GLUCAN TRONG BẠCH PHỤC LINH
3.2.1. Xây dựng phương pháp:
3.2.1.1. Xử lý mẫu, chiết xuất dược liệu:
- Sau khi thu mẫu, mẫu được kiểm tra chất lượng bằng các tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV, nếu kết quả kiểm tra mẫu là đạt mới tiến hành bước định lượng. Vậy tiến hành định lượng trên 56 mẫu dược liệu Bạch phục linh.
- Dược liệu Bạch phục linh được xay nhỏ thành bột và bảo quản nơi khô ráo.
- Chiết 5 g dược liệu nhiều lần bằng NaOH 0,5N trên bếp cách thủy điều nhiệt ở 800C đến khi dịch chiết âm tính với thuốc thử phenol-sulfuric [12].
- Kết tủa hoàn toàn polysaccharid bằng ethanol 960. - Siêu ly tâm để thu được tủa.
- Rửa tủa nhiều lần bằng ethanol 800 và nước.
- Cô quay trong chân không thu được cao polysaccharid toàn phần [6]. - Tiến hành khảo sát nồng độ pha loãng của cao dựa trên các điều kiện đo và số liệu đo. Tỷ lệ pha loãng cao phù hợp là n=5000
3.2.1.2. Phương pháp định lượng
Chúng tôi lựa chọn phương pháp định lượng β-glucan bằng quang phổ UV-VIS vì phương pháp này thích hợp để định lượng mẫu mà hàm lượng chất phân tích thấp, cho kết quả chính xác, phù hợp với điều kiện cơ sở vật chất của Khoa.
Sau khi tham khảo tài liệu và khảo sát sơ bộ, chúng tôi tiến hành thực hiện phân tích định lượng bằng phương pháp Dubois - đo mật độ quang dựa trên phản ứng tạo màu với phenol- acid sulphuric, dùng D-Glucose làm chất chuẩn [23].
Khảo sát điều kiện đo:
Sau khi tiến hành thực nghiệm tại Khoa Dược, chúng tôi thực hiện ở điều kiện đo như sau:
Chất tạo màu: dung dịch phenol 5%
Tỷ lệ các chất: cho 1ml dung dịch chất phân tích (đã pha loãng), 1ml phenol 5%, 5ml H2SO4 đậm đặc.
Thực hiện phản ứng: cho vào cốc nước sôi 2 phút, làm lạnh và ổn định ở nhiệt độ phòng 45 phút.
3.2.1.3. Xây dựng đường chuẩn
Sau khi khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính, chúng tôi tiến hành thiết lập dãy nồng độ chuẩn như sau: Cân chính xác 0,1000g D-glucose chuẩn hòa tan và định mức bằng nước cất thành 100ml, được dung dịch D-glucose 1mg/ml (1000µg/ml).
Từ dung dịch chuẩn gốc pha thành các dung dịch có nồng độ 30; 45; 60; 75; 90; 105µg/ml. Mỗi mẫu lấy 1ml, thêm 1ml dung dịch phenol 5% và 5ml dung dich H2SO4 đậm đặc, lắc đều. Đặt các ống nghiệm vào cốc nước sôi trong 2 phút, làm lạnh ở nhiệt độ phòng trong 45 phút.
Tiến hành quét phổ dung dịch ở nồng độ 55µg/ml từ bước sóng 600nm đến 400nm, thu được phổ đồ hấp thụ trong hình :
Hình 3.3. Phổ hấp thụ của dung dịch D-glucose chuẩn-pp phenol sulfuric Bảng 3.2. Sự phụ thuộc của độ hấp thụ vào nồng độ glucose
STT PP phenol-sulfuric Nồng độ (µg/ml) Độ hấp thụ (A) 1 30 0,2546 2 45 0,3776 3 60 0,4986 4 75 0,6246 5 90 0,7396 6 105 0,8646
Phương trình hồi qui: y= 0,0081x + 0,012 R=0,9999
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml)
Vậy :
- Đã xây dựng được phương trình hồi qui trong khoảng nồng độ: 30- 105µg/ml đối với phương pháp định lượng.
3.2.2. Thẩm định phương pháp 3.2.2.1. Tính chọn lọc:
Tiến hành phản ứng và quét phổ 4 mẫu dung dịch sau: - Mẫu 1: NaOH 0,5N, tạo màu.
- Mẫu 2: dịch chiết từ Bạch phục linh.
- Mẫu 3: dung dịch D-glucose chuẩn, tạo màu. - Mẫu 4: dịch chiết từ Bạch phục linh, tạo màu.
Mẫu 1
Hình 3.5. Phổ đồ UV mẫu trắng
Mẫu 2
Hình 3.6. Phổ đồ UV mẫu dịch chiết Bạch phục linh không tạo màu
Mẫu 3
Hình 3.7. Phổ đồ UV của dung dịch D-glucose chuẩn có tạo màu
Mẫu 4
Hình 3.8. Phổ đồ UV của mẫu dịch chiết Bạch phục linh có tạo màu
Nhận xét: mẫu trắng và mẫu dịch chiết Bạch phục linh chưa tạo màu không có cực đại hấp thụ tại 490 nm, trong khi đó mẫu dung dịch chuẩn và mẫu dịch chiết Bạch phục linh đã tạo màu đều có cực đại hấp thụ tại 490 nm chứng tỏ
bước sóng 490 nm đặc trưng riêng cho chất cần phân tích, tương tự với kết quả nghiên cứu của tài liệu [16]. Vậy phương pháp có tính chọn lọc cao.
3.2.2.2. Tính tuyến tính: Với các dung dịch chuẩn D-glucose có nồng độ khác nhau trong khoảng từ 30 đến 105 μg/ml, thực hiện phản ứng màu và đo mật độ quang ở bước sóng 490nm, nhận thấy rằng trong khoảng nồng độ từ 30 đến 105μg/ml có sự phụ thuộc tuyến tính của mật độ quang vào nồng độ dung dịch. Ta có phương trình hồi quy tuyến tính trong khoảng nồng độ này: y = 0,0081x + 0,012 với hệ số tương quan R2=0,9999.
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn khoảng tuyến tính của nồng độ D-glucose chuẩn (µg/ml)
3.2.2.3.Đ ộ chính xác:
Chuẩn bị 6 mẫu dung dịch chất thử và tiến hành tạo màu, quét phổ, đo quang. Tính RSD% nồng độ tìm lại.
Bảng 3.3. Khảo sát độ chính xác của phương pháp
Mẫu đo Độ hấp thu Hàm lượng (%)
1 0,2139 100,40
3 0,2130 99,95 4 0,2131 100 5 0,2139 100,40 6 0,2125 100,70 Trung bình: 100,16% RSD = 0,43% Độ chính xác nằm trong giới hạn cho phép.
3.2.2.4.Độ đúng: Cho vào dung dịch mẫu thử một lượng chất chuẩn là
20µg/ml, tiến hành phân tích hàm lượng polysaccharide trong 6 mẫu dung dịch chất thử có thêm chuẩn, kết quả được trình bày như sau:
Bảng 3.4. Khảo sát độ đúng của phương pháp
Mẫu đo Lượng mẫu (µg) Lượng chuẩn thêm vào (µg) Lượng tìm thấy (µg) Tỷ lệ phục hồi (%) 1 26,2 20 19,9 99,5 2 26,2 20 19,4 97,0 3 26,2 20 19,3 96,5 4 26,2 20 19,7 98,5 5 26,2 20 19,3 95,0 6 26,2 20 20,2 101,0 Trung bình 98,33 RSD (%) 1,7
Kết quả cho thấy phương pháp có độ đúng cao (tỷ lệ phục hồi là 98,33%) với RSD là 1,8%, phù hợp với yêu cầu chung về đánh giá độ đúng trong phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất trong dược liệu.
3.2.2.5.Giới hạn định lượng(LOQ): Chuẩn bị dãy các dung dịch có nồng độ thấp dần 40, 30, 20, 10 µg/ml chất chuẩn D-glucose. Mỗi nồng độ tiến hành làm 6 lần song song. Tạo màu và tiến hành đo quang. Tính RSD% nồng độ tìm lại.
-Nhận xét: Kết quả cho thấy ở nồng độ 20 µg/ml phổ đồ vẫn có cực đại hấp thụ tại 490nm với mật độ quang A gấp hơn 10 lần so với mẫu trắng, có độ chính xác cao (RSD(%) ≤ 2%). Ở nồng độ 10µg/ml, mật độ quang rất thấp, RSD > 2%.
Vậy LOQ = 20µg/ml.
3.2.3 Áp dụng phương pháp đã xây dựng định lượng β –Glucan trong các mẫu Bạch phục linh
Sau khi xây dựng phương pháp, chúng tôi áp dụng định lượng hoạt chất β-glucan trong các mẫu dược liệu Bạch phục linh , kết quả được trình bày trong bảng :
Bảng 3.5. Kết quả định lượng β-glucan trong các mẫu Bạch phục linh phân phối tại Thành Phố Huế
STT của mẫu (phụ lục) Lượng dược liệu (g) Lượng cao polysaccharide (%) (so với dược liệu khô)
Hàm lượngβ- glucan (%) (so với
dược liệu khô)
2 5 24,32 3,62 3 5 27,73 7,87 4 5 35,47 9,02 5 5 23,05 9,53 9 5 7,46 1,40 11 5 12,94 1,32 13 5 25,62 3,99 14 5 30,76 9,05 15 5 22,15 2,99 17 5 27,18 9,04 18 5 26,17 4,04 21 5 27,35 3,84 22 5 19,28 4,46 23 5 31,56 9,12 24 5 30,52 9,32 25 5 22,12 5,36 26 5 28,89 9,05 27 5 18,46 3,31 28 5 19,96 3,37 29 5 26,01 9,05 30 5 24,56 4,45 31 5 25,22 9,25 32 5 32,40 8,34 34 5 19,26 3,37
35 5 27,36 9,31 40 5 23,29 3,78 42 5 27,98 6,01 43 5 35,78 9,66 44 5 18,45 3,12 45 5 23,05 5,56 46 5 28,86 9,11 47 5 31,49 9,27 48 5 21,92 5,01 49 5 42,56 9,32 50 5 22,86 4,44 53 5 36,01 9,38 56 5 21,37 3,46 57 5 24,13 6,42 58 5 28,96 9,12 59 5 21,26 5,32 60 5 25,13 6,67 61 5 33,89 9,11 62 5 9,32 2,32 63 5 28,82 6,37 65 5 25,89 7,82 66 5 13,48 1,72 67 5 36,72 9,13 68 5 25,15 4,95 69 5 32,36 9,45 70 5 18,76 5,52 71 5 32,46 9,29 72 5 40,18 8,59 73 5 45,52 9,47 75 5 25,56 7,56 76 5 27,18 9,36 77 5 25,15 9,12 Nhận xét:
- Hàm lượng β-glucan của các mẫu đem khảo sát có sự chênh lệch lớn (từ 1,32-9,66%)
- Hàm lượng β-glucan trung bình của tất cả các mẫu được định lượng là
Hàm lượng β-glucan trung bình của các mẫu dạng phiến hình khối vuông dẹt (phụ lục) là 6,09%.
Hàm lượng β-glucan trung bình trong các mẫu dạng hình khối lớn và
phiến lát mỏng (phụ lục) là 8,12%.
- So sánh giá trị trung bình của hàm lượng β-glucan của các mẫu Bạch phục linh dạng phiến hình khối vuông dẹt so với 2 dạng hình khối và phiến lát mỏng bằng test t:
Ta có t= 2,58>2,01 cho thấy có sự khác biệt giữa giá trị trung bình hàm lượng β-glucan trong Bạch phục linh ở các dạng trên. Nói cách khác,hàm lượng β-glucan trung bình trong 2 dạng hình khối và phiến lát mỏng là 8,12% lớn hơn dạng phiến hình khối vuông dẹt là 6,09% .
- Có khoảng 41,07 % trong tổng số 56 mẫu dược liệu đạt tiêu chuẩn về hàm lượng theo tài liệu. [25]
Kết luận chung: sau khảo sát 77 mẫu dược liệu thì có 23 mẫu dược liệu đạt tiêu chuẩn về Dược Điển Việt nam IV [3] và tiêu chuẩn về hàm lượng hoạt chất β-glucan [25], chiếm tỷ lệ 29,87%.
Chương 4 BÀN LUẬN
ơ