Số liệu đƣợc xử lý thống kê theo phần mềm Microsoft Excel 2003. Sự khác nhau có ý nghĩa thống kê khi p< 0,05. Kết quả thí nghiệm đƣợc biểu thị bằng trị số trung bình cộng/trừ độ lệch chuẩn (M ± SD).
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Kết quả thăm ò khả năn ây độc tế bào C2C12 củ PĐ
Mật độ quang đo đƣợc ở ƣớc sóng 540nm của các lô tế bào ủ với PĐ ở các nồng độ 20,00 – 50,00 – 125,00 và 250,00 g/ml sau khi ủ với MTT so với lô chứng nhƣ sau:
Bảng3.1. Giá trị mật độ quang của các lô tế bào sau khi ủ với MTT
Lô Nồn độ ủ (g/ml) Giá trị mật độ quang (TB±SD) Phần t ăm tế bào chết so với lô chứng Lô chứng - 0,514 + 0,036 Lô 1 PĐ 20 00 g/ml 0,550 + 0,044 Lô 2 PĐ 50 00 g/ml 0,552 + 0,122 Lô 3 PĐ 125 00 g/ml 0,402 + 0,087* 21,82 Lô 4 PĐ 250 00 g/ml 0,366 + 0,052** 28,74 *: p<0,05; **: p<0,01 so với lô chứng Nhận xét:
So sánh mật độ quang đo đƣợc của các lô thử với mật độ quang đo đƣợc ở lô chứng (chỉ bổ sung DMSO) cho thấy giá trị mật độ quang ở các lô thử PĐ 1 (ủ với PĐ ở nồng độ 20,00 g/ml) v PĐ 2 (ủ với PĐ ở nồng độ 50,00 g/ml) không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với giá trị mật độ quang đo đƣợc ở lô chứng (p>0,05). Nhƣ vậy có thể thấy, ủ tế bào với PĐ ở nồng độ 20,00 g/ml và 50,00 g/ml không gây chết tế bào khi so sánh với lô chứng.
Trong khi đó giá trị mật độ quang của các lô thử PĐ 3 (ủ với PĐ ở nồng độ 125,00 g/ml) v PĐ 4 (ủ với PĐ ở nồng độ 250,00 g/ml) thấp hơn có ý nghĩa thống kê khi so sánh với giá trị mật độ quang của lô chứng
(p<0,05). Phần trăm ch nh lệch giá trị mật độ quang của các lô thử PĐ 3 v PĐ 4 so với giá trị mật độ quang của lô chứng tƣơng ứng là 21,82% và 28 74%. Nhƣ vậy PĐ ở các nồng độ 125,00 g/ml và 250 g/ml có khả năng gây chết tế bào với tỷ lệ phằn trăm tế bào chết tƣơng ứng là 21,82% và 28,74%.
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hƣởng củ PĐ đến khả năn thu nhận glucose vào tế bào C2C12
3.2.1. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của PĐ đến khả năng thu nhận glucose vào tế bào C2C12 khi không có mặt insulin
Sau khi ủ tế bào trong thời gian 1 giờ với PĐ trong môi trƣờng nuôi cấy có chứa glucose (8 mM) ở 37oC định lƣợng nồng độ glucose còn lại trong môi trƣờng bằng phƣơng pháp glucose oxydase. Giá trị mật độ quang của dung dịch nuôi cấy tế bào sau khi thêm thuốc thử glucose oxydase ở các lô đƣợc thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của PĐ đến mức độ thu nhận glucose của tế bào C2C12 khi không có có insulin
Lô Mẫu thử và nồng độ ủ Gía trị mật độ quang (TB±SD) p so với lô chứng Lô 3 (chứng) (n=6) - 0,388 ± 0,034 Lô 1 (n=6) PĐ với nồng độ 20 μg/mL 0,321 ± 0,042 < 0,05 Lô 2 (n=6) PĐ với nồng độ 50 μg/mL 0,304 ± 0,052 < 0,01 Lô 4 (insulin) (n=6) insulin 0 1μM 0,231 ± 0,034 < 0,01 Nhận xét:
Giá trị mật độ quang đo đƣợc ở lô tế bào ủ với insulin thấp hơn đáng kể so với mật độ quang của lô chứng (p<0,01). Điều này cho thấy lƣợng glucose còn lại trong môi trƣờng nuôi cấy ở lô tế bào ủ với insulin thấp hơn đáng kể so với lƣợng glucose còn lại trong môi trƣờng nuôi cấy ở lô chứng. Nói cách khác, ở lô tế bào ủ với insulin lƣợng glucose đƣợc thu nhận vào trong tế bào nhiều hơn đáng kể so với lô tế bào ở lô chứng. Đo mật độ quang ở các lô tế bào ủ với mẫu thử PĐ ở các nồng độ 20,00 μg/mL v 50 00 μg/mL đều cho kết quả tƣơng tự. Nhƣ vậy, khi ủ tế bào với dịch chiết PĐ ở cả hai nồng độ 20 00 μg/mL v 50 00 μg/mL lƣợng glucose đƣợc thu nhận vào tế o cơ vân C2C12 đều cao hơn đáng kể so với lô tế bào chỉ ủ với dung môi là DMSO.
