế bào tiền biệt hóa đều có khả năng biệt khóa theo các con đường khác nhau và ở nhiều giai đoạn khác nhau. 3. Sinh học của tế bào ñộng vật trong quá trình nuôi cấy. 3.1 Môi trường nuôi cấy Trạng thái của tế bào động vật trong quá trình nuôi cấy tương tự như một kiểu chức năng sinh lý thường xuyên tồn tại trong cơ thể động vật. Trong quá trình nuôi cấy, khi có sự biến đổi điều kiện môi trường thì đặc tính của tế bào sẽ thay đổi theo. Những tế bào không tăng sinh bình thường in vivo (trong cơ thể) có thể tăng sinh trong in vitro; hơn nữa trong điều kiện in vivo, những tương tác giữa tế bào với tế bào và giữa tế bào với chất gian bào giảm xuống vì chúng đồng dạng với nhau và không có được một cấu trúc 3 chiều, đồng thời, hormone và các chất dinh dưỡng cung cấp dễ bị biến đổi. Lý do này khiến các nhà khoa học tập trung nghiên cứu xây dựng một môi trường phù hợp cho sự tăng trưởng, chuyển động đến vị trí cơ chất, tăng sinh của những tế bào không chuyên biệt hơn là môi trường cần thiết cho sự biểu hiện các chứ năng khác nhau của tế bào. Việc sử dụng môi trường thích hơp, cung cấp dưỡng chất, hormone và cơ chất là những vấn đề cơ bản cho sự biểu hiện những chức năng chuyên biệt của tế bào. Trước khi duy trì những điều kiện chuyên biệt như vậy, cần phải kiểm tra trong những trường hợp có thể xảy ra khi tiến hành nuôi cấy sơ khởi cũng như nuôi cấy dòng tế bào sau đó. 3.2 Khởi ñầu việc nuôi cấy (nuôi cấy sơ khởi) Việc nuôi cấy được bắt đầu tiến hành khi tế bào được tách ra từ mô bằng phương pháp cơ học hay bằng phương pháp xử lý enzyme, và có thể tăng trưởng trong môi trường thích hợp. Cho dù tế bào được tách ra bằng bất kỳ phương pháp vào thì đây vẫn là giai đoạn chọn lọc đầu tiên của quá trình nuôi cấy để cuối cùng có thể thu các dòng tế bào tương đối đồng dạng. Bảng 1: Những yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của dòng tế bào Giai ñoạn Yếu tố ảnh hưởng lên sự chọn lọc Mẫu cấy sơ khởi Tách tế bào bằng enzyme Cô lập Tách tế bào bằng phương pháp cơ học Tách tế bào bằng enzyme. Nuôi cấy sơ khởi Tăng trưởng nhanh Bám vào cơ chất và tăng kích thước. Cấy chuyền Nhạy cảm với trepsin Sự hạn chế dưỡng chất, hormone, cơ chất. ðược nhân lên như một dòng Tốc độ tăng trưởng tương đối của các tế bào khác nhau. Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 5 tế bào Ảnh hưởng của mật độ tế bào lên sự vượt trội của các kiểu hình bình thường hay kiểu hình biến đổi. Sự hạn chế dưỡng chất, hormone và cơ chất. Lão suy, biến ñổi gen Các tế bào thường chết. Các tế bào biến đổi tăng trưởng mạnh. Trong giai đoạn nuôi cấy sơ khởi (primary culture) (giai đoạn từ khi tế bào được tách ra khỏi mô và được nuôi cấy in vitro), sự chọn lọc dựa vào đặc tính của tế bào như tế bào có thể được tách ra khỏi mẫu cấy ban đầu một cách dễ dàng. Đối với những tế bào phân tán, chỉ có những tế bào nào còn sống sau khi tách rời khỏi nhau và bám vào cơ chất thành một lớp mỏng hoặc tồn tại được trong dịch huyền phù thì sẽ trở thành đối tượng cơ bản của quá trình nuôi cấy sơ khởi. Nếu giai đoạn nuôi cấy sơ khởi kéo dài được hơn vài giờ đồng hồ thì bước chọn lọc tiếp theo sẽ xảy ra. Những tế bào có khả năng tăng sinh sẽ tăng lên, một vài loại tế bào sẽ sống nhưng không