kiểm tra chất lượng bạch phục linh phân phối tại thành phố huế

- Tác dụng dược lý: + Theo các tài liệu cổ và kinh nghiệm nhân dân Bạch phục linh cótác dụng lợi thủy, thẩm thấp, bổ tỳ, định tâm, dùng chữa tiểu tiện khó khăn,thủy thủng, tiết tả, phục

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo trong khoa Dược đã giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu tại trường

Đặc biệt, tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô Đào Thị Cẩm Minh đã tận tình chỉ bảo, quan tâm giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ trong Phòng Kiểm Nghiệm Thực Phẩm,Trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã động viên, khích lệ giúp tôi vượt qua khó khăn trong thời gian tôi thực hiện đề tài.

TT Huế, tháng 4 năm 2014

Trần Thị Nhật Linh

Tôi xin cam đoan các kết quả, số liệu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và do tôi thực hiện, không trùng lặp với bất kỳ luận văn nào trước đây.

Người cam đoan

Trần Thị Nhật Linh

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 TỔNG QUAN VỀ BẠCH PHỤC LINH 2

1.2 VÀI NÉT VỀ POLYSACHARIDE DẠNG β –GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH 4

1.3 CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHIDE 5

1.4 VÀI NÉT VỀ QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS 5

1.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP 7

Chương 2 10

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 10

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 10

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 11

2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 15

2.4 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 15

2.5 CÁC THUẬT TOÁN THỐNG KÊ 16

2.6 XỬ LÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 16

Chương III 17

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 17

3.1 KIỂM TRA THEO TIÊU CHUẨN DĐVN IV 18

3.2 KIỂM TRA HÀM LƯỢNG POLYSACCHARIDE DẠNG β –GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH 20

Chương 4 29

BÀN LUẬN 29

4.1 VỀ VIỆC THIẾT KẾ MẪU 29

4.2 VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

4.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG β-GLUCAN 31

4.4 VỀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 33

Chương 5 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

PHỤ LỤC 42

DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Bảng 2x2 các tần số quan sát O 17

Bảng 3.1 Bảng so sánh kết quả hai đợt thu mẫu 19

Bảng 3.2 Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ glucose 22

Bảng 3.3 Khảo sát độ chính xác của phương pháp 24

Bảng 3.4 Khảo sát độ đúng của phương pháp 25

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của β - glucan 4

Hình 2.1 Dược liệu Bạch phục linh 10

Hình 2.2 Hình ảnh soi bột Bạch phục linh dưới kính hiển vi 12

Hình 2.3 Máy UV-VIS (Jasco V-630) 16

Hình 2.4 Máy quay li tâm (EBA 21) 16

Hình 3.1 Hình ảnh soi bột mẫu số 20 18

Hình 3.2 Các phản ứng định tính của mẫu 13 19

Hình 3.3 Phổ hấp thụ của dung dịch D-glucose chuẩn-pp phenol sulfuric 22

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml) 22 Hình 3.5 Phổ đồ UV mẫu trắng 23

Hình 3.6 Phổ đồ UV mẫu dịch chiết Bạch phục linh không tạo màu 23

Hình 3.7 Phổ đồ UV của dung dịch D-glucose chuẩn có tạo màu 23

Hình 3.8 Phổ đồ UV của mẫu dịch chiết Bạch phục linh có tạo màu 23

Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml) 24 Hình 4.1 Hình ảnh soi bột mẫu 6 34

Hình 4.2 Các dạng sơ chế Bạch phục linh 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Nền Y học cổ truyền của Việt Nam có một lịch sử phát triển lâu dài vàphong phú Từ xưa, ông cha ta đã biết sử dụng nguồn dược liệu quý giá củađất nước để phòng bệnh và chữa bệnh Trải qua hàng ngàn năm lịch sử, từnhững kinh nghiệm do nhu cầu thực tiễn, số lượng dược liệu có nguồn gốc từthực vật và động vật được đưa vào làm thuốc ngày càng gia tăng

