Tiểu luận sinh học NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

A. ĐẶT VẤN ĐỀ: Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật. Nhờ đó mà người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng có năng suất cao, chống chịu với sâu bệnh, mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền ... Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao. Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật. Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao, do việc phải cấy chuyển, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm. Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới có thể tự động hóa. Năm 1981, Taykayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có thể sục khí chủ động từ ngoài vào. Trong đó có ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreacter, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào. Nuôi cấy Bioreacter là một phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với só lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, chồi...), và sản xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp bằng sử dụng tế bào thực vật. B. NỘI

Thành viên nhóm 7:

A ĐẶT VẤN ĐỀ:

Công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một trong những công nghệ quan trọng của Công nghệ Sinh học, nó là nền tảng để nghiên cứu và áp dụng các công nghệ khác trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Nhờ đó mà người ta có thể tạo ra được những giống cây trồng có năng suất cao, chống chịu với sâu bệnh,

mở ra khả năng lai khác loài và làm tăng nhanh tính đa dạng di truyền Hiện nay, người ta đã bắt đầu ứng dụng khả năng nuôi cấy tế bào thực vật tách rời ở qui mô công nghiệp để thu nhận các sản phẩm, các hoạt chất sinh học có giá trị kinh tế cao

Kỹ thuật nuôi cấy mô ra đời đã mở ra một cuộc cách mạng trong nhân giống thực vật Nhưng với phương pháp truyền thống nuôi cấy trên môi trường thạch thì khó đáp ứng được nhu cầu giống cung cấp trên thị trường, giá thành lại cao, do việc phải cấy chuyển, tách mẫu bên trong tủ cấy hầu như đều thực hiện bằng tay, tốn nhiều lao động lại dễ bị nhiễm

Chính vì vậy cần phải có một hệ thống nuôi cấy mới có thể tự động hóa Năm 1981, Taykayama và Misawa đã đề xuất một hệ thống nuôi cấy lỏng có thể sục khí chủ động từ ngoài vào Trong đó có ba loại là nuôi cấy lỏng tĩnh, nuôi cấy lỏng lắc và nuôi cấy Bioreacter, tất cả đều được dùng để nuôi cấy huyền phù tế bào Nuôi cấy Bioreacter là một phương pháp đầy hứa hẹn cho nhân giống với só lượng lớn tế bào, phôi soma hay các đơn vị phát sinh cơ quan (củ, chồi ), và sản xuất các hoạt chất trao đổi thứ cấp bằng sử dụng tế bào thực vật

B NỘI DUNG

I Giới thiệu chung:

1 Khái niệm chung:

Nuôi cấy huyền phù tế bào (cell suspension cultures) là phương thức nuôi tế bào đơn (single cell) hay cụm nhiều tế bào (cell aggregate) ở trạng thái lơ lửng trong môi trường lỏng Dịch huyền phù được tạo ra do sự nuôi cấy một mảnh mô sẹo không có khả năng biệt hóa, trong môi trường lỏng và được chuyển động trong suốt thời gian nuôi cấy

Các tế bào tách ra khỏi mô sẹo và phân tán trong môi trường lỏng Ở đó chúng sinh trưởng,phân chia và có thể hình thành những cụm tế bào kết tập Dung dịch nuôi cấy tế bào chuyển thành huyền phù tế bào Điều kiện quan trọng của nuôi cấy huyền phù tế là môi trường nuôi cấy được khuấy lắc liên tục với tốc độ

100-150 vòng/phút

Các mô sẹo nuôi cấy trên môi trường chứa 2.4D là nguồn nguyên liệu thích hợp để tạo huyền phù tế bào và để nhận được 100ml huyền phù tế bào thường cần 2-3g mô callus tươi

Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp các tế bào đơn, các cụm

tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết

2 Đặc trưng cuả tế bào nuôi cấy huyền phù:

- Nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng mô sẹo khá lớn, xấp xỉ 2-3g/100ml dung dich môi trường (helgeson, 1979) Theo King và street (1977), không có một quy trình chuẩn nào cho nuôi cấy huyền phù tế bào

