Tài liệu này dành cho sinh viên, học viên nghiên cứu và tham khảo làm đề tài tốt nghiệp, báo cáo và khóa luận tốt nghiệp hoặc tham khảo làm luận văn tại các trường trung cấp cao đẳng, đại học trên cả nước
Mục Lục Mục Lục 1 DANH SÁCH CÁC BẢNG 3 DÁNH SÁCH CÁC HÌNH 4 Chương 1 5 MỞ ĐẦU 5 1.1 Đặt vấn đề 5 1.2 Mục đích và yêu cầu 6 1.2.1 Mục đích 6 1.2.2 Yêu cầu 6 Chương 2 7 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7 2.1 Đại cương về E. coli và coliformss 7 2.1.1 Đại cương về E. coli 7 2.1.2 Đại cương về coliforms [2, 6, 12] 11 2.2 Giới thiệu đại cương về tôm sử dụng trong chế biến thực phẩm [10, 3] 12 2.2.1 Thành phần hóa học và giá trị dinh dưỡng 12 2.2.3 Ảnh hưởng của việc nhiễm vi sinh vật [1, 6] 15 Chương 3 17 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện 17 3.1.1 Thời gian: 17 3.1.2 Địa điểm: 17 3.2 Vật liệu 17 3.2.1 Mẫu 17 3.2.2 Thiết bị và dụng cụ 17 3.3 Môi trường và thuốc thử 18 3.3.1 Môi trường 18 3.3.2 Thuốc thử : 21 3.4 phương pháp thí nghiệm 22 3.4.1 Phương pháp pha loãng theo dãy thập phân 22 3.4.2 Kỹ thuật lấy mẫu 22 3.4.3 Kỹ thuật chuẩn bị ống thạch nghiêng và đổ đĩa 23 3.4.4. Kỹ thuật cấy giống 23 3.4.5 Kỹ thuật cấy phân lập 24 3.5 Phương pháp phân tích 24 3.5.1 Định lượng Coliorms bằng phương pháp điếm khuẩn lạc 24 3.5.2 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 27 3.5.3 Phương pháp định tính E. coli 29 Chương 4 31 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1 Xác định mật độ coliforms trong dịch tăng sinh và giới hạn phát hiện E. coli khi thực hiện trên chủng vi sinh vật thuần khiết 31 4.1.1 Phân lập chủng 31 4.1.2 Xác định mật độ Coliforms trong các độ pha loãng 33 4.1.3 Xác định giới hạn định tính E. coli 34 4.2 Xác định khả năng đinh lượng các dòng coliforms và khả năng định tính E. coli trên sản phẩm thủy hải sản 35 1 4.2.1 Xác định khả năng định lượng các dòng coliforms khác nhau trên sản phẩm tôm Amaebi 35 4.2.2 Xác định khả năng định tính E. coli trên sản phẩm tôm Amaebi 36 4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của việc đông lạnh mẫu đến kết quả đinh lượng Coliforms và định tính E. coli 37 4.3.1 Ảnh hưởng của sự đông lạnh mẫu đến kết quả định lượng coliforms 38 4.3.2 Ảnh hưởng của sự đông lạnh mẫu đến kết quả định tính E. coli 39 Chương 5 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 39 5.1 Kết luận 39 5.2 Đề nghị 40 2 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Biểu hiện sinh hóa của E. coli 9 Bảng 2.2: Đặc điểm sinh hóa của các giống trong nhóm coliforms phân 12 Bảng 4.1: Biểu hiện sinh hóa của 3 chủng Coliforms được phân lập 31 Bảng 4.2. Kết quả định lượng các chủng thuần C1 và C2 trong các độ pha loãng 33 Bảng 4.3: Kết quả phát hiện E. coli trong các độ pha loãng khác nhau 34 Bảng 4.4: Kết quả định lượng chủng C1 và C2 sau khi nhiễm vào sản phẩm tôm Amaebi 35 Bảng 4.5: Kết quả định tính E. coli sau khi nhiễm vào sản phẩm tôm Amaebi 36 Bảng 4.6. Kết quả định lượng chủng C1 và C2 38 Bảng 4.7. Kết quả khảo sát sự định tính E. coli trong tôm Amaebi đông lạnh và không đông lạnh 39 3 DÁNH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Hình dạng E. coli bắt màu hồng nhìn dưới kính hiển vi điện tử 8 Hình 2.3: Vi khuẩn E. coli biểu hiện dương tính trong môi trường BGBL 9 Ống 1 (+), Ống 2 (-) 9 12 Hình 2.4: Hình dạng Coliforms nhìn