tăng sinh, một số khác sẽ không sống được trong điều kiện nuôi cấy này. Vì lý do này, sự phân bố của các loai tế bào sẽ tiếp tục thay đổi cho đến khi bề mặt của cơ chất hoàn toàn được bao phủ bởi tế bào (trong trường hợp tế bào nuôi cấy tạo thành từng lớp đơn). Khi đó, tỷ lệ tế bào nhạy cảm với mật độ tới hạn sẽ từ từ giảm xuống, còn tỷ lệ những tế bào không nhạy cảm với mật độ tới hạn sẽ tăng lên. Việc giữa cho mật độ tế bào thấp, ví dụ như cấy chuyền thường xuyên, sẽ giúp duy trì kiểu hình bình thường của tế bào trong quá trình nuôi cấy như trường hợp nguyên bào sợi của chuột, và những tế bào biến đổi tự phát có khuynh hướng tăng trưởng mạnh khi mật độ tế bào cao (Tadaro và Green, 1963; Brouty – Boyé và cộng sự, 1979) Một vài khía cạnh của các chức năng chuyên biệt của tế bào có thể có biểu hiện mạnh hơn trong giai đoạn nuôi cấy sơ khởi, đặc biệt là khi tất cả các bề mặt của cơ chất đều được tế bào bám vào và các tế bào tạo ra môi quan hệ gần với nhau. Tế bào thu được trong giai đoạn này được gọi là tế bào sơ khởi (primary cell). Các tế bào sơ khởi không đồng nhất với nhau do chúng là các thế hệ con cháu của nhiều loại tế bào ban đầu khác nhau. Ở giai đoạn này, tế bào nuôi cấy có hình thái gần giống với mô cha mẹ nhất. 3.3 Sự phát triển của dòng tế bào Sau lần cấy chuyền đầu tiên các tế bào sơ khởi được thu nhận ổn định và trở thành dòng tế bào (cell line), lúc này tế bào có thể được nhân lên và cấy chuyền vài lần. Qua mỗi lần cấy chuyền, những tế bào có khả năng tăng sinh cao nhất sẽ dần dần chiếm ưu thế và những tế bào không tăng sinh hoặc tăng sinh chậm sẽ bị phân tán. Đây là điểm nổi bật nhất sau lần cấy chuyền đầu tiên khi có sự khác nhau về khả năng tăng sinh cùng với khả năng biến đổi để chịu đựng được những tác động của trypsin và sự cấy chuyền tế bào. Mặc dù vẫn có sự chọn lọc và sự tiến triển về hình thái, nhưng lần cấy chuyền thứ ba trở nên ổn định hơn, điển hình là tế bào có khả năng tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ. Những tế bào này thường có nguồn gốc từ trung mô, xuất phát từ những mô liên kết với Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 6 nguyên bào sợi và các yếu tố mạch. Hiện tượng được biết đến là sự tăng trưởng mạnh của nguyên bào sợi và trở thành những dòng tế bào hữu dụng ví dụ như W138 – nguyên bào sợi của phôi phổi người, BHK21 – nguyên bào sợi của thận chuột đồng con và có lẽ nổi bật hơn hết là tế bào L – nguyên bào sợi dưới dạng da được xử lý với methylcholanthrene. Đó là một trong những thách thức chủ yếu của lĩnh vực nuôi cấy mô từ khi lĩnh vực này mới được khởi đầu: làm cách nào để ngăn cản sự tăng trưởng quá mức của những tế bào yếu hoặc sự tăng trưởng quá chậm của những tế bào như tế bào nhu mô gan hoặc những tế bào biểu bì hóa sừng. Nguyên nhân là do điều kiện môi trường không phù hợp và vấn đề đáng chú ý hiện nay là xây dựng được môi trường và chọn lọc được cơ chất thích hợp để có thể duy trì được nhiều dòng tế bào chuyên biệt. 3.4 Sự phát triển của những dòng tế bào liên tục Hầu hết các dòng tế bào đều có thể sinh sản theo một kiểu không đổi trong một số thế hệ giới hạn, ngoài ra chúng có thể chết hoặc chuyển thành dòng tế bào liên tục (continuous cell line). Đó là một