- Sau một thời gian, dịch huyền phù là một hỗn hợp tế bào đơn, các cụm tế bào, các mảnh còn lại của mẫu cấy và các tế bào chết.Mức độ tách rời của các tế bào phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể được đều chỉnh bởi thành phần môi trường

VD: trong nhiều trường hợp, tăng tỷ lệ auxin/cytokinin sẽ sản sinh nhiều khối tế bào xốp

- Chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù: có dạng đường cong chữ S với các pha sinh trưởng sau:

+Pha tiềm sinh (Lag-phase): ở pha này không xảy ra sự tăng về khối lượng

và số lượng tế bào (A)

+Pha số mũ (Exponential phase): ở pha này sự phân chia và sự tăng khối lượng tế bào diễn ra với tốc độ lớn nhất Ngoài ra sự sinh trưởng tế bào cũng tăng nhanh (B)

+Pha tuyến tính (Linear log-phase): được đặc trưng bởi sự sinh trưởng của

tế bào diễn ra ổn định liên tục (C)

+Pha ổn định: ở pha này hoạt tính phân bào giảm mạnh, số lượng và khối lượng tế bào ổn định (Stationary phase-D)

+Pha suy thoái (Dead phase): sự sinh trưởng của tế bào ra khỏi đỉnh cao, giảm xuống và dần đến ngừng sinh trưởng nếu không được cấy chuyển (E)

- Để duy trì quá trình nuôi cấy, các tế bào cần được cấy truyền vào giai đoạn đầu của pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất

Sự kết tập của tế bào là lớn nhất trong khoảng 18-25 ngày, với huyền phù sinh trưởng mạnh có thể ngắn hơn, từ 6-9 ngày Ở lần cấy truyền đầu tiên, dịch nuôi cần được lọc nhằm loại bỏ cụm tế bào lớn Lượng tế bào đem cấy truyền phải đủ lớn để đảm báo mật độ tế bào, vì khi thấp quá các tế bào sẽ không sinh trưởng được

VD: đối với tế bào cây sung dâu (Acerpseudoplatanus) mật độ thích hợp 9-15.103 tb/ml

- Theo King (1980), những tế bào trải qua quá trình nuôi cấy,sinh trưởng và trao đổi chất trong dịch huyền phù gọi là dòng tế bào, có đặc điểm sau:

+ Khả năng tách tế bào cao

+Hình thái tế bào đồng nhất

+ Nhân rõ ràng và tế bào chất đậm đặc

+ Nhiều hạt tinh bột

+ Tương đối ít các yếu tố mạch

+ Có khả năng nhân đôi trong 24-72h

+ Mất tính toàn năng

+ Quen với chất sinh trưởng

+ Tăng mức đa bội thể

3 Môi trường nuôi cấy:

Về bản chất các tế bào huyền phù là loại tế bào callus, do đó môi trường nuôi cấy calus có thể sử dụng để khởi đầu việc nuôi cấy huyền phù tế bào với việc cải tiến hàm lượng và tỉ lệ auxin/cytokinin cho phù hợp để có được các tế bào phân tán tốt trong môi trường lỏng lắc

Huyền phù tế bào được duy trì bằng sự cấy chuyển liên tục ở đầu pha ổn định và ở thời điểm khi sự kết tập của tế bào là lớn nhất

4 Các chỉ tiêu sinh trưởng:

- Số lượng tế bào:

Trước khi đếm, xử lý những cụm tế bào qua acid chromic, đun nóng 700C trong 5 – 10 phút, sau đó làm nguội và lắc mạnh trong vài phút

Pha loãng dịch, nhuộm và đếm trên buồng đếm hồng cầu

Kết quả: số lượng tế bào/ml dung dịch nuôi cấy

- Thể tích tế bào:

Lấy ngẫu nhiên một thể tích dịch nuôi cấy, đem ly tâm ở tốc độ 2000 vòng/ phút trong thời gian 5 phút

Thu tế bào và đem xác định thể tích

Kết quả: Số ml tế bào/thể tích môi trường nuôi cấy

- Khối lượng tươi:

Thu thập tế bào trong một thể tích dịch xác định

Rửa bằng nước cất vô trùng

Làm khô trong chân không

Cân để xác định khối lượng

- Khối lượng khô:

Lấy một thể tích mẫu xác định

Loại bỏ phần nổi, rửa phần tế bào trên giấy lọc Whatman

Sấy khô trong 12h ở 800C đến khối lượng không đổi

- Xác định chỉ số nguyên phân (chỉ số phân bào):

Huyền phù tế bào được cố định trong hỗn hợp Aceto-orcein : Acid Acetic (3:1) sau đó chuyển sang lam kính Nhỏ 1 giọt Aceto-orcein lên mẫu, hơ trên ngọn lửa đèn cồn, để nguội trong 5 phút Đậy mẫu bằng Lamel, làm khô mẫu, quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính 100 Xác định các kỳ trong khoảng 1000 tế bào Tỷ lệ % các tế bào đang phân bào gọi là chỉ số nguyên phân

Tổng số tế bào phân bào x 100 Chỉ số phân bào(%) =

Tổng số tế bào kiểm tra

- Khả năng sống của tế bào: nhuộm bằng flurescein diacetate (0,01%) và

quan sát màu xanh dưới sự chiếu sáng tử ngoại (ultraviolet)

II Kĩ thuật sử dụng trong nuôi cấy huyền phù tế bào

1 Nuôi cấy dịch thể động :

1.1 Nuôi cấy chìm liên tục :

- Các tế bào được tiếp xúc với môi trường dinh dưỡng do chúng được ngâm hẳn vào dung dịch môi trường Khí đưa vào phải đảm bảo vô trùng Quá trình thông khí còn ngăn chặn và làm giảm sự kết dính của các tế bào với nhau

- Theo Thomas và Davey (1975), nuôi cấy huyền phù tế bào có dung tích 25ml, tốc độ phù hợp nhất của máy lắc là 100 – 120 vòng/phút

- Thể tích của môi trường lỏng cũng phải phù hợp với kích thước bình nuôi cấy, thường chiếm 20% thể tích bình Các nuôi cấy quy mô nhỏ và trong những thời gian ngắn, có thể sử dụng máy khuấy từ ở tốc độ 250 vòng/phút và thời gian cho quá trình nuôi cấy thường từ 10 – 15 ngày

- Sau đó, các mẫu nuôi cấy phải được cấy chuyển sang môi trường mới để đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển của các tế bào

1.2 Nuôi cấy chìm tuần hoàn :

Các tế bào được nhúng chìm vào môi trường dịch thể, xen kẽ với những khoảng thời gian được đưa ra ngoài môi trường.Quá trình được thực hiện nhờ sự chuyển động “bập bênh” của các bình nuôi cấy Khi chuyển động: Khối tế bào ở đầu này được đưa vào môi trường Khối tế bào ở đầu kia tiếp xúc với không khí

2 Nuôi cấy huyền phù tế bào bằng Bioreactor:

Hệ thống Bioreacter có rất nhiều nhưng phổ biến nhất là hệ thống

Bioreacter kiểu Air-lift và hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

II.1 Cấu tạo chung:

Chứa các thành phần như bộ điều chỉnh nhiệt độ - pH, thùng chứa dung dịch dinh dưỡng, hệ thống cung cấp không khí, hệ thống cánh khuấy (một só thiết

bị được thay bằng bộ sục khí nén từ dưới lên )

Nguyên tắc hoạt động của từng thiết bị phụ thuộc vào từng công nghệ sản xuất

II.2 Bioreacter không có cánh khuấy:

Đây là kiểu Bioreacter đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt khí ở phía dưới đáy bình, nó có tác dụng khuấy trộn môi trường và cung cấp oxy, lượng oxy cung cấp ảnh hưởng đến sự phát triển của đối tượng Dòng khí vào pha lỏng phải được thổi qua một màng lọc có các lỗ kích thước nhỏ 0.01 – 0.1mm Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm giảm đáng kể sự cọ xát cho các tế bào nên tế bào ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có nhạy cảm cao