3.2.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của PĐ đến khả năng thu nhận glucose vào tế bào C2C12 khi có mặt insulin
Sau khi ủ tế bào trong thời gian 1 giờ với PĐ trong môi trƣờng nuôi cấy có chứa glucose (8 mM) và insulin (0,1µM) ở 37oC định lƣợng nồng độ glucose còn lại trong môi trƣờng bằng phƣơng pháp oxidase và đo độ hấp thụ ánh sáng ở ƣớc sóng 492 nm. Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng:
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của PĐ đến mức độ dung nạp glucose của tế bào C2C12 khi có insulin
Lô Mẫu thử Giá trị mật độ
quang (TB±SD) p so với lô chứng Lô 4 (n=6) insulin 0 1μM 0.231 ± 0.034 Lô 5 (n=6) PĐ 20 μg/mL + insulin 0 1μM 0.296 ± 0.065 > 0,05 Lô 6 (n=6) PĐ 50 μg/mL + insulin 0 1μM 0.282 ± 0.060 > 0,05 Nhận xét:
So sánh giá trị mật độ quang ở các lô tế bào ủ với mẫu thử PĐ v insulin với lô tế bào chỉ ủ với insulin không thấy có sự khác biệt đáng kể. Nói cách khác, khi có mặt insulin, nồng độ glucose đƣợc thu nhận vào trong tế o cơ vân ở các lô tế bào có ủ với PĐ không lớn hơn đáng kể so với nồng độ glucose đƣợc thu nhận vào trong tế o cơ vân C2C12 ở lô không ủ với PĐ (p>0,05).
3.3. Kết quả đánh iá tác dụng hoạt hóa AMPK củ PĐ và các chất chiết tá h đƣợc từ PĐ
3.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của PĐ ở các nồng độ khác nhau đến mức độ biểu hiện của p-AMPK và AMPK tổng
Tế bào sau khi ủ với PĐ với các nồng độ khác nhau (5,00 μg/mL; 10 00 μg/mL; 20 00 μg/mL v 50 μg/mL) trong thời gian 60 phút, thu protein và tiến hành phân tích western blot. Hình ảnh mức độ biểu hiện của p-AMPK, AMPK tổng v β-actin nhƣ sau:
PĐ (μg/mL) DMSO 5μg/mL 10μg/mL 20μg/mL 50μg/mL p-AMPK
AMPK tổng β-Actin
Hình 3.1. Hình ảnh mức độ biểu hiện cảu p-AMPK, AMPK tổng và β-actin khi ủ tế bào với PĐ ở nồng độ khác nhau trong thời gian 60 phút
Đo mật độ ánh sáng thu đƣợc của các dải protein bằng phần mềm Image J. Tỷ lệ phần trăm mức độ biểu hiện của p-AMPK và AMPK tổng so với mức độ biểu hiện của β-actin đƣợc thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.4. Tỷ lệ phần trăm mức độ biểu hiện p-AMPK và AMPK tổng so với mức độ biểu hiện của β-actin
Lô Nồn độ PĐ (μ /ml)
Tỷ lệ phần trăm mức độ biểu hiện so với β-actin (%)
p-AMPK AMPK tổng Lô 5 (Chứng) - 21,672 ± 8,418 104,810 ± 45,101 Lô 1 (n=3) 5,00 μg/mL 34,432± 0,315 p>0,05 91,406 ± 27,681 p>0,05 Lô 2 (n=3) 10,00 μg/mL 42,242± 26,249 p>0,05 102,341 ± 50,028 p>0,05 Lô 3 (n=3) 20,00 μg/mL 60,121± 14,709 p<0,05 100,407 ± 24,831 p>0,05 Lô 4 (n=3) 50,00 μg/mL 79,424± 12,067 p<0,05 99,020 ± 32,053 p>0,05
Ghi chú: giá trị c tính so sánh giữa các lô thử v i lô chứng.
Số lần tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK và AMPK tổng so với β- actin đƣợc thể hiện trong biểu đồ (Chú thích: (*): p<0,05):
Hình 3.2. Số lần tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK và AMPK tổng so với β-actin
Khảo sát mức độ biểu hiện của AMPKtổng ở các lô tế bào ủ với PĐ ở các mức nồng độ khác nhau trong cùng thời gian 60 phút cho thấy mức độ biểu hiện của AMPKtổng không thay đổi khi nồng độ PĐ thay đổi (p>0,05).
Mức độ biểu hiện của p-AMPK có sự khác nhau khi nồng độ PĐ thay đổi. Ủ tế bào với PĐ ở các nồng độ 5,00 μg/mL v 10 00 μg/mL không l m thay đổi đáng kể mức độ biểu hiện của p-AMPK khi so với lô chứng (chỉ ủ với dung môi pha mẫu thử l DMSO). Trong khi đó ủ tế bào với PĐ ở nồng độ 20 00 μg/mL v 50 00 μg/mL l m tăng đáng kể mức độ biểu hiện của p- AMPK khi so với lô chứng (tƣơng ứng là 2,88 lần và 4,13 lần, p<0,05).
3.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các chất chiết tách được từ PĐ đến mức độ biểu hiện của p-AMPK
Tế bào sau khi ủ với SCC1, SCC2, SCC3 ở các nồng độ 20 00 μg/mL v 50 00 μg/mL trong 1 giờ, thu protein và tiến hành chạy western blot, hình ảnh mức độ biểu hiện của p-AMPK v β-actin (protein đối chứng) nhƣ sau:
β-Actin: p-AMPK DMSO Metfor- min SCC1 50 µg/ml SCC2 50 µg/ml SCC3 50 µg/ml SCC1 20 µg/ml SCC2 20 µg/ml SCC3 20 µg/ml
Hình 3.3.Hình ảnh thể hiện ảnh hưởng của SCC1, SCC2 và SCC3 đến mức độ biểu hiện của p-AMPK và β-actin
Đo mật độ ánh sáng thu đƣợc của các dải protein bằng phần mềm Image J, tỷ lệ mức độ biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ với mẫu thử so với lô chứng đƣợc thể hiện trong bảng:
Bảng 3.5. Tỷ lệ phần trăm mức độ biểu hiện p-AMPK so với mức độ biểu hiện của β-actin
trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của SCC1, SCC2 và SCC3
Mẫu mứ độ iểu hiện ủ p-AMPK so với β-actin Tỷ lệ phần t ăm
DMSO 128,91 ±59,05 (p > 0,05) SCC1 50µg/ml 122,51 ± 89,74 (p > 0,05) SCC1 20µg/ml 152,07 ± 88,47 (p > 0,05) SCC2 50µg/ml 148,63 ± 63,00 (p<0,05) SCC2 20µg/ml 135,18 ± 85,01 (p > 0,05) SCC3 50µg/ml 92,16 ± 67,79 (p > 0,05) SCC3 20µg/ml 99,52 ± 56,59 (p > 0,05)
Ghi chú: giá trị c tính so sánh giữa các lô thử v i lô chứng.