Trong đó, Bạch phục linh là một trong những dược liệu phổ biến, được

sử dụng trong y học từ lâu Theo các tài liệu cổ và kinh nghiệm dân gian,Bạch phục linh có tác dụng lợi thủy, thẩm thấp, bổ tỳ, định tâm, chữa tiểu tiệnkhó khăn, thủy thũng, trướng mán, tiết tả…[4] Các nghiên cứu về thành phầnhóa học cũng như tác dụng dược lý của của các hoạt chất trong dược liệu nàycho thấy rằng Bạch phục linh có khả năng tăng cường hệ miễn dịch, khángviêm, kháng khối u.[21], [13], [15]

Tuy nhiên, trên thị trường dược liệu này có nguy cơ không đảm bảo chấtlượng do giả mạo bằng các hóa chất, chế phẩm thay thế Theo kết quả kiểm

tra của Bộ Y tế vào năm 2012, Bạch phục linh trên thị trường được làm giả

khá nhiều, chủ yếu bằng calci carbonat [5], [2] Thêm vào đó, việc kiểm tra ởcác cơ sở khám chữa bệnh chỉ được thực hiện bằng cảm quan nên hiệu quảđiều trị của dược liệu không được đảm bảo [1] Nhằm giúp các nhân viên y tế,các nhà quản lý ngành y tế thành phố Huế có thêm thông tin về chất lượng

thuốc đông y trên địa bàn chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Kiểm tra chất lượng Bạch phục linh phân phối tại thành phố Huế” với mục tiêu :

• Kiểm tra chất lượng của Bạch phục linh theo tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV.

• Xây dựng quy trình định lượng polysaccharides dạng β-glucan trong Bạch phục linh.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ BẠCH PHỤC LINH

1.1.1 Vài nét về Bạch phục linh:

Bạch linh tên gọi khác là Phục linh, là thể quả nấm đã phơi hay sấy khô

của nấm Phục linh - Poria cocos (Schw.) Wolf, họ Nấm lỗ (Polyporaceae),

mọc ký sinh trên rễ một số loài Thông

• Phục linh bì: Là lớp ngoài Phục linh tách ra, lớn, nhỏ, không đồngnhất Mặt ngoài từ nâu đến nâu đen, mặt trong màu trắng hoặc nâu nhạt Chấttương đối xốp, hơi có tính đàn hồi

• Phục linh khối: sau khi tách lớp ngoài, phần còn lại được thái, cắtthành phiến hay miếng, lớn nhỏ không đồng nhất, màu trắng, hồng nhạt hoặcnâu nhạt

• Xích phục linh: Là lớp thứ hai sau lớp ngoài, hơi hồng hoặc nâu nhạt

• Phục thần: Là phần nấm Phục linh ôm đoạn rễ thông bên trong

• Bạch phục linh là phần bên trong màu trắng của thể nấm.

Nấm phục linh là loại nấm được trồng ở Trung Quốc và đã được sửdụng trong y học trong khoảng 2000 năm [6] Phục linh cũng như Bạch phụclinh không những được sử dụng trong các bài thuốc đông y sử dụng trên lâmsàng mà còn được sử dụng để nghiên cứu bào chế các sản phẩm thuốc chiếtxuất từ dược liệu Nhiều nhà y học trên thế giới đã bắt tay vào nghiên cứuthành phần hoạt tính, tác dụng dược lí và hiệu quả trị liệu của Bạch phục linh

- Thành phần hoá học: [6]Gồm 3 loại

+ Các acid có thành phần triterpen : Acid pachimic, acid tumolosic,acid eburicoic, acid pinicolic, acid 3β hydroxylanosta-7,9 , 24 trien, 21-oic

+ Các polysaccharide dạng β-glucan và heteropolysaccharides, trong

đó polysaccharide dạng β-glucan chiếm trên 90%

+ Ngoài ra còn có egosterol, histidin, cholin và rất ít men proteaza

- Tác dụng dược lý:

+ Theo các tài liệu cổ và kinh nghiệm nhân dân Bạch phục linh cótác dụng lợi thủy, thẩm thấp, bổ tỳ, định tâm, dùng chữa tiểu tiện khó khăn,thủy thủng, tiết tả, phục thần định tâm, an thần chữa mất ngủ.[6]

+ Một số nghiên cứu gần đây trên thê giới cho thấy Bạch phục linhchứa các hoạt chất có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch, kháng viêm, khángkhối u.[14], [17], [23]

Với những tác dụng trên, Bạch phục linh trở thành một một vị thuốcđược sử dụng phổ biến trong nhiều bài thuốc và có nhiều khả năng ứng dụngtrong điều trị các bệnh khó chữa Nhưng trong tình hình hiện nay dược liệunày đang ngày càng bị làm giả một cách tinh vi bằng một số chất như các loạitinh bột, calci carbonat… làm cho công tác điều trị bệnh trở nên khó khăn,thiếu hiệu quả

1.1.2 Chất lượng bạch phục linh trên thị trường

Bạch phục linh là dược liệu nhập hoàn toàn từ Trung Quốc Vì vậy, đây

là dược liệu khó kiểm soát chất lượng Trước đây loại dược liệu này thường bịlàm giả bằng bột sắn, gạo,…[5] nên muốn kiểm tra chất lượng chỉ cần chovào nước dược liệu sẽ bị nở ra

Nhưng theo một cuộc khảo sát chất lượng dược liệu của một số tỉnhthành của Vụ Dược Liệu vào năm 2012 cho thấy dược liệu Bạch phục linhđược làm giả chủ yếu bằng calci carbonat [2], người ta trộn một ít bột vụndược liệu Bạch phục linh với calci carbonat rồi đem dập thành các viên dạnghình khối vuông dẹt (Bạch phục linh thường được sơ chế thành dạng này), rấtkhó nhận biết bằng mắt thường, dược liệu này có thể có các phản ứng đặc

trưng của Bạch phục linh (được quy định trong Dược Điển Việt Nam IV) vì

có một lượng nhỏ dược liệu nhưng chắc chắn chất lượng không đám bảo chohiệu quả trị bệnh

1.2 VÀI NÉT VỀ POLYSACHARIDE DẠNG β –GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH

1.2.1 Đặc điểm

Polysaccharide trong Bạch phuc linh chủ yếu là dạng β –glucan – làhợp chất đường liên phân tử được tạo nên từ các đơn phân tử D-glucose gắnvới nhau qua liên kết β –glycoside ở vị trí 1,3 và 1,6

+ Có tác dụng tăng cường hệ miễn dịch do khả năng kích thích tạo ra

các tác nhân miễn dịch trong cơ thể [23],[15]

+ Tác dụng kháng viêm: do khả năng ảnh hưởng lên sự có mặt củaphospholipase (chất gây viêm) [15]

+ Tác dụng kháng khối u : gián tiếp tham gia vào quá trình tiêu diệt tếbào ung thư bằng cách kích hoạt hệ thống miễn dịch làm việc có hiệu suất vàhiệu quả cao để tiêu diệt các tế bào ung thư mà không gây hại cho các tế bàolành khác.[17]

1.3 CHIẾT XUẤT VÀ ĐỊNH LƯỢNG POLYSACCHIDE

Phương pháp chiết xuất:

Trong chiết xuất polysaccharide từ dược liệu, người ta thường sử dụng

phương pháp chiết nóng với các dung môi thích hợp:

+ Phương pháp chiết nóng: chiết dược liệu trong dung môi thích hợp ởnhiệt độ 80-100oC trong thời gian quy định, thu được dịch chiết, loại tạp [8]

Ngoài ra, để tăng cường hiệu suất chiết dược liệu, nhiều nhà nghiên cứu

đã áp dụng sóng siêu âm trong chiết xuất.[22]

Cơ chế tác động của sóng siêu âm trong ly trích: sử dụng sóng âmthanh có tần số và cường độ cao để truyền qua chất lỏng, giúp tăng cường sựxâm nhập của dung môi và nhiệt vào tế bào nguyên liệu do đó cải thiện tốtkhả năng truyền khối

+ Dung môi chiết xuất: thường sử dụng dung môi là nước dành cho các polysacchride tan, sử dụng dung dịch NaOH ở các nồng độ khác nhau (tùy

vào độ dài mạch và độ phân cực) cho các polysaccharide không tan trongnước, ngoài ra còn sử dụng acid acetic, phenol [12],[22]

Phương pháp định lượng:

Thường sử dụng phương pháp đo quang UV-Vis với thuốc thử sulfuric, chất chuẩn là các đường đơn.[16],[7],[8]

phenol-1.4 VÀI NÉT VỀ QUANG PHỔ HẤP THỤ UV-VIS

Phương pháp quang phổ tử ngoại khả kiến là phương pháp dựa trên khảnăng hấp thụ chọn lọc các bức xạ đi vào dung dịch của chất nghiên cứu trong

một dung môi nhất định.Trong công tác kiểm nghiệm phép đo phổ hấp thụ VIS có vai trò quan trọng trong phân tích định tính, thử tinh khiết và định lượng.

UV-1.4.1 Độ hấp thụ

Khi cho bức xạ đơn sắc đi qua một môi trường có chứa chất hấp thụ thì

độ hấp thụ của bức xạ tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ và chiều dày của môitrường hấp thụ Mối quan hệ tuân theo định luật Lambert-Beer và được biểudiễn theo phương trình sau:

► Điều kiện áp dụng định luật Lambert-Beer: Ánh sáng đơn sắc,

khoảng nồng độ tuyến tính, dung dịch phải trong suốt, chất thử phải bền trongdung dịch và dưới tác dụng ánh sáng UV-VIS

1.4.2 Các phương pháp định lượng

- Phương pháp đo phổ trực tiếp

Đo độ hấp thụ A của dung dịch, tính nồng độ C dựa vào giá trị độ hấpthụ riêng Để áp dụng phương pháp này, cần phải chuẩn hóa máy quang phổ

cả về bước sóng lẫn độ hấp thụ

A = E1%

1cm.L.C

A: độ hấp thụT: độ truyền qua

I0:cường độ ánh sáng đơn sắc tới I: cường độ ánh sáng đơn sắc sau khi truyền qua dung dịch K: hệ số hấp thụ L: chiều dày của lớp dung dịch C: nồng độ dung dịch

- Phương pháp đo phổ gián tiếp

Ở phương pháp này cần phải có chất chuẩn để so sánh, có thể khôngcần phải chuẩn hóa máy Các phương pháp gián tiếp:

+ Phương pháp so sánh

+ Phương pháp thêm chuẩn so sánh

+ Phương pháp đường chuẩn

+ Phương pháp thêm đường chuẩn

+ Phương pháp định lượng hỗn hợp

+ Kỹ thuật đo quang vi sai theo bước sóng

Trong đề tài này, chúng tôi chỉ trình bày phương pháp đường chuẩn.Phương pháp đường chuẩn là phương pháp được dùng phổ biến trongphân tích quang phổ Chuẩn bị một dãy chuẩn khoảng 5 dung dịch có cácnồng độ chất chuẩn CS khác nhau

+ Đo độ hấp thụ AS của dãy chuẩn và lập đồ thị của A theo C

+ Đo độ hấp thụ AX của dung dịch mẫu thử và dựa vào đường chuẩnxác định được nồng độ mẫu thử CX.

Khi xây dựng đường chuẩn nên khảo sát khoảng tuyến tính của nồng độvới hấp thụ Trường hợp dãy chuẩn không tuân theo định luật Lambert-Beer,cần làm thêm một số điểm chuẩn nữa với các nồng độ gần nhau hơn (khácnhau không quá 10%) Vẽ đồ thị đi qua các vị trí gần nhất với các điểm thựcnghiệm hoặc dựa vào bảng chuẩn để xây dựng phương trình hồi qui tuyến tínhhay phi tuyến tính, tính hệ số tương quan r (r ≥ 0.995 là tốt)

1.5 THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP

1.5.1 Khái niệm

Thẩm định một phương pháp phân tích là quá trình xác định bằngnghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phươngpháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng phân tích

thực tế Các đặc điểm phân tích đặc trưng: độ đúng, độ chính xác, độ chọnlọc, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, khoảng nồng độ tuyến tính.Ngoài ra có thể có những yêu cầu khác tùy theo loại phương pháp và đốitượng nghiên cứu.

Thẩm định phương pháp phân tích là một quá trình nhằm chứng minhrằng phương pháp phân tích đó đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phântích những mẫu được khảo sát [19], [10]

1.5.2 Nội dung thẩm định

- Tính chọn lọc

Tính chọn lọc của một phương pháp phân tích là khả năng phân biệt cácchất trong mẫu thử dùng khi tách và định lượng hai hay nhiều thành phầntrong một hỗn hợp của phương pháp đó

- Khoảng nồng độ tuyến tính

Khoảng nồng độ tuyến tính là sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng

đo được y và nồng độ đã biết x của chất phân tích trong một khoảng nồng độ xác định, được biểu thị bằng phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương

quan tuyến tính r Đường hồi quy phải có dạng đường thẳng và giá trị hệ số rphải không nhỏ hơn 0,995

- Độ chính xác

Độ chính xác của một phương pháp là kết quả thống nhất giữa kết quảriêng biệt khi quy trình phân tích được áp dụng lặp đi lặp lại nhiều lần trêncùng một mẫu đồng nhất, được biểu thị bằng độ lệch chuẩn (σ) hay độ lệchchuẩn tương đối (RSD%), hoặc sai số tương đối (εr%)

-Độ đúng

Độ đúng của một phương pháp phân tích là một mức độ gần sát của kếtquả phân tích với giá trị thực của chất phân tích Độ đúng có thể thay đổi từ 0-100% Đánh giá kết quả: Độ đúng được biểu thị bằng phần trăm của giá trị

trung bình so với giá trị thực Giá trị trung bình thu được sau khi phân tíchphải sai lệch không quá 5% so với giá trị thực.

- Giới hạn định lượng

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhấp trong mẫu thử có thểđịnh lượng được với tính đúng và tính chính xác chấp nhận LOQ được chấpnhận nếu đạt các điều kiện: Đáp ứng của chất phân tích phải ít nhất gấp 10 lầnđáp ứng của mẫu trắng; cực đại hấp thụ của chất phân tích phải thấy rõ, riêngbiệt và giá trị đáp ứng lặp lại với độ chính xác không được lớn hơn 2%

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu và địa điểm lấy mẫu

- Dược liệu Bạch phục linh được bán tại các nhà thuốc Bắc trên địabàn thành phố Huế

- Dược liệu Bạch phục linh được cấp phát tại các cơ sở khám chữabệnh y học cổ truyền tại thành phố Huế

Hình 2.1 Dược liệu Bạch phục linh 2.1.2 Số lượng mẫu nghiên cứu [9]

Cỡ mẫu được tính dựa vào sự khác biệt giữa số đo của mẫu và tham sốcủa quần thể theo công thức:

n = Trong đó: z là độ tin cậy 95% =1,96; p là tỷ lệ ước đoán của một nghiêncứu trước đó, p=0,15 (với tỷ lệ Bạch phục linh không đạt tiêu chuẩn là 15%[11]); e là mức chính xác mong muốn =0,08

Theo công thức, tôi tính được cỡ mẫu: n = 77

Do thời gian nghiên cứu ngắn và kinh phí thực hiện đề tài còn hạn hẹpnên tôi lấy cỡ mẫu nhỏ nhất là 77 mẫu để đạt được độ chính xác mong muốn.

2.1.3 Phương thức lấy mẫu

Theo thông tư số 04 /2010/TT-BYT ngày 12/02/2010 về việc hướng

dẫn việc lấy mẫu thuốc để xác định chất lượng thì số lượng mẫu cần lấy là 2

mẫu ở mỗi cơ sở, mỗi mẫu lấy 150g theo quy định của Dược điển Việt Nam

77 mẫu thuốc (mã hóa theo phụ lục ) được sắp xếp theo thời gian lấy mẫu,từng phường trong thành phố Huế Mỗi mẫu thuốc có đầy đủ thông tin về thờigian lấy mẫu và địa điểm lấy mẫu

Tiến hành thu mẫu trong 2 đợt vào tháng 9/2013 và thang 3/2014 đểthuận lợi cho việc so sánh sự ảnh hưởng của điều kiện thời tiết (nhiệt độ, độẩm) tại hai thời điểm thu mẫu đối với chất lượng Bạch phục linh

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

2.2.1 Kiểm tra chất lượng Bạch phục linh theo các tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam IV [2]

Soi bột

Màu trắng tro, có những khối sợi nấm dạng hạt không đều và những

khối phân nhánh, không màu, nhỏ dung dịch cloral hydrat, sẽ tan dần Soi

kính hiển vi thấy: sợi nấm không màu hoặc màu nâu nhạt, mảnh dẻ, nhỏ, dài,hơi cong, phân nhánh, đường kính 3-8 µm, ít khi có sợi nấm đường kính tới

- Nhỏ 2-3 giọt nước cất lên phiến kính

- Lấy ít tinh bột Bạch phục linh cần kiểm nghiệm bằng kim mũimác lên phiến kính

- Nghiền các hạt bột bằng kim mũi mác cho tới khi đều trong nước.