+Khả năng nhân sinh khối rất nhanh, chồi phát triển tương đối đồng đều +Hệ thống này rất phù hợp cho những quá trình nhân sinh khối tế bào và nhân sinh khối rễ do khả năng chịu được sự ngập chìm trong môi trường

+Thực tế hiện nay người ta đang sử dụng hệ thống này vào sản xuất giống hay sinh khối như nuôi củ hoa Lily, hoa thu Hải đường hay nhân sâm của phân viện sinh học Đà Lạt

+ Sự cung cấp Oxy không được đồng đều trong toàn bộ môi trường

+ Hiện tượng thủy tinh thể do ngập chìm hoàn toàn và liên tục

+ Khó áp dụng một cách đồng loạt cho nhiều giống khác nhau

+ Nuôi cấy trong môi trường lỏng dễ bị nhiễm vi sinh vật như nấm, vi khuẩn, côn trùng

II.3 Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS):

II.3.1 Nguyên tắc vận hành và cấu trúc cơ bản hệ thống:

Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện được đề ra bởi Teisson và cộng sự năm 1999:

- Tránh sự ngập liên tục là yếu tố ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng và phát sinh hình thái của mẫu cấy

- Cung cấp sự trao đổi oxy một cách đầy đủ.

- Cung cấp sự hòa trộn đầy đủ

- Có thể thay đổi môi trường và điều khiển tự động

- Hạn chế sự nhiễm

- Giá thành hạ

Tất cả các hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời đều phải tuân theo một nguyên tắc là phải có khả năng tạo ra sự ngập chìm không liên tục theo chu kỳ xác định Các hệ thống đều có ngăn chứa môi trường riêng, có thể chung một bình chứa nhưng có hai ngăn khác nhau hay gồm một hệ thống bình chứa nối với

hệ thống chứa mẫu cấy bằng hệ thống ống dẫn và bơm điều khiển Các mẫu cấy thường được đặt trên những đĩa bằng nhựa polypropylene thành một cụm, điều này giúp tiết kiệm được thời gian phải đặt mẫu lên trên giá thể thạch trong nuôi cấy thông thường

Tóm lại, hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời thông thường có những bộ phận chủ yếu sau:

- Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại

- Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập

- Hệ thống ống dẫn và van điều khiển

- Bình nuôi cấy thường bằng nhựa polycarbonate hay thủy tinh Dựa theo nguyên tắc và nguyên lý để tạo ra hệ thống ngập chìm tạm thời, nhiều nhà khoa học đã thiết kế và tạo ra các hệ thống ngập khác nhau, tùy vào mục đích nuôi cấy khác nhau

Ở nước ta, Phân viện Sinh học Đà Lạt đã chế tạo thành công hệ thống nuôi cấy này và đã thành công trong việc nhân giống nhanh loài hoa African violet

Trên thị trường đã có một số hệ thống đã được thương mại hóa như: Hệ thống RITA, hệ thống bình đôi BIT, hệt thống Plantima Tất cả các hệ thống này đều tuân theo những điều kiện là tránh sự ngập nước liên tục, có thể thay đổi môi trường, điều khiển tự động và hạn chế sự nhiễm

II.3.2 Ưu điểm:

+ Phát sinh phôi soma trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau Phát sinh chồi và phôi soma không bị biến dị với tần số cao

+ Sự sinh trưởng và hệ số nhân nhanh chồi luôn cao hơn so với hệ thống thông thường trên môi trường rắn hay Bioreacter thông thường

+ Cây tái sinh và phôi soma thu được luôn có chất lượng tốt hơn, tỉ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh

+ Hạn chế hiện tượng thủy tinh thể

+ Tiết kiệm công lao động và không gian nuôi cấy, giảm chi phí sản suất + Giảm hoạt tính của các chất độc ngoại bào hay các chất ức chế sinh

trưởng được tiết ra ngoài môi trường trong thời gian nuôi cấy

II.3.3 Khuyết điểm:

+ Chưa khảo sát được mật độ nuôi cấy

+ Giá thành của thiết bị rất đắt, chưa được tự chế tạo trong nước

+ Các thông số kĩ thuật của hệ thống này cần được khảo sát kỹ lưỡng và tối

ưu hóa đối với từng giai đoạn nuôi cấy của từng loại cây

II.3.4 Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm tạm thời lên chất lượng nuôi cấy:

Khi nuôi cấy chồi trong hệ thống TIS thì lá nhỏ hơn lá trong môi trường nuôi cấy lỏng Những cụm chồi phát triển từ các chồi bên trong Bioreacter thường

có hình cầu và chồi có xu hướng phát triển tỏa tròn xung quanh tâm Do đó một

số chồi con có kích thước không lớn Chồi cây có thân dài hơn và ra nhiều lá hơn

so với nuôi cấy trên môi trường thạch Những ảnh hưởng có lợi từ hệ thống ngập

chìm tạm thời lên sự phát triển chồi có thể là kết quả của việc sử dụng những bình chứa dung tích lớn

III Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào trong nhân giống vô tính

- Quy trình nuôi cấy:

Quy trình nuôi cấy huyền phù tế bào thường qua hai bước cơ bản là nuôi cấy callus và nuôi cấy dịch huyền phù:

- Nuôi cấy callus: Callus là dòng tế bào ban đầu, tương tự mô sẹo tạo ra để hàn gắn vị trí tổn thương của cây Khi đã có callus, tiến hành cấy chuyển nhiều lần trong môi trường thạch mềm vì nuôi cấy huyền phù tế bào cần một lượng

mô sẹo khá lớn

chuyển sang môi trường lỏng chuyển động bằng cách lắc hoặc khuấy Đây là giai đoạn rất quan trọng, nghiên cứu khảo sát được môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho tế bào phát triển tốt nhất và có hàm lượng hoạt chất cao nhất có tính chất quyết định thành công của quá trình nuôi cấy tế bào Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi

trường Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển

và các tế bào chết Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường

- Sự phát sinh phôi soma:

Sự phát sinh phôi soma cũng được áp dụng trong việc nhân giống cây

trồng với số lượng lớn trong Bioreactor tự động Do có kích thước tương đối nhỏ

và đồng đều kích cỡ, chúng không phải cắt thành những mảnh nhỏ và tách rời khi nuôi cấy trong môi trường tăng sinh

Tính toàn năng của tế bào thực vật, khả năng tạo phôi mới và sự biểu hiện kiểu hình là cơ sở để đưa ra giả thiết về sự phân lập và nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng, đặc biệt là giúp kích thích tạo phôi đơn bội Quá trình phát sinh phôi soma được thực hiện bằng cách sử dụng môi trường kích thích có chứa auxin (thường dùng 2,4D) và nước dừa ban đầu Sau đó, dùng nhiều xytokinin, myo-inosiol và giảm lượng nitrogen Khi các cụm tiền phôi được tạo thành thì hạ thấp hoặc lấy bớt nồng độ auxin trong môi trường Sau đó, trình tự giống như quá trình tạo phôi giao tử (đơn bội) sẽ diễn ra

Phôi soma thường nhỏ và thích hợp cho các quy trình nhân sinh khối,

chúng có thể được phân tách, đưa vào khuấy trộn, sau đó cất trữ hay tạo ra cây con trực tiếp Sản lượng và chất lượng phôi soma của nhiều loài thực vật đã được cải thiện nhờ vào hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời

- Sự nhân chồi:

Hệ thống ngập chìm có tác dụng thúc đẩy việc nhân chồi Khi nuôi cấy trên hệ thống lỏng, kết quả sinh trưởng chồi thu được tốt hơn cấy chuyền trên môi trường rắn

Trong hệ thống Bioreacter chồi có thể tăng trưởng liên tục, vì thế cho phép thu hoạch chồi sau mỗi tháng trong khoảng thời gian 19 tháng mà không cần cấy chuyền Điều quan trọng là chồi thu được trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm có chất lượng tốt hơn và dài hơn so với chồi trên môi trường rắn

Sau khi thu hoạch, cây con được chuyển ra nuôi ở môi trường tự nhiên bình thường như trên môi trường thạch

IV Ứng dụng của nuôi cấy huyền phù tế bào trong sản suất sinh khối tế bào thực vật và các hợp chất có giá trị cao

1 Nhân sinh khối callus: