Thăm dò cơ chế tác dụng hạ đường huyết của phân đoạn n hexan rễ cây chóc máu nam trên mô hình nuôi cấy tế bào cơ vân c2c12

B GIÁO DO B Y T I HC HÀ NI TRN TH THÙY LINH  TÁC DNG H NG HUYT CA N N-HEXAN R CÂY CHÓC MÁU NAM TRÊN MÔ HÌNH NUÔI CY T  2 C 12 LUC C HC HÀ NI, 2013 B GIÁO DC VÀ O B Y T I HC HÀ NI TRN TH THÙY LINH  TÁC DNG H NG HUYT CN N-HEXAN R CÂY CHÓC MÁU NAM TRÊN MÔ HÌNH NUÔI CY T  2 C 12 LUC HC CHUYÊN NGÀNH DC LÝ  C LÂM SÀNG MÃ S: 60720405 ng dn khoa hc: 1. TS. Trn Th Oanh 2. Th Th Nguyt Qu HÀ NI, 2013 HÀ NI, 2013 Li cam n             ng nghip, bn bè và i thân.  TS. Trần Thị Oanh – Cc Khoa hc công ngh o, B Y t và ThS. Đỗ Thị Nguyệt Quế - B c li hc Hà Ni, nhi thng dn, ch bo nhi tôi có th hoàn thành lu Xin trân trng c             c gi li ci các thy cô, các anh ch k thut viên B c li hc Hà N nhit tình và tu ki tôi thc hin lu Cuc gi li cc tn bè và  ng nghip, nh i luôn  bên qu  ng viên tôi trong nh tôi v mi mt trong sut thi gian hc tp và thc hin lu Hà Nội, tháng 8 năm 2013 Học viên Trần Thị Thùy Linh MC LC Trang t v 1 NG Q 2 1.1. Mt vài nét v b 2 1.1.1.  2 1.1.2.  4 1.1.3. c hi 5 1.1.4. ng   6 1.2. Adenosin monophosphat   6 1.2.1. m c 6 1.2.2. S hot hóa phc h 8 1.2.3. Vai trò c 10 1.2.4. Mt s cht ho 14 1.3. Cây Chóc máu Nam (Salacia cochinchinensis  17 T LIU, TRANG THIT B  PHÁP NGHIÊN C 21 2.1. Nguyên li 21 2.2.  21 2.3. t b dùng trong nghiên c 21 2.4.  23 2.4.1.  c t bào C 2 C 12 ca dch chi 23 2.4.2. ng cn kh n glucose ca t bào C 2 C 12  25 2.4.3. t hóa AMPK ct chit c t 27 2.5. X lý s li 31 T QU NGHIÊN C 32 3.1. Kt qu t c t bào C 2 C 12 c 32 3.2. Kt qu ng cn kh n glucose vào t bào C 2 c 12  33 3.2.1. Kt qu  ng cn kh n glucose vào t bào C 2 C 12 khi không có m 33 3.2.2. Kt qu ng cn kh n glucose vào t bào C2C12 khi có m 34 3.3. Kt qu ng hot hóa AMPK ct chit c t  35 3.3.1. Kt qu kho sát ng c các n khác nhau n m biu hin ca p-AMPK và AMPK t 35 3.3.2. Kt qu kho sát ng ca các cht chic t  n m biu hin ca p- 37  40 4.1. Kh c t bào C 2 C 12 c 42 4.2. ng ca dch chii vi kh n glucose vào trong t  2 C 12  43 4.3. Tác dng hot hóa AMPK ct chic t  46 4.3.1. ng c các n n m biu hin ca p-AMPK và AMPK t 49 4.3.2. ng ca các cht chic t n m biu hin ca p- 51 KT LU 53  XU 55 DANH MC CÁC BNG Trang Bng3.1. Giá tr m quang ca các lô t bào sau khi  vi MTT 32 Bng 3.2. ng cn m thu nhn glucose ca t bào C 2 C 12 khi không có có insulin 33 Bng 3.3. ng cn m thu nhn glucose ca t bào C 2 C 12 khi có insulin 34 Bng 3.4. T l ph biu hin p-AMPK và AMPK tng so vi m biu hin c-actin 36 Bng 3.5. T l ph biu hin p-AMPK so vi m biu hin c-actin trong thí nghim kho sát ng ca SCC1, SCC2 và SCC3 38 DANH MC CH