dưới kính hiển vi điện tử 12 Hình 3.1: Hình dạng Coliforms trên môi trường VRB 26 Hình 3.2: Hình dạng E. coli trên môi trường EMB 28 Hinh 3.3: Kết quả thử nghiệm sinh hóa E. coli 29 Hình 4.1: Các thử nghiệm sinh hoá trong nghiệm pháp IMViC 32 Ống 1(Indol), Ống 2 (MR), Ống 3 (VP), Ống 4 (Citrate) 32 Hình 4.2: Dấu hiệu dương tính E. coli trong môi trường tăng sinh sinh chọn lọc BGBL ống 1, 2, 3 , 4 (+), ống 5 (-) 37 Biểu đồ 4.1: Kết quả định lượng Coliforms trong mẫu đông lạnh và không đông lạnh 38 4 Chương 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Trong thời đại ngày nay, mọi quốc gia trên thế giới đều xem việc kiểm soát chất lượng ATVSTP là mối quan tâm hàng đầu, vì chất lượng thực phẩm nói chung, ATVSTP nói riêng, không những có ảnh hưởng trực tiếp đến tình trạng sức khỏe của con người, mà còn là nguồn động lực quyết định sự phát triển của toàn nhân loại, có liên quan mật thiết đến sự phồn vinh của nền kinh tế và sự hưng thịnh của các hoạt động: thương mại, văn hóa, an ninh, chính trị, xã hội và đối với sự trường tồn của một quốc gia. Các loại thực phẩm có chất lượng cao, cân đối dinh dưỡng, an toàn về mặt vệ sinh, sẽ là tiền đề vô cùng quan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe cho con người nói riêng và quá trình phát triển một đất nước nói chung. Từ đó cho thấy, chất lượng thực phẩm, đặc biệt là chất lượng an toàn thực phẩm về phương diện Vi sinh vật luôn là một trong những vấn đề được nhà nước cũng như các bộ ngành hết sức quan tâm, đặc biệt hơn là ở người tiêu dùng. Một trong những chỉ tiêu mà chúng ta đang quan tâm hiện nay là số lượng E. coli và coliforms có trong thực phẩm nói chung và thực phẩm từ thủy hải sản nói riêng, với sự hiện diện một số lượng nhất định của chúng trong thực phẩm, sẽ phản ánh thực phẩm đó mất an toàn cho người sử dụng. Vì vậy phương pháp dùng trong phân tích các vi sinh vật này cần phải cho kết quả chính xác. Do đó việc nghiên cứu đánh giá hiệu quả phân tích của phương pháp dùng trong quá trình kiểm tra là một việc làm có ý nghĩa thực tiễn, nhằm để xác định được mức độ tin cậy của phương pháp mà các phòng thí nghiệm đang sử dụng. Xuất phát từ những vấn đề trên và được sự đồng ý của Bô môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Nông lâm, TP. HCM cùng với sự hướng dẫn của thầy ThS. Nguyễn Tiến Dũng, chúng tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp với đề tài: “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÂN TÍCH E. COLI VÀ COLIFORMS TRONG THỦY HẢI SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY” 5 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích Đề tài nhằm góp phần tìm hiểu và đánh giá hiệu quả phân tích E. coli và Coliforms trong THS bằng phương pháp nuôi cấy. Đây là một trong những phương pháp được các phòng thí nghiệm sử dụng hiện nay. 1.2.2 Yêu cầu Nội dung khoá luận nhằm: - Xác định giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện của phương pháp phân tích E. coli và coliforms. - Xác định khả năng định lượng các dòng coliforms khác nhau và định tính E. coli trên sản phẩm tôm Amaebi. - Khảo sát sự ảnh hưởng của việc đông lạnh mẫu đến kết quả đinh lượng coliforms và định tính E. coli 6 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương về E. coli và coliformss 2.1.1 Đại cương về E. coli 2.1.1.1 Lịch sử phát