- Hiện nay trên thị trường Việt Nam Bạch phục linh hầu hết vẫn được nhập từ Trung Quốc nên chất lượng khó đảm bảo, thực tế đã cho thấy Bạch phục linh được làm giả mạo rất tinh vi nên việc sử dụng các bước định tính thông thường trong Dược Điển Việt Nam IV để tiêu chuẩn hóa dược liệu này trở nên khó khăn hơn.
- Yêu cầu hiện nay cần phải xây dựng một quy trình xác định hàm lượng các hoạt chất chiếm tỷ lệ và hoạt tính sinh học cao trong Bạch phục linh để làm cơ sở cho các hoạt động kiểm tra chất lượng Bạch phục linh được tốt hơn.Vì vậy chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình chiết xuất và định lượng hàm lượng polysaccharde dạng β-glucan trong Bạch phục linh. Từ đó áp dụng định lượng cho các mẫu Bạch phục linh phân phối tại thành phố Huế.
4.3.1Mẫu đinh lượng:
- Vì Bạch phục linh trên thị trường khó đảm bảo chất lượng, để tránh trường hợp định lượng các mẫu dược liệu hoàn toàn không có khả năng dùng làm thuốc gây hao tổn về công sức, hóa chất, thiết bị, chúng tôi chỉ tiến hành định lượng trên các mẫu dược liệu đã đạt các tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam IV.
- Qua quá trình thực hiện các bước kiểm tra theo tiêu chuẩn Dược Điển chúng tôi tiến hành định lượng trên 56 mẫu dược liệu trong tông số 77 mẫu .
4.3.2. Xử lý mẫu, chiết xuất dược liệu:
- Dược liệu Bạch phục linh dưới dạng phiến hoặc dạng miếng phải được giã nhỏ thành bột để đảm bảo hiệu suất cho quá trình chiết xuất.
- Lựa chọn dung môi chiết xuất: polysaccaride dạng β-glucan trong Bạch phục linh tan được trong một số dung môi như dung dịch kiềm, Cadoxen, dung dịch ethylendiamin bão hòa trong cadmium oxyd [16]. Qua nghiên cứu các tài liệu chúng tôi tiến hành lựa chọn dung môi chiết xuất là NaOH 0,1N, đây là loại dung môi dễ kiếm, rẻ tiền, không gây độc hại.
- Phương pháp chiết xuất:
+ Qua tìm hiểu tài liệu cũng như tiến hành nghiên cứu chúng tôi thấy rằng sử dụng phương pháp chiết nóng đem lại hiệu suất cao, thời gian chiết ngắn.[10]
+ Để đảm bảo hiệu suất chiết xuất cao, chúng tôi tiến hành chiết nhiều lần bằng dung môi, trong quá trình chiết xuất chúng tôi tiến hành lấy dịch chiết để định tính với thuốc thử, chỉ khi dịch chiết âm tính với thuốc thử mới dừng chiết, bỏ bã dược liệu và gộp các dịch chiết lại. Quá trình chiết này đã loại được các chất béo trong dược liệu, triterpenoid...
+ Tiến hành cô dịch chiết thu được rồi cho kết tủa hoạt chất bằng cồn 96o, rồi rửa lại nhiều lần bằng cồn 80o thu được cao dược liệu, cao dược liệu này chứa hầu hết polysacchride dạng β-glucan , ngoài ra còn một số tạp chất cũng bị kết tủa trong cồn như các polyphenol...
4.3.3. Điều kiện định lượng
Các điều kiện thực hiện phản ứng màu được đưa ra: thuốc thử, khảo sát nồng độ thuốc thử, thời gian phản ứng, điều kiện phản ứng.
Chúng tôi đã lựa chọn phương pháp tạo màu phenol-sulfuric sau khi tham khảo về các tài liệu định lượng polysacchride [10],[18]. Đây là phương pháp định lượng đã được sử dụng từ lâu nên có độ tin cậy cao.
Điều kiện đo thực nghiệm trên mẫu theo tài liệu [13], [18]. Kết quả, điều kiện đo ở tài liệu [13] có thể thực hiện được trên mẫu của đề tài, nhưng
có sự thay đổi, đó là tăng thời gian ổn định mẫu lên 45 phút (tài liệu [13] là 30 phút), vì sau 30 phút dung dịch vẫn còn ấm, độ hấp thụ chưa thật ổn định.
4.3.4. Thẩm định phương pháp
Để đảm bảo phương pháp phân tích định lượng cho ra những kết quả chính xác thì phép định lượng cần được thẩm định theo quy định chung về thẩm định phương pháp quang phổ hấp thụ UV-VIS với các tiêu chí sau:
Tính chọn lọc:
Phổ đồ hấp thụ mẫu chuẩn và mẫu dịch chiết Bạch phục linh có tạo màu có cực đại tại 490 nm, phổ đồ của mẫu trắng và mẫu dịch chiết Bạch phục linh chưa tạo màu không có cực đại hấp thụ nào trong vùng bức xạ 600- 400nm. Kết quả cho thấy phương pháp có tính chọn lọc cao.
Khoảng nồng độ tuyến tính
Mối tương quan giữa nồng độ glucose và độ hấp thụ là chặt chẽ trong khoảng nồng độ 30-105 µg/ml với hệ số tương quan là 0,9999 (lớn hơn 0,995) đáp ứng yêu cầu phân tích. Đường chuẩn xây dựng từ 30µg/ml đến 105µg/ml là đáp ứng với yêu cầu thực tế khi định lượng polysaccharide dạng β-glucan trong các mẫu Bạch phục linh.
Độ chính xác
Kết quả khảo sát cho độ chính xác cao với độ lặp lại đại diện bởi độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) là 0,43% (nhỏ hơn 2%).
Độ đúng
Độ đúng được biểu thị phần trăm tìm lại trung bình của lượng chuẩn thêm vào đạt từ 98,33% (nằm trong khoảng 95 đến 105%), đáp ứng yêu cầu độ đúng trong phân tích định lượng.