THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TỦY XƯƠNG LÊN MÀNG

THIẾT KẾ VÀ CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TỦY XƯƠNG LÊN MÀNG

Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 1 1.1. Công nghệ vật liệu trong y sinh học: [1], [7], [8], [21], [29] Hình 1: Tai nhân tạo, một trong những thành tựu của công nghệ vật liệu Công nghệ vật liệu là một trong những lónh vực tiềm năng vì các cơ quan cấy ghép lấy từ cơ thể người cho thường được cung cấp rất hạn chế. Mỗi năm có khoảng 19.000 ca cấy ghép được thực hiện tại Mỹ và khoảng 56.000 bệnh nhân tại đất nước này cần được ghép cơ quan, thậm chí có trường hợp một người phải chờ đợi tới 13 năm. Các ca mổ này thường rất khó khăn và tốn kém, đòi hỏi bệnh nhân phải trải qua một chế độ nghiêm ngặt vì hệ miễn dòch bò suy giảm. Đây là thử thách lớn trong điều trò bằng phẫu thuật cấy ghép. Cho đến nay, một số sản phẩm vật liệu được đưa ra thò trường, vật liệu thay thế da, xương và sụn. Vật liệu sinh học trong nuôi cấy mô được sử dụng để hỗ trợ, hướng dẫn các tế bào trong các cấu trúc 2 và 3 chiều chuyên biệt. Chúng được biết đến với thuật ngữ ECM (Extracellular matrix), ECM có cấu trúc khung bao gồm các proteins, carbohydrates và các phân tử tín hiệu. Giàn giáo lí tưởng làm bằng các vật liệu sinh học mang đến cho các tế bào những tín hiệu cần thiết cho sự phát triển, biệt hóa và tương tác với nhau tạo nên các cấu trúc mong muốn. Bên cạnh đó, chúng còn có khả năng phân hủy chậm tạo thành các hợp chất không độc hại trong khi mô mới được hình thành và xác nhập Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 2 với mô của người bệnh. Hơn thế nữa, vật liệu sinh học cần phải an toàn, dễ sử dụng với giá cả hợp lí. Những vật liệu sinh học đầu tiên được sử dụng trong giải phẫu thường được nghiên cứu sao cho không độc, không gây đáp ứng miễn dòch và tự phân hủy. Ngày nay, các nghiên cứu thường tập trung vào sự phát triển của vật liệu sinh học với những đặc tính mới như: khả năng phân hủy có thể điều chỉnh, khả năng hỗ trợ cho tương tác tế bào. Trong đó, quan tâm nhất là sự sát nhập của các phân tử tín hiệu sinh học với vật liệu sinh học. Hinh 2: Hình ảnh của một khuôn tái sinh da điển hình có cấu trúc lỗ xốp dưới kính hiển vi điện tử quét. Cấu trúc này cho phép tế bào len lỏi bên trong. Vật liệu sinh học có thể được làm bằng các chất tổng hợp (lactide, glycolide, ceramics), dạng tự nhiên (collagen, các polysaccharide tự nhiên) hay những vật liệu bán tổng hợp (poly-4-hydroxybutyrate, axit polylactic và polyglycolic hay là sự kết hợp của các thành phần trên để tạo ra các loại vật liệu dùng trong thử nghiệm lâm sàng và trong nghiên cứu. Một số thành tựu điển hình của công nghệ vật liệu có thể kể đến như: Các polymer tổng hợp có khả năng phân hủy được (VD: Chất dẻo chòu nhiệt). Sự tạo thành của chúng có thể biến đổi bỡi nhiệt độ (từ nhiệt độ phòng đến nhiệt độ của cơ thể) [7]. Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 3 ¾ Những vật liệu hỗn hợp làm từ polylactide-co-glycolide hứa hẹn nhiều tiềm năng cho vật liệu thay thế xương [7]. ¾ Các hydrogel tổng hợp được biến đổi ở một vài đoạn peptide giúp cho các tế bào có thể đònh cư vào gel. Bởi tính thấm tốt cho chất dinh dưỡng và khí, tính tương hợp sinh học và một số đặc điểm khác. Hydrogel là vật liệu tiềm năng cho các ứng dụng về công nghệ mô. ¾ Sự quang polymer hóa có thể tạo ra các khung có tính linh động cao. ¾ Một số polymer như poly-4-hydroxybutyrate với tính linh động cao và khả năng phân hủy sinh học được kiểm soát đã mở ra những khả năng mới cho việc thiết kế các vật liệu sinh học. ¾ Các polymer kết hợp với protein được sản xuất dựa trên sự phát triển của kỹ thuật gen và công nghệ vật liệu có khả năng phân hủy sinh học và tính tương hợp sinh học cao. Sự kết hợp của các amino acid nhân tạo có thể mang đến cho vật liệu những đặc tính rõ ràng. 1.2. Vật liệu sinh học thay thế da: 1.2.1. Giới thiệu: [1], [2], [7], [23], [24] Da người là cơ quan phức tạp với nhiều chức năng: ¾ Điều nhiệt. ¾ Bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi sinh từ bên ngoài. ¾ Giữ ẩm. ¾ Bảo vệ cơ học và làm lành vết thương. Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 4 Trong suốt hơn 30 năm qua, đã có nhiều nỗ lực để phát triển các sản phẩm giống như da cho một vài trường hợp nguy kòch. Những sản phẩm này không những đã đáp ứng được những yêu cầu nêu trên mà còn mang nhiều đặc điểm có lợi khác như: ¾ Tạo những đáp ứng tăng sinh từ vết thương mà không gây ra viêm hay loại thải. ¾ Bền và đàn hồi để có chức năng bình thường và tạo vẻ bên ngoài. ¾ Có sắc tố giống với da thật. ¾ Thích hợp cho những ca nguy cấp và dễ dàng sử dụng. Da nhân tạo có thể được ứng dụng trong điều trò bỏng, loét, giải phẫu thẩm mó, khoảng 150.000 bệnh nhân hằng năm ở miền tây Châu u cần được điều trò bằng da nhân tạo, nhưng con số này vẫn ít hơn số người bò loét. Đây là một tổn thương không thể lành trong 6 tuần và duy trì trong nhiều năm, gây tốn kém trong điều trò. Một số bệnh gây ra loét như tiểu đường hay bệnh tónh mạch, số người mắc bệnh tăng lên theo tuổi và do lối sống. Riêng ở Đức, có khoảng 2-3 triệu người bò loét, chi phí điều trò lên đến hơn một tỉ euro. Những mảnh da tổng hợp thường được sử dụng phổ biến trong điều trò những tổn thương nêu trên. So với các kó thuật truyền thống như sử dụng da người chết là vật thay thế, mảnh ghép tổng hợp có thuận lợi lớn là không phụ thuộc vào nguồn da của người cho. Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 5 Hình 3: Ảnh minh họa sự gắn kết của tế bào lên vật liệu Có hai thành phần chính của da nhân tạo: khuôn, có thể làm bằng collagen, axit hyaluronic, những polymer phân hủy sinh học bán tổng hợp khác và những tế bào da khác nhau như keratin, fibroblast, melanin . Một số sản phẩm đầu tiên trên thò trường để điều trò các vết bỏng sâu là: Epicel (Enzyme Biosurgery, USA), Integra (Integra life sciences, USA), và Transcyte (Smith & Nephew, UK). Tuy nhiên ngày nay đã có nhiều các sản phẩm dùng để điều trò loét như: Apligraf (Organogenesis, USA), Dermagraft (Advanced Tissue Sciences)… Hình 4: Sự phối hợp của vật liệu, tế bào và các chất tăng trưởng trong việc tạo thành cơ quan nhân tạo. Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 6 Các sản phẩm da nhân tạo cũng được sử dụng trong các thử nghiệm invitro như thử nghiệm độc tố, dược lí học và thẩm mó… 1.2.2. Tiêu chuẩn cho vật liệu phủ vết thương: [1] 1.2.2.1. Tính thấm ướt nền vết thương và sự bám dính: ¾ Làm ướt bề mặt vết thương. ¾ Thích ứng với bề mặt vết thương. ¾ Bám dính hóa học với nền vết thương. Tránh sự tăng sinh của lớp hạt. ¾ Bám dính ở tất cả các vùng. Nếu không sẽ hình thành các túi không khí nhỏ giúp cho vi khuẩn sinh sôi. ¾ Năng lượng bề mặt của mảnh ghép và nền vết thương nhỏ hơn giao diện của không khí và nền vết thương. Nền vết thương được làm ướt, túi không khí được thải ra. 1.2.2.2. Sự tạo lỗ của mảnh ghép: Mảnh ghép phải thấm được và ẩm. Nhưng độ ẩm lớn sẽ phá hủy giao diện của vết thương và mảnh ghép. Độ ẩm nhỏ thì dòch tiết bên dưới mảnh ghép sẽ nâng nó lên khỏi tấm nền vết thương. Lượng nước tối ưu: 5 mg/cm 2 /h. Có khả năng tạo ra các lỗ giúp cho tế bào fibroblast phân chia và di trú bên trong vật liệu. Bởi vì các tế bào biểu bì, trung mô trong vết thương có đường kính 10 µm nên các lỗ phù hợp với trật tự này sẽ tạo thuận lợi cho fibroblast đi vào bên trong vật ghép. Sự di trú của tế bào phụ thuộc vào: ¾ Kích thước lỗ Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 7 ¾ Bề dày mảnh ghép Lỗ có đường kính nhỏ hơn 10 µm làm cho các tế bào fibroblast, biểu bì không di chuyển xuyên qua lỗ, ta phải phân hủy khuôn giúp tế bào đi vào bên trong vật liệu. Vật liệu nếu dày sẽ làm chất dinh dưỡng từ nền vết thương đến mảnh ghép bò hạn chế. Mảnh ghép mỏng dễ đứt gãy còn mảnh ghép dày sẽ cứng và không dính với vết thương. Khoảng cách giới hạn để duy trì chất dinh dưỡng tới tế bào đang di trú được qui đònh bằng biểu thức không thứ nguyên bắt nguồn từ công thức Thiele và được biến đổi bởi Wagner và Weisz: R* L 2 S= D* C 0 Trong đó: R : tốc độ sử dụng chất dinh dưỡng tới hạn của tế bào. L : khoảng cách hỗ trợ chất dinh dưỡng khuyếch tán. D : sự khuyếch tán chất dinh dưỡng qua màng được hydrate hoá. C 0 : nồng độ chất dinh dưỡng tại nền vết thương. S : số không thứ nguyên. S=1 thì tử và mẫu cân bằng, sự sinh trûng mao quản xảy ra, cung cấp cho tế bào cơ chất và oxi. 1.2.2.3. Độ bền của vật ghép: Vật ghép có độ bền cao giúp cho thao tác không bò rách, phủ vết thương trong toàn bộ chu trình lành hóa. Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 8 1.2.2.4. Tốc độ phân hủy sinh học: Quá trình phân hủy sinh học gây đáp ứng viêm tối thiểu đối với vật chủ. Ta cần tính toán, cân bằng tốc độ phân hủy vật liệu với thời gian cần cho tái sinh tế bào. Nếu mảnh ghép phân hủy nhanh thì vết thương không được che phủ hiệu quả. Nếu mảnh ghép phân hủy chậm thì sẽ hình thành sẹo và phối hợp vật liệu vào trong vết thương. 1.2.2.5. Tính kháng nguyên: Vật liệu thay thế da có khả năng bò loại ra và làm viêm cục bộ nếu có tính kháng nguyên. 1.2.2.6. Cấu trúc vó mô: Nếu không có giàn giáo (scaffold), nguyên bào sợi sẽ xắp xếp collagen ngẫu nhiên và hình thành sẹo. 1.2.3. Phân loại các loại màng sinh học dang dược sử dụng hiện nay: [1] 1.2.3.1. Vật ghép tự nhiên: Chủ yếu là autograft (da tự thân) và allograft (da từ người khác). Tác dụng của autograft và allograft: ¾ Giảm số lượng vi khuẩn trên bề mặt được làm ướt của vết thương. ¾ Giảm sự mất dòch và protein. ¾ Giảm đau. ¾ Hạn chế sự co cứng của vết thương. Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 9 ¾ Tăng sự tạo mạch mới. Hạn chế: ¾ Thiếu autograft ở bệnh nhân phỏng nặng. ¾ Khó khăn trong dự trữ allograft, có tính kháng nguyên. Xenograft từ heo, là vật liệu che phủ tạm thời, đòi hỏi tiệt trùng cao, bệnh nhân bỏng phải được xóa bỏ miễn dòch, mảnh ghép cuối cùng bò đẩy ra và thay thế bằng autograft. Màng ối: màng phủ vết thương tự nhiên tạm thời nhưng tăng sự tạo hạt của nền vết thương. Do đó mảnh ghép của da sống lâu hơn nhưng cũng có nhiều sẹo hơn. 1.2.3.2. Vật ghép tổng hợp: Mảnh ghép đơn lớp: thường sử dụng collagen do: ¾ Nguồn chiết tách lớn. ¾ Liên kết chéo của collagen làm tăng độ bền và sức căng nhưng cũng có khuynh hướng làm cho sợi cứng & dòn. ¾ Bám dính tự nhiên với vết thương lúc ban đầu do kết hợp với fibrin. ¾ Collagenase xuất hiện trong nền vết thương & vi khuẩn từ nền vết thương có thể làm tuột miếng xốp collagen này. Mảnh ghép đa lớp: Màng 2 lớp: bên trong là collagen & chondroitin-6-sulfate và lớp bên ngoài là silastic. Có tác dụng ngăn chặn sự co vết thương với kích thước lỗ tối ưu là 50 µm. Lớp silastic dày 0,1 mm, có tác dụng ngăn chặn vi khuẩn trong khi vẫn duy trì dòng nước thích hợp qua màng, cung cấp độ cứng cần thiết để Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 10 khâu mảnh ghép vào đúng chỗ, ngăn chặn sự di chuyển mảnh ghép trong quá trình lành hóa vết thương. Vật liệu trên bám dính với vết thương trong vài phút và tạo mạch mới trong 3 - 5 ngày. Hình 5: Màng 2 lớp Màng giai đoạn 2: các tế bào đáy của da được tách, nuôi cấy và được đưa vào trong khuôn bằng cách tiêm trực tiếp hay sử dụng lực li tâm. Tế bào biểu bì nhanh chóng tăng sinh. Sự thay thế da chức năng đạt được ở heo sau 4 tuần, tốc độ nhiễm trùng thấp, bề mặt đồng nhất, mềm dẻo và trơn láng tương tự da bình thường. 1.2.3.3. Các đặc tính lí tưởng của vật liệu thay thế da: ¾ Bám dính nhanh, bền lên bề mặt vết thương. ¾ Cấu trúc cho phép sự cố đònh, di chuyển, tăng sinh, tăng trưởng của các tế bào mô mới. ¾ Không thấm các vi khuẩn ngoại sinh. ¾ Giảm sự mất nước, mất điện giải, protein. ¾ Không tạo kháng nguyên, không gây dò ứng. ¾ Có tính linh động, độ co giãn cao nhưng vẫn bảo vệ vết thương. ¾ Không gây độc. [...]... của trung bì Nguyên bào của trung bì có thể biệt hóa thành nguyên bào cơ và những tế bào nền của tủy xương Trong điều kiện in vivo, sự biệt hóa của những tế bào nền thành tế bào xương đều khá phức tạp Những tế bào mỡ của tủy xương và những tế bào nền làm giá đỡ cho tủy đều có nguồn gốc từ tế bào nền của tủy xương và có thể được xem như những kiểu hình có thể hoán đổi được Những tế bào mỡ không phát triển... có đại diện cho một quần thể tế bào mầm của tủy xương ở cá thể trưởng thành thật hay không vẫn còn là điều không chắc chắn Do đó, tủy xương dường như có 24 Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng chứa 3 quần thể tế bào mầm là: HSC, MSC và có thể là cả nguyên bào nội mạc 1.4.1 Tế bào mầm của mô tạo máu (HSC: Hematopoietic Stem Cell): Tế bào máu là một trong những tế bào có khoảng thời gian sống... quần thể bạch cầu hạt và đại thực bào (GM-CSF-Granulocytemacrophage colony-stimulating factor) và interleukin-3 (IL-3) Những mối quan hệ giữa các tế bào với những phân tử đính vào chất nền ngoại bào của 26 Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng tủy xương cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tăng sinh và biệt hóa mầm tạo máu của tủy xương 1.4.2 Tế bào mầm trung mô