hiện và vị trí phân loại - Lịch sử phát hiện [5, 7] Năm 1885, vi khuẩn do Theodor Escherich phát hiện từ trong tã lót của các trẻ em bị bênh tiêu chảy và được đặt tên đầu tiên là Bacterium colicommune. Năm 1889, vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người có công khám phá. Năm 1895, chúng được liệt kê vào giống Bacillus. Năm 1896, chúng được đặt tên là Bacterium coli. Sau nhiều tên gọi khác nhau, đến năm 1991, vi khuẩn này được định danh thống nhất toàn cầu. Escherichia coli và đây cũng là tên khoa học - Vị trí phân loại: [8] Vi khuẩn Escherichia coli có vị trí phân loại như sau: • Ngành: Proteobacteria. • Lớp: Gamma Proteobacteria. • Bộ: Enterobacteriales. • Họ: Enterobactericeae. • Giống: Escherichia. • Loài: E. coli. - Đặc điểm phân bố: [2, 5] Vi khuẩn E. coli có nhiều trong đường ruột của động vật ăn thịt, ăn tạp hơn là động vật ăn cỏ. Ngoài ra vi khuẩn này có thể tồn tại và phân bố rộng rãi ngoài môi trường tự nhiên, vì loài vi khuẩn này có thể sống được trong bụi, phân, nước từ vài tuần đến vài tháng. Do sự phân bố rộng rãi trong tự nhiên nên E. coli dễ dàng nhiễm vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sản xuất, chế biến. 7 2.1.1.2 Đặc điễm hình thái [7, 11] E. coli là trực khuẩn hình gậy nhỏ, gram âm bắt màu hồng, kích thước dài hay ngắn tùy thuộc vào môi trường nuôi cấy trung bình 2 - 3 x 0,5µm, hai đầu tròn, có lông quanh tế bào, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn, di động không hình thành nha bào, trong bệnh phẩm có khi bắt màu lưỡng cực hai đầu. Hình 2.1: Hình dạng E. coli bắt màu hồng nhìn dưới kính hiển vi điện tử 2.1.1.3 Đặc điểm nuôi cấy E. coli là vi khuẩn hiếu khí và kị khí tùy tiện, nhiệt độ phát triển thích hợp nhất là 37 0 C, pH thích hợp là 7,2 - 7,4 nhưng cũng có thể phát triển ở 44 0 C. Mọc tốt trên môi trường dinh dưỡng thông thường, chịu được nhiệt độ biến thiên từ 4 - 45 0 C. Đặc điểm phát triển trên môi trường chuyên biệt: [6, 8] - Trên môi trường EMB (Eosin methyl blue agar): E. coli cho khuẩn lạc có ánh kim màu tím, tròn, dẹt. - Trên môi trường Kliger iron agar (KIA): E. coli lên men đường glucose và lactose làm cho phần nghiêng và phần sâu có màu vàng, sinh hơi nhưng không sinh H 2 S. - Trên môi trường thạch dinh dưỡng tạo khuẩn lạc tròn ướt, màu trắng đục hơi lồi để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn. - Trên môi trường canh dinh dưỡng sau khi nuôi cấy 4 - 5 giờ E. coli làm đục đều môi trường, sau đó lắng xuống đáy, có màu tro nhạt đôi khi có màu tro xám, có mùi trứng thối. 8 - Trên môi trường Brilliant Green Bile Lactose agar (BGBL agar): Vi khuẩn sinh hơi và làm thay đổi màu của môi trường vì lên men đường lactose. Hình 2.3: Vi khuẩn E. coli biểu hiện dương tính trong môi trường BGBL Ống 1 (+), Ống 2 (-) 2.1.1.4 Đặc điễm sinh hóa [6] E. coli có khả năng lên men và sinh hơi một số loại đường thông thường như: lactose, glucose, manitol, thường người ta căn cứ vào khả năng lên men đường lactose để phân biệt E. coli với một số vi khuẩn đường ruột khác, E. coli có phản ứng sinh hóa biểu hiện ở Bảng 2.1: Bảng 2.1: Biểu hiện sinh hóa của E. coli Phản ứng sinh hóa Biểu hiện Urea + H 2 S - Indol + Methyl Red (MR) + Vosges Proskauer (VP) - Citrate - 2.1.1.5 Cấu tạo kháng nguyên và độc tố: - Kháng nguyên [9] 9 E coli có cấu tạo kháng nguyên