số dòng tế bào có khả năng thích ưng với môi trường nuôi cấy, giữa được khả năng phân chia tốt và có thể cấy chuyền vĩnh viễn. Khả năng dòng tế bào tăng trưởng liên tục có lẽ phản ánh sự thay đổi kiểu di truyền cho phép sự chọn lọc xảy ra sau đó. Nguyên bào sợi của người có tính ưu thế, có số lượng bội thể không bị thay đổi trong suốt thời gian sống của chúng và không tạo thành dòng tế bào liên tục, trong khi đó các nguyên bào sợi của chuột và các tế bào được tách ra từ các khối u của người và động vật thường bị thay đồi số lượng bội thể trong quá trình nuôi cấy và trở thành dòng tế bào liên tục với tần số cao. Những biến đổi trong quá trình nuôi cấy làm tăng sự biến đổi dòng tế bào thành dòng tế bào liên tục được gọi là “sự biến đổi in vitro” và có thể tự xảy ra hoặc do sự cảm ứng của hóa chất và virus. Các dòng tế bào liên tục thường có số lượng bội thể thay đổi và số bội thể ở giữa mức nhị bội và tứ bội. Cũng chưa rõ ràng hoặc những tế bào có khả năng trở thành các dòng tế bào liên tục hiện diện sẵn trong mô nuôi cấy với số lượng rất nhỏ hoặc sau đó những tế bào này được tạo ra do sự biến đổi của một hay nhiều tế bào. Lý do thứ hai có khả năng xảy ra cao hơn, do các dòng tế bào liên tục thường xuất hiện rất trễ trong quá trình nuôi cấy, sau giai đoạn tăng trưởng mạnh của các tế bào có trước. Tuy nhiên, khả năng còn lại có thể là do có một quần thể tế bào thứ cấp có khuynh hướng biến đổi không giống với các tế bào còn lại. Thuật ngữ “biến đổi” (transformation) được sử dụng cho quá trình hình thành dòng tế bào liên tục bởi vì các tế bào nuôi cấy phải trải qua những sự biến đổi về hình thái và vận động. Sự hình thành dòng tế bào liên tục thường diễn ra cùng với sự gia tăng phát sinh các khối u. Một số dòng tế bào liên tục hình thành cùng những biến đổi theo các hướng không tốt như giảm nhu cầu về huyết thanh, giảm mật độ giới hạn của sự tăng trưởng, tăng trưởng trong môi trường bán lỏng, và bộ nhiễm sắc thể có số lượng bội thể biến đổi… Những thay đổi về hình thái và bản chất tương tự có thể quan sát thấy ở các tế bào biến đổi do sự cảm ứng của hóa chất hoặc virus. Nhiều tế bào bình thường không thể biến đổi thành dòng tế bào liên tục. Nguyên bào sợi của người có số lượng nhiễm sắc thể ổn định trong suốt đời sống cảu nó và khi gặp một biến đổi lớn nào đó thì sẽ ngừng phân chia, mặc dù vẫn có thể tiếp tục sống thêm 18 tháng. Tế bào thần kinh đệm của người và nguyên bào sợi của gà con cũng có đặc điểm tương tự Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 7 như vậy. Mặt khác, tế bào biểu bì sẽ từ từ tăng thêm thời gian sống nếu như kỹ thuật nuôi cấy được cải tiến và còn có thể tăng khả năng tăng trưởng liên tục. Điều này có lẽ liên quan đến khả năng tự đổi mới của mô in vitro. Việc nuôi cấy liên tục các nguyên bào bạch huyết cũng được tiến hành, mặc dù trong trường hợp này có thể sử dụng virus Epstein Barr để cảm ứng sự biến đổi. Có thể điều kiện mở đường cho sự phát triển của một dòng tế bào liên tục là sự thay đổi kiểu gen vốn có của tế bào, vì vậy không có gì ngạc nhiên khi kiểu gen trong dòng tế bào liên tục khôn ổn định. Bảng 2: Những ñặc tính của dòng tế bào giới hạn và dòng tế bào liên tục Dòng tế bào giới hạn Dòng tế bào liên tục Thuận lợi Kiểu gen và kiểu hình điển hình gần với loại in vivo. Thường có số bội thể ổn định. Tăng trưởng nhanh. Thời gian sống không bị hạn chế. Dễ nhân dòng. Có thể nhân lên trong dịch huyền phù. Tế bào chắc. Đòi hỏi môi trường đơn giản. Đòi hỏi lượng huyết thanh thấp. Bất lợi Thời gian sống bị hạn chế Tăng trưởng chậm. Hiệu quả bám trên cơ chất thấp. Kiểu gen không ổn định. Biến đổi. Thường là có số bội thể không bình thường. 3.5 Sự phản phân hóa Sự phản phân hóa bao hàm ý nghĩa là những tế bào đã phân hóa bị mất đi tính chuyên biệt in vitro, nhưng cũng chưa rõ là: • Có thể những tế bào chưa phân hóa (trong cùng một dòng với những tế bào đã phân hóa) tăng trưởng mạnh. • Hoặc do sự vắng mặt của các chất cảm ứng thích hợp (hormone, sự tương tác qua lại của tế bào hoặc chất gian bào) gây ra sự mất khả năng thích nghi. Trong thực tế, cả hai nguyên nhân cùng có thể xảy ra. Sự tăng sinh liên tục có thể do các tế bào chưa phân hóa không gặp được sự cảm ứng phù hợp của điều kiện môi trường để phân hóa. Có một sự khác biệt quan trọng giữa phản phân hóa, mất khả năng thích nghi và sự chọn lọc. • Sự phản phân hóa được cho là bản chất chuyên biệt của các tế bào đã phân hóa bị mất đi và không thể đảo ngược được, ví dụ như tế bào gan sẽ mất enzyme của nó (arginase, aminotransferase,…), không thể dự trữ glycogen hoặc tạo ra protein huyết thanh, và những đặc tính này không thể được cảm ứng trở lại một khi đã bị mất đi. • Sự mất khả năng thích nghi là sự tổng hợp các sản phẩm chuyên biệt hoặc một chức năng chuyên biệt dưới sự điều hòa của những hormone (hormone: tương tác giữa tế bào với tế bào, tương tác giữa tế bào và chất gian bào,…) có thể được tái cảm ứng khi điều kiện nuôi cấy thích hợp; ví dụ như cảm ứng enzyme tyrosine aminotransferase trong gan chuột bình thường đòi hỏi phải có hormone (insulin, hydrocortisone) và sự Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 8 tương tác chính xác của các chất cơ bản, khi điều kiện nuôi cấy thích hợp các chức năng của tế bào đã phân hóa có thể được biểu hiện ở một số dòng tế bào khác. • Sự phản phân hóa là sự mất đi chức năng chuyên biệt được xem như là một sự giải thích không hoàn toàn chính xác. Để điều kiện cảm ứng chính xác có hiệu lực, cần phải có được những tế bào thích hợp. Trong những thí nghiệm nuôi cấy tế bào gan trước đây, sự biểu hiện các đặc tính của tế bào gan không xảy ra, phần nào là do sự tăng trưởng quá mức của các nguyên bào sợi của mô liên kết hoặc nội mô của mạch máu hoặc các thể xoang. Bằng cách sử dụng kỹ thuật tách tế bào và điều kiện nuôi cấy thích hợp các tế bào gan có thể được chọn lọc một cách phù hợp hơn. Tương tự, các tế bào biểu bì có thể tăng trưởng nhờ sử dụng phương pháp lớp nuôi hoặc môi trường chọn lọc phù hợp. 4. Nuôi cấy tế bào ñộng vật 4.1 ðiều kiện nuôi cấy 4.1.1 Thiết bị và dụng cụ nuôi cấy 4.1.1.1 Thiết bị Tủ ấm thường, tủ ấm CO 2 . Tủ lạnh và tủ đông. Tủ sất đối lưu. Bể điều nhiệt. Kính hiển vi thường. Kính hiển vi soi ngược. Ống hút tự động, ống hút Pateur. Máy khuấy từ. Máy đo mật độ quang. Bơm chân không. Máy ly tâm thường, máy ly tâm lạnh. Nồi hấp vô trùng môi trường nuôi cấy. pH kế. Cân phân tích Máy cất nước hai lần Tủ cấy vô trùng 4.1.1.2 Dụng cụ Hộp plastic nuôi cấy loại giếng Bình nuôi cấy Đĩa petri plastic Hộp plastic nuôi cấy hình chữ nhật Bình nuôi cấy bằng thủy tinh Ống nghiệm có nắp đậy Ống làm lạnh + hộp đựng. Dụng cụ thủy tinh để pha môi trường. Màng lọc đã khử trùng. 4.1.2 Môi trường nuôi cấy Từ khi khám phá ra các tế bào từ các mô có thể nuôi cấy in vitro, các nhà khoa học cố gắng tìm ra những môi trường xác định từ môi trường cơ bản đơn giản của Eagle (1955; 1959) để duy trì sự tăng trưởng liên tục của tế bào. Đó là những môi trường có thành phần phức tạp hơn như môi trường 199 của Morgan, môi trường CMRL 1066 của Parker. Mặc dù hầu hết các môi trường hiện nay đã được xác định thành phần nhưng chúng vẫn cần phải bổ sung 5 – 20% huyết thanh. Người ta muốn không lệ thuộc vào huyết thanh trong quá trình nuôi cấy tế bào nên đã xây dựng những môi trường phức tạp hơn để thay thế cho huyết thanh như trong môi trường NCTC 109, Waymouth’s MB, Ham’s F12, Birch & Pirt, MCDB. Một phương pháp để tạo ra môi trường mới là bắt đầu từ một môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường Ham’s F12 hoặc môi trường 199 có bổ sung huyết thanh với Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 9 nồng độ cao (20%), cố gắng từ từ giảm nồng độ huyết thanh bằng cách tăng nồng độ các chất đã có trong môi trường và thêm vào những chất mới. Đây là một phương pháp khó, nhưng kết quả là tạo ra được những mội trường khác nhau để nuôi cấy tế bào cơ của người và các loại tế bào khác mà không cần huyết thanh hoặc chỉ cần đến huyết thanh với nồng độ thấp. Bảng 3: Môi trường cơ bản ñơn giản của Eagle’MEM (1956, 1959) Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Muối vô cơ Amino acid CaCl 2 200 L – arginine.HCl 126 KCl 400 L – cystine 24 MgSO 4 .7H 2 O 200 L – glutamine 292 NaCl 6800 L – histidine.HCl.H 2 O 42 NaHCO 3 2200 L – isoleucine 52 Na 2 HPO 4 .H 2 O 140 l – leucine 52 Vitamin L – lysine.HCl 73,1 D – panthothenate calcium 1 L – methionine 15 Choline chloride 1 L – phenylalanine 33 Acid folic 1 L – threonine 48 I – inositol 2 L – tryptophan 10 Nicotiamide 1 L – tyrosine 36 Pyridoxal.HCl 1 L – valine 47 Riboflavine 0,1 Các thành phần khác Thiamine.HCl 1 D – glucose 1000 Đỏ phenol 10 Bảng 3: Môi trường Waymouth’s MB17,50 752/1 Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Thành phần Nồng ñộ (mg/l) Muối vô cơ Amino acid CaCl 2 .2H 2 O 120 L – arginine.HCl 75 KCl 150 L – aspartic acid 60 KH 2 PO 4 80 L – cystein 61 MgCl 2 .6H 2 O 240 L – cystine 15 MgSO 4 .7H 2 O 200 L – glutamic acid 150 NaCl 6000 L – glutamine 350 NaHCO 3 2240 Glycine 50 Na 2 HPO 4 .7H 2 O 566 L – histidine 123 Vitamin L – isoleucine 25 L – ascorbic acid 17,5 L – leucine 50 Biotin 0,02 L – lysine.HCl 240 D – panthothenate calcium 1 L – methionine 50 Choline chloride 250 L – phenylalanine 50 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 10 Acid folic 0,4 L – proline 50 I – Inositol 1 L – threonine 75 Nicotiamide 1 L – tryptophan 40 Riboflavine 1 L – tyrosine 40 Thiamine.HCl 10 L – valine 65 Vitamin B12 0,2 Các thành phần khác Pyroxine.HCl 1 D – Glucose 5000 Đỏ phenol 10 Glutathione 15 Hypoxanthine 25 4.1.2.1 Các yếu tố vật lý tác ñộng ñến môi trường. a. pH: hầu hết các dòng tế bào tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4. Độ pH tối thích đối với mỗi dòng tế bào sẽ khác nhau. Một số dòng tế bào như nguyên bào sợi tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,4 – 7,7 và những dòng tế bào biến đổi sẽ tăng trưởng tốt nhất ở pH 7,2 – 7,4 (Eagle, 1973). Theo Eisinger và cộng sự (1979), tế bào biểu bì có thể sống ở pH 5,5. Sự thay đổi pH môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến sức sống và khả năng tăng sinh của tế bào. Đánh giá pH môi trường thông qua đỏ phenol thường mang tính chủ quan, do đó cần phải làm một thang chuẩn mới với muối cân bằng (Balanced Salt Solution – BBS) và đỏ phenol với nồng độ chính xác. b. ðệm: môi trường nuôi cấy cần phải có dung dịch đệm trong hai trường hợp: ♣ Khi mở đĩa nuôi cấy tế bào, CO 2 khí quyển sẽ làm tăng pH. ♣ Lượng CO 2 và acid lactic được sinh ra quá mức từ các dòng tế bào biến đổi (khi mật độ tế bào cao) làm pH môi trường giảm. Dung dịch đệm bổ sung vào môi trường giúp ổn định độ pH trong những trường hợp sau: ♠ Một số dòng tế bào đòi hỏi phải có CO 2 dạng khí, đặc biệt là khi mật độ tế bào thấp. Dung dịch đệm ngăn cản sự thất thoát CO 2 và từ môi trường nuôi cấy. ♠ Khi không đậy chặt nắp bình nuôi cấy (nắp bình được cuốn bằng giấy nhôm) hoặc sử dụng những bình nuôi cấy mà CO 2 có thể xuyên qua nắp bình vào môi trường nuôi cấy thì dung dịch đệm sẽ thúc đẩy sự giải phóng CO 2 . ♠ Dung dịch đệm thường được sử dụng hơn các dung dịch đệm khác, mặc dù khả năng đệm tương đối yếu ở pH sinh lý, bởi vì nó ít độc với mẫu nuôi cấy, giá thành thấp và thành phần khoáng thích hợp với thành phần môi trường. HEPES (Hydroxy – Ethyl – Piperazine – Ethane – Sulfonic Acid) có tác dụng đệm mạnh hơn ở pH 7,2 – 7,6 và nó thường được sử dụng vớ nồng độ 10 hoặc 20mM. Khi HEPES được sử dụng với CO 2 ngoại sinh thì nồng độ của HEPES phải tăng lên gấp 2 lần so với đệm thông thường. c. Áp suất thẩm thấu [...]... lympho, và tách các t bào ñang ñư c nuôi c y d a vào các pha c a chu trình t bào ho c s khác nhau v kích thư c trong m t qu n th g m nhi u lo i t bào M t trong nh ng ng d ng thư ng ñư c ti n hành là tách m t lo i t bào t m t qu n th các t bào ñư c phóng thích ra kh i mô nh tác d ng c a enzyme 20 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths Nguyễn Thị Hiền PH N II: CÔNG NGH NUÔI C Y TH T T BÀO (IN VITRO –... t c t nhau trong môi trư ng mô t bào Cơ th t Phân l p t bào Nhân s lư ng Huy t thanh Nuôi c y Khung, ch t dinh dư ng O2, ch t mang Tách khung Khung Thu nh n s n ph m Th t nuôi c y Hình 1: Sơ ñ kh i quy trình nuôi c y th t 21 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths Nguyễn Thị Hiền Hình 2: bi u ñ quy trình nuôi c y th t liên t c 1.2 T bào và phương pháp phân l p t bào 1.2.1 S hình thành mô cơ t nhiên.. .Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths Nguyễn Thị Hiền H u h t các t bào nuôi c y ñ u có th ch u ñư c biên ñ áp su t th m th u tương ñ i r ng Áp su t th m th u thích h p cho s tăng trư ng c a t bào nh ng loài ñ ng v t khác nhau s khác nhau Trong trư ng h p nuôi c y t bào trong môi trư ng như c trương thì nên nuôi trong ñĩa petri ñ cho có s thoát b t hơi nư c trong quá trình nuôi Vi c... cũng như s lư ng c a t bào myosatellite cũng gi m ñi nhanh chóng 22 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths Nguyễn Thị Hiền Hình 3: S hình thành s i cơ t nhiên 1.2.2 Nh ng lo i t bào có th s d ng ñ nuôi c y 1.2.2.1 T bào ñã ñư c ñ xu t và nghiên c u Van Eelen et at, 1999 và Edelman el at, 2005 ñã nghiên c u h th ng nuôi c y th t t t bào phôi (embryonic stem cell (ES)) và t t bào myosatellite Theo... ng t bào có kh năng nhân ñôi mãi mãi hay t bào b t t Làm cho t bào có kh năng nhân ñôi mãi mãi hay b t t H u h t các lo i t bào c n áp d ng phương pháp th nh t, ch có t bào phôi là rơi vào trư ng h p th hai S d ng phương pháp th ba v n còn nhi u tranh cãi b i vì làm cho t bào b t t hay nhân ñôi mãi mãi thì c n ph i thay ñ i c u trúc gene C n có nhi u nghiên 24 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD:... chia c a t bào v a m i tách kh i mô r t th p trong môi trư ng nuôi c y sơ kh i 16 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào • • GVHD: Ths Nguyễn Thị Hiền Môi trư ng giàu ch t dinh dư ng như F10, F12 c a Ham thư ng ñư c s d ng hơn là môi trư ng cơ b n như môi trư ng EME c a Eagle, và n u t bào có nhu c u v huy t thanh thì huy t thanh phôi bò c n cho s s ng c a t bào hơn là huy t thanh ng a Các c m t bào phôi... ñi m và như c ñi m nh t ñ nh vì t 23 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths Nguyễn Thị Hiền bào myosatellite t ngu n khác nhau thì khác nhau v kh năng sinh s n, kh năng ñi u hòa v i s thay ñ i c a ñi u ki n sinh trư ng khác nhau Wilschu et at, 2008 ñã ch ra r ng t bào satellite t cơ l n có kh năng k t h p và phát tri n cùng v i t bào t y xương, t bào s n và t bào m ; làm cơ s cho s c i ti n môi... ch như s lư ng t bào trong qu n th c n tách mà y u t này có th có nh hư ng r t l n ñ n phương pháp tách t bào nh s phát huỳnh quang, ho c y u t th i gian trong phương pháp tách t bào nh s k t t a theo tr ng lư ng t bào cũng như các v n ñ có liên quan ñ n stress th m th u trong môi trư ng ly tâm 5.2 S phát tri n phương pháp tách t bào nh máy ly tâm 18 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths Nguyễn... thi t ph i có ñ y ñ các khoáng ch t S ch n l a dung d ch mu i cân b ng ph thu c vào: ♥ Áp l c CO2 ♥ M c ñích s d ng: tách các t bào t mô ho c tr i các t bào thành l p ñơn 11 Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths Nguyễn Thị Hiền ♥ S d ng trong các huy n phù t bào có các t bào ch có th tăng trư ng khi bám vào cơ ch t Hi n nay, HEPES là dung d ch có hi u qu nh t pH 7,2 – 7,8 và TRICINE có hi u qu pH... tư ng t bào bi n ñ i là vi c t bào cu i giai ño n hình thành t bào ña nhân bi n ñ i thành v t bào ban ñ u nhưng t bào m i này có có th chuy n thành m t lo i t bào khác Trong cơ th ñ ng v t có xương s ng nói chung có nh ng lo i t bào bi n ñ i sau: t bào phôi, t bào satellite và t bào t y xương Tuy nhiên, Matsumoto et al., 2007 ñã ti n hành thí nghi m trên t bào phân l p t mô m và th y r ng t bào m khi . Công nghệ nuôi cấy thịt từ tế bào GVHD: Ths. Nguyễn Thị Hiền 1 PHẦN I: CƠ SỞ LÝ THUYẾT CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY TẾ BÀO. tại hai loại tế bào: Loại tế bào tự do: tế bào máu, tế bào sinh dục. Loại tế bào ở dạng liên kết trong các mô. Tế bào máu là loại tế bào hoàn toàn