Số lần tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK ở các lô thử so với lô chứng đƣợc thể hiện trong biểu đồ:
Hình 3.4. Biểu đồ thể hiện mức độ tăng biểu hiện p-AMPK của lô tế bào ủ với mẫu thử so với lô chứng
Nhận xét:
Ở lô tế bào ủ với SCC2 ở nồng độ 50 µg/ml, mức độ biểu hiện của p- AMPK tăng đáng kể khi so sánh với lô chứng (p < 0,05). Số lần tăng mức độ biểu hiện của p-AMPK so với lô chứng là 1,15 lần.
Ở các lô tế bào ủ với SCC2 ở nồng độ 20,00 µg/ml, SCC1 và SCC3, mức độ biểu hiện của p-AMPK không khác biệt đáng kể khi so sánh với lô chứng (p > 0,05).
CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN
Đái tháo đƣờng typ 2 đặc trƣng ởi sự bất thƣờng trong chuyển hóa glucose và lipid, phần lớn là do sự kháng insulin trong cơ vân gan v mô mỡ. Trong quá trình phát triển của bệnh ĐTĐ typ 2 an đầu các tế o β tuyến tụy đắp cho sự kháng insulin bằng cách tăng tiết insulin. Tuy nhiên, theo thời gian, khả năng tiết insulin của tế o β giảm dần dẫn đến tăng đƣờng huyết. ĐTĐ typ 2 tiến triển có thể gây ra các biến chứng nhƣ ệnh võng mạc, bệnh thần kinh, bệnh thận …
Một số loài thuộc chi Salacia đã đƣợc nghiên cứu và sử dụng ở nhiều nƣớc trên thế giới với tác dụng điều trị và hỗ trợ điều trị đái tháo đƣờng và béo phì. Nhiều nghiên cứu dƣợc lý gần đây đã chứng minh dịch chiết rễ các loài Salacia có tác dụng điều hòa nhiều protein có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa glucose và chuyển hóa lipid trong cơ thể nhƣ PPARs α- glucosidase, aldose reductase và lipase tụy. Một số loài thuộc chi n y đã đƣợc chứng minh tác dụng hạ glucose huyết nhƣ S. g S. hi e i ….
Ở Việt Nam, Salacia cochinchinensis L. (còn gọi là Chóc máu Nam) đƣợc biết đến trong dân gian nhƣ một bài thuốc có tác dụng tiêu khát, chống viêm, bồi bổ cơ thể. Một số tác giả gần đây đã ắt đầu nghiên cứu về thành phần hóa học và chứng minh tác dụng làm giảm glucose huyết trên chuột của
S. cochinchinensis. Năm 2010 Đỗ Thị Nguyệt Quế và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu xác định thành phần hóa học phân đoạn n – hexan của rễ cây Chóc máu Nam (Salacia cochinchinensis) đƣợc thu hái từ vƣờn Quốc gia Bạch Mã, Thừa Thiên Huế và phân lập đƣợc 3 chất: friedelan-3β-ol, stigmast-5-en-3β- ol và 21α,30-dihydroxyfriedelan-3-on [5]. Kết quả phân lập các chất từ dịch chiết phân đoạn hexan của rễ cây Salacia cochinchinensis thu hái tại Nghệ An của tác giả Trịnh Thị Điệp cũng cho thấy phân đoạn này chứa β-sitosterol (stigmast-5-en-3β-ol) [1]. Nghiên cứu của Đỗ Thị Nguyệt Quế và cộng sự
(2009) đánh giá tác dụng hạ glucose huyết của cắn các phân đoạn dịch chiết (n-hexan cloroform ethylacetat v uthanol) của rễ cây Chóc máu Nam
(Salacia cochinchinesis Lour.) thu hái tại Việt Nam cho thấy tr n chuột nhắt gây ĐTĐ ằng streptozocin cắn phân đoạn n-hexan v phân đoạn ethylacetat đều có tác dụng hạ glucose huyết rõ rệt (p<0 05) [4]
Yoshino K. và cộng sự (2009) đã tiến hành nghiên cứu đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết lá cây S. reticulata trên khả năng dung nạp glucose ở chuột khỏe mạnh và chuột đái tháo đƣờng typ 1. Kết quả nghiên cứu cho thấy 1,0 mg dịch chiết lá cây S. reticulata khi cho chuột uống đồng thời đồng thời với maltose hoặc sucrose có tác dụng ức chế sự tăng nồng độ glucose và nồng độ insulin huyết sau bữa ăn l m giảm hoạt động của enzym α- glucosidase trong ruột, ngăn chặn sự tăng cao nồng độ glucose huyết và ức chế hoạt động của α-glucosidase ở chuột đái tháo đƣờng typ 1, ức chế sự tăng cao nồng độ các peroxid lipid trong máu, tụy và thận l m tăng nồng độ insuslin và giảm hoạt tính của enzym aldose reductase thận ở chuột đái tháo đƣờng [47].