- Đậy lam kính lên trên giọt bột cần soi sao cho không đọng bọt khí

- Thấm nước thừa trên phiến kính bằng giấy thấm

- Đặt tiêu bản lên trên mâm kính cố định

- Soi kính bằng độ phóng đại 10x rồi 40x

Hình 2.2 Hình ảnh soi bột Bạch phục linh dưới kính hiển vi

1 2 Sợi nấm; 3 4 Sợi nấm hình khối Định tính

- Các phản ứng đặc trưng của Bạch phục linh:

A Lấy 1,0 g bột dược liệu, thêm 5 ml aceton (TT), đun hồi lưu trên

cách thủy 5 phút, thỉnh thoảng lắc, lọc Bốc hơi dịch lọc trên cách thuỷ đến

cạn Hoà tan cặn trong 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm 1 giọt acid sulfuric (TT), xuất hiện màu đỏ nhạt, sau chuyển thành màu xanh.

B Nhỏ 1 giọt dung dịch iod- iodid (TT) lên bột dược liệu sẽ có màu đỏ

thẫm

- Các phản ứng định tính phát hiện tạp chất :

+ Phản ứng phát hiện tinh bột: thêm dung dịch iod vào bột dượcliệu đem thử, xuất hiện màu xanh lam hay xanh tím Soi dưới kính hiển vi đểxác định các dạng tinh bột thường gặp ( tinh bột sắn, tinh bột gạo…)

+ Phản ứng định tính phát hiện calci carbonat:

A Thêm 5ml dung dịch acid acetic loãng (TT) vào 0,1g bột dược liệuđem thử, có sủi bọt khí carbon dioxyd Khí thoát ra được dẫn vào dung dịchcalci hydroxyd(TT) sẽ xuất hiện kết tủa trắng, tủa tan trong acid hydrocloric 7

M (TT) quá thừa

B Để yên dung dịch trên cho đến khi sủi bọt hết, thêm 2-3 giọt dungdịch amoni oxalat 4% (TT), phải xuất hiện tủa trắng, tủa này không tan dungdịch acid acetic 6 M, tan trong dung dịch acid hydrocloric loãng(TT)

+ Kiểm tra độ ẩm, tỷ lê vụn nát:

• Độ ẩm : Không quá 12,0 % ( Phụ lục 9.6, 1g, 105 oC, 5 giờ)

Sử dụng phương pháp sấy trong tủ sấy có áp suất thường :

- Cân bì chén cân có nắp mài đã sấy ở nhiệt độ 105oC trong vòng 30phút

- Cân ngay vào bì 1g dược liệu (sai số không quá ± 10%)

- Tiến hành làm khô trong điều kiện nhiệt độ 105oC trong tủ sấy có ápsuất thường trong thời gian 5 giờ

- Cho chén cân vào bình hút ẩm đến khi nguội rồi cân

- Độ ẩm (X%) của dược liệu tính theo công thức:

X% = (P – A)/P 100

Trong đó: P là số gam mẫu dược liệu trước khi sấy

A là số gam mẫu dược liệu sau khi sấy

• Tỷ lệ vụn nát: Tỷ lệ qua rây có kích thước mắt rây 3,150 mm:

không quá 5%

Cân 150g dược liệu đã được loại tạp chất Rây qua rây 3,150mm Cântoàn bộ dược liệu lọt qua rây Xác định tỷ lệ vụn nát (x%) của dược liệu theocông thức:

x% = a/p.100

Trong đó: a là khối lượng dược liệu cân ban đầu

p là khối lượng dược liệu lọt qua rây

2.2.2 Định lượng polysacchride dạng β-glucan trong Bạch phục linh: 2.2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích

Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng β-glucan trong Bạch

phục linh bằng quang phổ hấp thụ UV-VIS:

- Quy trình xử lý mẫu: xây dựng quy trình chiết mẫu, khử tạp chất

- Tiến hành phản ứng tạo màu: lựa chọn thuốc thử, khảo sát nồng độthuốc thử, thời gian phản ứng, điều kiện phản ứng

- Xác định cực đại hấp thụ của dung dịch phân tích

- Xây dựng phương trình hồi quy: lựa chọn khoảng nồng độ tuyến tính,

có mật độ quang nằm trong khoảng 0,2-0,8

Từ những khảo sát trên, xây dựng hoàn chỉnh quy trình

Chuẩn bị 4 mẫu dung dịch, mỗi mẫu làm song song 2 lần:

- Mẫu 1: nước cất, tạo màu

- Mẫu 2: dung dịch D-glucose chuẩn, tạo màu

- Mẫu 3: dịch chiết Bạch phục linh

- Mẫu 4: dịch chiết Bạch phục linh, tạo màu

So sánh phổ đồ các mẫu phân tích

► Khoảng nồng độ tuyến tính:

Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng bằng nước cất thành các dung dịchC1→C5, tạo màu, đo độ hấp thụ dãy dung dịch tại λmax

Thiết lập mối tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ quangtrong khoảng nồng độ khảo sát, thể hiện bằng đường hồi qui tuyến tính và hệ

2.3 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Các mẫu nghiên cứu được thu thập, mã hóa, mô tả và tiến hành kiểmtra tại Khoa Dược – Trường Đại Học Y Dược Huế

- Thời gian nghiên cứu : từ tháng 9/2013 đến tháng 5/2014

2.4 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

2.4.1 Hóa chất:

- Chất chuẩn D-glucose (Merck-Đức)

- H2SO4 đậm đặc, phenol (Trung Quốc)

2.4.2 Thiết bị:

- Máy UV-VIS

- Cân phân tích (Mettler Toledo AB 204-S)

- Máy quay li tâm (EBA 21)

- Các dụng cụ thủy tinh đạt tiêu chuẩn thí nghiệm

Hình 2.3 Máy UV-VIS (Jasco V-630)

Hình 2.4 Máy quay li tâm (EBA 21) 2.5 CÁC THUẬT TOÁN THỐNG KÊ

- Giá trị trung bình:

- Độ lệch chuẩn:

- Độ lệch chuẩn tương đối: RSD% = SD/ x 100

2.6 XỬ LÝ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

- Số liệu được xử lý theo phương pháp thống kê, sử dụng phần mềm Excel

- Đối với biến định tính, so sánh tỉ lệ bằng test χ2 (sự khác biệt có ý

nghĩa thống kê khi p<0,05) và test t (với xác suất 95%)

- m1,m2 là giá trị trung bình của mẫu thứ nhất và mẫu thứ hai

- S1, s2 là độ lệch chuẩn của mẫu thứ nhất và mẫu thứ hai

- n1, n2 là cỡ mẫu của mẫu thứ nhất và thứ hai

Chương III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 KIỂM TRA THEO TIÊU CHUẨN DĐVN IV

3.1.1 Soi bột:

Kết quả soi bột: trong 77 mẫu đem soi có 73 mẫu đạt tiêu chuẩn về

soi bột Bạch phục linh của Dược Điển Việt Nam IV [4]

Hình 3.1 Hình ảnh soi bột mẫu số 20

Có 4 mẫu là mẫu 6,16, 51,55 khi soi bột có đặc điểm khác với các mô

tả trong Dược Điển

Kết luận: có 4 mẫu trên tổng số 77 mẫu khảo sát không đạt tiêu chuẩn

Dược Điển Việt Nam về soi bột

3.1.2 Định tính

Phản ứng định tính đặc trưng của dược liệu Bạch phục linh:

 Kết quả: trong 77 mẫu đem thử có 61 mẫu đạt tiêu chuẩn về địnhtính theo Dược Điển Việt Nam

Kiểm tra độ ẩm của dược liệu:

 Kết quả: trong 77 mẫu đem thử có 12 mẫu không đạt tiêu chuẩn về

độ ẩm theo Dược Điển Việt Nam là các mẫu: 1, 6, 7, 8, 12, 19, 20, 37, 38, 39,

41, 54, 74

Kiểm tra tỷ lệ vụn nát của dược liệu:

 Kết quả: không có dược liệu nào trong 77 mẫu dược liệu đem khảosát có tỷ lệ vụn nát không đạt tiêu chuẩn của Dược Điển Việt Nam

Kết quả chung:

- Sau khi khảo sát chất lượng của 77 mẫu dược liệu Bạch phục linh

theo tiêu chuẩn của Dược Điển Việt nam IV, kết quả có 21/77 mẫu không đạt

Số mẫukhông đạt

Tổng Tỷ lệ đạt