VÀ KÝ HIU VIT TT ACC Acetyl  CoA carboxylase AICAR 5-aminoimidazole-4-carboxamide--ribofuranoside AMP Adenosine monophosphat AMPK Adenosine monophosphat  activated protein kinase ATP Adenosine triphosphat CaMKK Calmodulin-dependent protein kinase kinase CBS cystathionine   synthase ChREBP Carbohydrate Response Element Binding Protein CPT1 Carnitin palmitoyltransferase 1 CT Carboxyl transferase DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO Dimethyl sulfoxid  ng FAS Fatty acid synthase FBS Fetal bovine serum FFA Free fatty acid GLUT Glucose transporter (H vn chuyn glucose) HGO Hepatic glucose output HLA Human leucocyte antigen HMG-CoA 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A HNF 4- Hepatocyte nuclear factor 4- HRP Horseradish peroxidase HS Horse serum HSL Hormone-sensutive lipase IL Interleukin LKB1 Liver kinase B1 MODY Maturity onset diabetes of the Young mTOR Mammalian target of rapamycin MTT 3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid OGTT Oral glucose tolerance test PEPCK Phosphoenol pyruvate carboxy kinase PPAR Peroxisome proliferator  activated receptor PVDF Polyvinylidene difluoride SREBP Sterol Regulatory Element-Binding Protein TAK1 Transforming growth factoractivated kinase  1 TBS-T Tris Buffer Saline Tween20 TG Triglycerid   TORC2 The transducer of regulated CREB protein 2 TZD Thiazolidindion UCP1 Uncoupling protein 1 WHO World Health Organization DANH MC CÁC HÌNH V, BI Trang ng chuyn hóa glucose chính  b 4 Hình 1.2. Cu trúc phân t AMPK 7 Hình 1.3. AMPK ho oxy hóa acid béo trong ty th thông qua c ch ACC 11 Hình 1.4. Công thc cu to ca AICAR và mt s hp ch 17 Hình 2.1. Kháng th th c 30 Hình 3.1. Hình nh m biu hin cu p-AMPK, AMPK t-actin khi  t bào v n khác nhau trong thi gian 60 phút 35 Hình 3.2. S l biu hin ca p-AMPK và AMPK tng so vi -actin 36 Hình 3.3. Hình nh th hin ng ca SCC1, SCC2 và SCC3 n m biu hin ca p--actin 37 Hình 3.4. Bi th hin m u hin p-AMPK ca lô t bào  vi mu th so vi lô chng 39 Hình 4.1. Vai trò ca AMPK trong chuyn hóa glucid và lipid trong t bào 47 1 T V ng là ri lon chuyn hóa dt và nhiu bin chng. c bit là ng typ 2 vc xem là v cp bách ca thi [7], [39]. Theo th gii có 246 trii mc ng bnh nhân mc ng là 346 trii. i 3,8 triu i cht do ng, trong  c có thu nhp thp và trung bình. T chc Y t th gii (WHO) d báo s i cht do ng s  n [44]t s thuu tr ng u qu còn nhiu hn ch ng kháng thuc sau mt thu tr [14]. Ti mt s c trên th gii, mt s loài thuc chi Salacia c s dng  u tr    ng. Salacia cochinchinensis Lour. (còn gi là Chóc máu Nam hay Chóc máu Vit) là loài c tìm thy  Vit c nghiên cu chng minh tác du tr ng. Nhng nghiên cu ti Vin và chng minh tác dng h glucose huyt rõ rt trên chut nht gây   ng bng streptozocin ca dch chit phân n n  hexan r  tip tc phát trin nghiên cu  giai n   tác dng h glucose huyt cc liu này, chúng tôi thc hi tài: “Thăm dò cơ chế tác dụng hạ đường huyết của phân đoạn n-hexan rễ cây Chóc máu Nam trên mô hình nuôi cấy tế bào cơ vân C 2 C 12 ” vi 3 mc tiêu: 1.    