rất phức tạp, được chia làm nhiều loại: O, H, K, F. + Kháng nguyên O (Somatic antigen): Là kháng nguyên chịu nhiệt, không bị hủy ở nhiệt độ 100 0 C trong 2 giờ, khi tiếp xúc với cồn 50% vẫn không bị phân hủy. Tuy nhiên sẽ bị phân hủy bởi formol 5%. + Kháng nguyên H (Flagellar antigen): Có trên 50 loại khác nhau, được cấu tạo bởi protein, kháng nguyên H có một số tính chất ngược lại so với kháng nguyên O như: Kháng nguyên H không chịu được nhiệt, sẽ bị hủy bởi cồn 50%, các protenase, không bị hủy bởi formol 5%. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết H. + Kháng nguyên K (Capsular antigen): Bản chất là polysaccharid hay protein, tính chất chịu nhiệt của kháng nguyên này tương đối kém, sẽ bị thiêu hủy ở 100 0 C trong 1 giờ. + Kháng nguyên F (Fimbrias antigen): Về hình dáng có dạng sợi, dài khoảng 4µm, thẳng hay xoắn đường kính 2,1 – 7nm, giúp vi khuẩn bám vào tế bào niêm mạc ruột, kháng nguyên này có vai trò quan trọng trong khả năng gây bệnh của vi khuẩn. - Độc tố Độc tố E. coli: loại có giáp mô độc tính mạnh hơn loại không có giáp mô. Độc tố của E. coli gồm có hai loại: + Nội độc tố: gây tiêu chảy. + Ngoại độc tố: gây tan huyết, phù thủng. 2.1.1.6 Tính chất gây bệnh [6, 9] Khi E. coli tiết ra các độc tố tế bào (cytotoxin), do các dòng vi khuẩn này có mang một plasmid có thể giúp chúng bám dính vào màng nhày của ruột, gây tiêu chảy không có máu hoặc có máu ở người, ngoài ra còn có các hội chứng khác gây nhiễm ở bộ phận sinh dục, viêm màng bụng, có khi gây nhiễm trùng huyết. Dựa vào tính chất gây độc của vi khuẩn E. coli mà hiên nay người ta đã phân chia thành các nhóm sau: + Nhóm E. coli gây bệnh EPEC (Enteropathogentic E. coli): Gây viêm ruột và tiêu chảy ở trẻ em. + Nhóm sinh độc tố ruột ETEC (Enterotoxigenic E. coli) : Gây tiêu chảy và viêm đại tràng. 10 [...]... vào phương pháp và quy trình thu mẫu Vì vậy trước khi tiến hành thu mẫu thì tất cả dụng cụ phải đảm bảo vô trùng Nhân viên lấy mẫu phải mặc đồ bảo hộ lao động, đeo khẩu trang, tóc phải được kẹp rọn ràng và phải được bọc kín, tay phải được khử trùng và đeo găng tay sạch Quá trình lấy mẫu cũng không kém phần quang trọng bởi vì kết quả của mẫu lấy phân tích phải phản ánh chính xác mọi đặt điểm và phải... mẫu vào trong bao PE thêm vào 90ml dung dịch pha loãng và để vào máy stomacher, dập, cho vi khuẩn phân tán điều trong dung dịch Sau khi mẫu và dung dịch pha loảng được đồng nhất ta được dung dịch pha loãng 1/10 Thực hiện các độ pha loãng tiếp theo, theo phương pháp pha loãng dãy thập phân như trên để được độ pha loãng cần thiết 3.4.2 Kỹ thuật lấy mẫu Kết quả phân tích định lượng phụ thuộc rất nhiều vào... hột vẹt và thùng nhựa đựng mẫu - Dụng cụ cấy mẫu: Cốc thủy tinh dùng để bỏ đầu típ trong quá trình cấy, giá để ống nghiệm bằng Inox, đèn cồn, hột vẹt, ống nghiệm, đĩa petri, pipetman, đầu típ, tất cả điều phải vô trùng - Dụng cụ cấy phân lập giống: Các lọai que cấy vòng, thẳng - Dụng cụ pha chế môi trường: Chai thủy tinh, muỗng Inox, cốc thủy tinh, ống nghiệm, đĩa petri, ống hút thủy tinh, quả bóp... chất lượng của lô sản phẩm đó Lấy mẫu không đúng phương pháp, kết quả phân tích sẽ không phản ánh đúng chất lượng của lô sản phẩm Trong các nhà máy sản xuất, chế biến thực phẩm, cần thiết phải thu mẫu tại nhiều thời điểm và công đoạn khác nhau trong quá trình