của tủy xương (MSC: Messenchymal... nước đá, kích thước của lỗ giảm khi nhiệt độ đông giảm 23 Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 1.4 Tế bào mầm của tủy xương: [6], [33] Hình 17: Tế bào mầm của tủy xương quan sát dưới kính hiển vi Một quần thể tế bào trong tủy xương chòu trách nhiệm trong việc hình thành tất cả các dạng tế bào máu khác nhau trong cơ thể là những tế bào mầm của mô tạo máu (HSC: hepatopoietic stem cell) HSC... Những tế bào hình thành xương là những nguyên cốt bào nhưng mối quan hệ của nó với chất nền của tủy xương thì chưa được biết đến rõ ràng Những lá xương mới nằm bên trong của xương sát với tủy cho nên có thể suy ra một cách hợp lí rằng chúng phát triển từ những tế bào nền của tủy xương Nhưng ở bề mặt ngoài của 28 Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng xương cũng có sự quay vòng như cách mà xương. .. một quần thể tế bào khác trong tủy xương là quần thể tế bào nền của tủy xương (Bone marrow stromal cell) Những tế bào nền trong tủy xương là một hỗn hợp các quần thể tế bào có thể sản sinh ra xương, sụn, mỡ, mô liên kết dạng sợi và hệ thống mạng lưới hỗ trợ cho sự hình thành những tế bào máu Những tế bào mầm trung mô của tủy xương (MSC: Mesenchymal stem cell) cũng có thể tạo ra những mô này và tạo thành... Messenchymal Stem Cell): Những tế bào nền của tủy xương đóng vai trò quan trọng trong sự biệt hóa các tế bào máu trưởng thành có nguồn gốc từ những tế bào mầm tạo máu của tủy xương Nhưng những tế bào nền này cũng có những chức năng quan trọng khác Để cung cấp môi trường vật lý cho sự biệt hóa của những HSC, những tế bào nền của tủy xương sản sinh ra sụn, xương và mỡ Những tế bào nền của tủy xương có nhiều đặc... loại tế bào này rất dễ phân lập trong điều kiện in vitro Khi tủy xương được tách rời ra và hỗn hợp tế bào được trải ra trên bề mặt nuôi cấy với mật độ thấp thì những tế bào nền của tủy xương bám dính vào bề mặt đóa nuôi cấy trong khi những HSC thì không Trong những điều kiện in vitro đặc biệt, các tế bào nền của tủy xương hình thành quần thể tế bào có dạng giống với nguyên bào sợi từ một tế bào đơn và. .. (PLLGA) và bổ sung các tác nhân tạo xương Ở đây, việc tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy tế bào xương là yếu tố tiên quyết cho sự thành công Sau đó, giải quyết các vấn đề như mật độ tế bào tốt nhất để cố đònh, ảnh hưởng của 30 Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng môi trường tại thời điểm cố đònh tế bào, ảnh hưởng của các tác nhân mô tạo xương, những hạn chế của vật liệu khuôn ngoại bào khi... bào dính sống sót giảm đi tương ứng với sự tăng dần kích thước lỗ 32 Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 2.1 Mục tiêu nghiên cứu: 2.1.1 Thiết kế màng từ các thành phần gelatin, chitosan, axit hyaluronic, chất khâu mạch EDC 2.1.2 Phân lập và nuôi cấy tế bào mầm của tủy xương, khảo sát khả năng cố đònh các tế bào trên lên màng 2.2 Đối tượng nghiên cứu: Chuột nhắt trắng Mus musculus var.Albino . thuộc vào nguồn da của người cho. Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 5 Hình 3: Ảnh minh họa sự gắn kết của tế bào lên. fibroblast đi vào bên trong vật ghép. Sự di trú của tế bào phụ thuộc vào: ¾ Kích thước lỗ Thiết kế và cố đònh tế bào tủy xương lêøn màng 7 ¾