c t bào C 2 C 12 ca cn dch chit n n- hexan r cây Chóc máu Nam. 2. Nghiên cu tác dng h glucose huyt ca cn dch chit  n n  hexan r   thu nhn glucose ca t C 2 C 12 . 3.  tác dng hot hóa adenosin monophosphat protein kinase (AMPK) và c ch acetyl coenzym A carboxylase (ACC) ca cn dch chit n n  hexan r cây Chóc máu Nam. [...]... con đƣờng kích thích sự thu nh n glucose v o cơ v n: con đƣờng phụ thuộc insulin và con đƣờng không phụ thuộc insulin Kháng insulin là một trong những khiếm khuyết đƣợc phát hi n trong cơ v n của bệnh nh n ĐTĐ v chủ yếu là do sự sai lệch trong quá trình truy n t n hiệu của insulin Tuy nhi n, hi n nay bi n pháp hữu hiệu để khắc phục những sai lệch trong con đƣờng truy n t n hiệu insulin v n c n rất h n. .. trƣờng không khí có 5% CO2 Nuôi tế o đ n khi tế bào phát tri n n định Cấy chuy n các tế o v o đĩa 96 giếng với mật độ 5000 tế bào/ giếng, tiếp tục nuôi cấy ở điều ki n nhƣ tr n trong 1 ngày Biệt hóa tế bào C2C12 bằng cách thay môi trƣờng nuôi cấy DMEM đã ổ sung 10% huyết thanh ò bằng môi trƣờng nuôi cấy DMEM đã ổ sung 5% huyết thanh ngựa trong 72h  Ủ tế bào với mẫu thử: Các tế bào sau khi nuôi cấy và... ảnh hƣởng của dịch chiết PĐ đ n chức n ng sống của tế bào Mức độ gây chết tế bào của PĐ so với lô chứng đƣợc tính theo công thức: Trong đó: X : Ph n trăm tế bào chết của lô thử so với lô chứng (%) ODchứng: mật độ quang của giếng tế bào lô chứng ODthử : mật độ quang của giếng tế bào lô thử 2.4.2 Đánh giá ảnh hưởng của PĐ đ n khả n ng thu nh n glucose của tế bào C2C12 Nguy n t c ti n hành: 24 Xác định... thử nghiệm tr n mô hình động vật ĐTĐ v thể hi n tác dụng chống ĐTĐ thông qua cải thi n nồng độ glucose máu lƣợng lipid lƣợng glucose s n xuất ở gan và quá trình sử dụng glucose Truy n AICAR cho cả ngƣời khỏe mạnh và bệnh nh n tiểu đƣờng đều l m tăng hấp thu glucose ở cơ v n AICAR cũng l m giảm đáng kể sự tạo thành các dạng oxy hoạt động trong máu và duy trì chức n ng tế bào n i mô ình thƣờng ở bệnh nh n. .. chiết n y Phƣơng pháp đƣợc sử dụng để đánh giá độc tính tr n tế bào của dịch chiết PĐ l kỹ thuật định lƣợng MTT (MTT assay) [27] Quy trình ti n hành  Hoạt hóa và nuôi cấy t bào: Hoạt hoá và nuôi cấy tế bào C2C12 trong môi trƣờng DMEM đã ổ sung 10% huyết thanh ò penicillin 100UI/mL; streptomycin 