sản xuất, tránh việc thu mẫu chỉ tại một thời điểm, một vị trí hay một công đoạn, vì quá trình thu mẫu như trên sẽ cho ta kết quả không khách quang... sau khi khử trùng que cấy, mở nút ống nghiệm, hơ miệng ống nghiệm xoay vài vòng qua ngon lửa + Đưa que cấy vào bên trong, để que cấy trạm trên thành ống nghiệm một lúc, để cho que cấy nguội đi + Lấy ít sinh khối từ trong ống nghiệm bằng cách chấm nhẹ đầu que cấy lên khuẩn lạc trên bề mặt môi trường Sau đó ta rút que cấy ra một cách cẩn thận tránh không cho que cấy dính vào thành và miệng ống nghiệm +... Khử trùng đầu que cấy trên ngọn lửa đến khi nóng đỏ Mở nắp ống nghiệm bằng ngón út và lòng bàn tay Khử trùng miệng ống nghiệm - Làm nguội que cấy và lấy một vòng môi trường nuôi cấy - Khử trùng lại ống nghiệm, đậy nắp lại và đặt vào giá để ống nghiệm - Dùng một tay mở petri, một tay ria đầu que cấy trên mặt thạch Vị trí bắt đầu ria que cấy nằm ở rìa đĩa thạch và ở phía đối diện người cấy - Ria trên bề... que cấy đâm vào môi trường - Khử trùng que cấy trên ngọn lửa Xoay đĩa petri 1/4 vòng tròn - Mở nắp petri và đợi que cấy nguội bằng cách áp đầu que cấy lên nắp petri Bắt đầu ria đường thứ hai từ một vị trí trên đường ria đầu tiên - Tiếp tục ria các đường tiếp theo tương tự đến khi ria kín bề mặt đĩa thạch Khử trùng lại que cấy sau khi ria xong 3.5 Phương pháp phân tích 3.5.1 Định lượng Coliorms bằng phương. .. napthol 5% trong cồn tuyệt đối - Dung dịch KOH 40% 3.5.2.3 Quy trình cấy - Xử lý và pha loãng mẫu Cân 10g mẫu vào bao PE thêm vào 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 30 giây Sau đó tiếp tục pha loãng mẫu theo phương pháp pha loãng thập phân, để được nồng độ cấy thích hợp, tùy theo mật độ mẫu nhiễm nhiều hay ít mà ta chọn nồng độ cấy khác nhau, sao cho mỗi thể tích cấy xác định... theo phương pháp pha loãng thập phân để ta có độ pha loãng cần thiết - Cấy mẫu: Dùng pipet vô trùng hút dịch pha loãng mà ta thấy thích hợp cấy vào đĩa petri Mỗi độ pha loãng cấy hai đĩa, chọn hai hay ba độ pha loãng kế tiếp nhau để cấy Sau khi cấy xong ta đổ vào khoảng 5ml TSA đã được đun chảy và làm nguội khoảng 450C Lắc tròn đĩa theo chiều xuôi và ngược kim đồng hồ, mổi chiều 3 - 5 lần để dịch phân. .. độ nuôi cấy, coliformss được các nhà nghiên cứu chia thành hai nhóm nhỏ là: Nhóm coliorms tổng số và Faecal coliforms Faecal coliforms hay còn gọi là nhóm coliorms phân, vì nhóm này có nguồn gốc từ phân của các loài động vật Trên thực tế kiễm nghiệm coliforms phân được 11 quan tâm nhiều hơn coliforms Hiện nay người ta đã phân lập được 4 giống thuộc nhóm coliforms có nguồn gốc từ ruột người và động . “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ PHÂN TÍCH E. COLI VÀ COLIFORMS TRONG THỦY HẢI SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY” 5 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích Đề tài nhằm góp phần tìm hiểu và đánh giá hiệu quả phân. trí phân loại: [8] Vi khuẩn Escherichia coli có vị trí phân loại như sau: • Ngành: Proteobacteria. • Lớp: Gamma Proteobacteria. • Bộ: Enterobacteriales. • Họ: Enterobactericeae. • Giống: Escherichia. •. thuật cấy phân lập 24 3.5 Phương pháp phân tích 24 3.5.1 Định lượng Coliorms bằng phương pháp điếm khuẩn lạc 24 3.5.2 Định lượng E. coli bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 27 3.5.3 Phương pháp định