Trong nghiên cứu mới nhất của mình năm 2013 Sellamuthu PS. v cộng sự đã chỉ ra tác dụng của thành phần mangiferin có trong dịch chiết rễ cây Salacia chinensis trong việc bảo vệ các tế o eta đảo tụy, làm giảm đáng kể nồng độ glucose huyết v tăng nồng độ insulin cũng nhƣ tác dụng chống oxy hóa trên chuột gây đái tháo đƣờng bởi streptozocin. Magiferin cũng có tác dụng tái tạo cấu trúc tuyến tụy đã ị tổn thƣơng về gần nhƣ ình thƣờng [36].
Năm 2012 Bhat BM v cộng sự cũng đã chứng minh tác dụng cải thiện các thông số đƣờng huyết ở chuột Wistar gây đái tháo đƣờng bằng streptozocin (STZ) của dịch chiết rễ cây Salacia oblonga. Lô chuột dùng dịch chiết này với liều 100 mg/kg cân nặng có nồng độ glucose huyết giảm 45% và
lô chuột dùng với liều 50 mg/kg cân nặng có nồng độ glucose huyết giảm 44% khi so với lô chứng. Dịch chiết cũng l m tăng nồng độ insulin huyết tƣơng l m giảm nồng độ HbA1c và nồng độ TG huyết tƣơng (p<0 05). ở lô chuột dùng với liều 100 mg/kg cân nặng có sự giảm đáng kể nồng độ HDL – cholesterol khi so với lô chứng (p<0,05) [8].
Từ các kết quả nghiên cứu an đầu về tác dụng hạ glucose huyết của cắn dịch chiết rễ cây Chóc máu Nam (S. cochinchinensis Lour.) và các tài liệu thu thập đƣợc về tác dụng trong điều trị đái tháo đƣờng của các loài cây thuộc chi Salacia, nghiên cứu n y đƣợc tiến hành nhằm bƣớc đầu thăm dò cơ chế hạ glucose huyết của cắn dịch chiết phân đoạn n-hexan rễ cây Chóc máu Nam (S. cochinchinensis Lour.). Nghiên cứu của chúng tôi tiến h nh đánh giá ảnh hƣởng của cắn dịch chiết rễ cây Chóc máu Nam tới khả năng thu nhận glucose vào trong tế o cơ vân C2C12 và thử nghiệm tác dụng của cắn dịch chiết này tr n đích tác dụng là phân tử adenosin monophosphat – activated protein kinase (AMPK).
4.1. Khả năn ây độc tế bào C2C12 củ PĐ
Trƣớc khi tiến h nh đánh giá tác dụng của dịch chiết phân đoạn n- hexan rễ cây Chóc máu nam (S. cochinchinensis L.) trên tế o cơ vân tiến hành thử nghiệm khả năng gây độc tế bào của dịch chiết này. Đây l thử nghiệm nhằm khảo sát khả năng gây độc của mẫu thử trên dòng tế bào cụ thể sẽ sử dụng trong các thí nghiệm tiếp theo đồng thời cũng l một trong những cơ sở để xem xét việc lựa chọn nồng độ mẫu thử khi đánh giá các tác dụng của mẫu thử này trên tế o đó.
Phƣơng pháp đánh giá khả năng gây độc tế o đƣợc sử dụng trong nghiên cứu n y l phƣơng pháp MTT (MTT assay).