0,1mg/mL ở 37oC trong môi trƣờng không khí có 5% CO2 Nuôi tế o đ n khi tế bào phát tri n n định Cấy chuy n tế. .. tộc Kata sử dụng làm thuốc tiêu khát, chống viêm, bồi bổ cơ thể Kết quả định tính sơ ộ cho thấy trong rễ cây Chóc máu Việt có: flavonoid, anthranoid, saponin, tannin, acid hữu cơ Trong đó saponin v polyphenol (favonoid và tanin) là các thành ph n chính có trong rễ cây Chóc máu Việt Tính cho đ n nay đã có rất nhiều nghi n cứu li n quan đ n đặc điểm và tác dụng của các cây thuộc chi Salacia 17 Rễ Salacia... nh n ĐTĐ Trong một nghi n cứu khác, AICAR l m tăng lƣợng glucose trong cơ v n chuột, chủ yếu thông qua tăng dòng glucose vào trong tế bào [6] AICAR cũng điều hòa biểu hi n của gen IL-6 và IL-8 cũng nhƣ sự tiết các chất n y từ các tế bào mỡ và các tế o cơ v n Hai chất trung hòa ti n mi n dịch n y đƣợc tiết ra từ mô mỡ v đóng vai trò quan trọng trong việc gây n n tình trạng kháng insulin ở bệnh nh n éo... tính của LKB1 trong cơ v n không l m tăng dòng calci đi v o tế bào v không l m thay đổi hoạt tính của protein phosphatase Điều trị bằng metformin trong 10 tu n cho bệnh nh n ĐTĐ typ 2 l m tăng hoạt tính của AMPKα2 trong cơ v n li n quan đ n sự phosphoryl hóa ph n tử 14 threonin 172 của AMPK đồng thời giảm hoạt tính của ACC-2 Tác dụng tăng hoạt tính của AMPKα2 đƣợc cho l do metformin l m thay đổi tình... tủ lạnh (4oC và -20oC);  Dụng cụ đếm tế bào;  Kính hi n vi soi ngƣợc;  N i hấp khử trùng;  Máy đi n di và chuy n màng bio-rad;  Một số thiết bị c n thiết khác (máy đo pH ơm ch n không …) 22 Phƣ n pháp n hi n ứu 2.4 2.4.1 Thăm dò khả n ng gây độc tế bào C2C12 của PĐ Trƣớc khi đánh giá tác dụng của dịch chiết PĐ tr n tế bào C2C12, ti n h nh đánh giá nhằm thăm dò khả n ng gây độc tế bào C2C12 của. .. trạng n ng lƣợng trong cơ do giảm n ng độ ATP và làm giảm phosphocreatin trong cơ Tác dụng n y l m tăng sử dụng glucose v tăng n ng độ glycogen trong cơ [6] [31] Thiazolidindion (TZD) không trực tiếp phosphoryl hóa AMPK mà tác dụng thông qua các cơ chế gi n tiếp Các TZD li n kết và kích hoạt PPAR-γ l m tăng sự nhạy cảm với insulin ở nhiều mô ngoại vi khác nhau TZD nhƣ rosiglitazon và pioglitazon, làm . huyt cc liu n y, chúng tôi thc hi tài: Thăm dò cơ chế tác dụng hạ đường huyết của ph n đo n n- hexan rễ cây Chóc máu Nam tr n mô hình nuôi cấy tế bào cơ v n C 2 C 12 ” vi 3 mc. Y T I HC HÀ N I TR N TH THÙY LINH  TÁC DNG H NG HUYT CA  N N -HEXAN R CÂY CHÓC MÁU NAM TR N MÔ HÌNH NUÔI CY T  2 C 12 . trong quá trình truy n t n hiu ca insulin. Tuy nhi n, hi n nay bi n pháp hu hi khc phc nhng sai lng truy n t n hiu insulin v n c n rt h n ch. Vì vy, ci thin