3.4.2.1 Nguyên tắc
Cấy 0,1ml mẫu có nồng độ pha loãng thích hợp lên môi trường chọn lọc. Đem ủ ở nhiệt độ 370C/24 giờ, ta đếm các khuẩn lạc có hình dạng đặt trưng như sau: khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím trên mặt, đường kính khoảng 1mm. Xác nhận khuẩn lạc đã đếm bằng cách chọn 2 hay 3 khuẩn lạc cấy sang môi trường Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrat thử nghiệm sinh hóa. E. coli có biểu hiện sinh hóa: Indol dương tính, MR dương tính, VP âm tính, Citrat âm tính.
3.5.2.2 Môi trường và hóa chất.
- Dung dịch pha loãng saline peptone water. - Eosin Methyl blue agar (EMB)
- Trypton Soya Agar (TSA) - Tryptone broth
- Methyl Red – Voges Proskauer broth (MR – VP broth). - Simmons Citrate
- Thuốc thử Kovac,s - Thuốc thử Methyl red
- Dung dịch α – napthol 5% trong cồn tuyệt đối. - Dung dịch KOH 40%
3.5.2.3 Quy trình cấy
- Xử lý và pha loãng mẫu
Cân 10g mẫu vào bao PE thêm vào 90ml dung dịch pha loãng, đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 30 giây. Sau đó tiếp tục pha loãng mẫu theo phương pháp pha loãng thập phân, để được nồng độ cấy thích hợp, tùy theo mật độ mẫu nhiễm nhiều hay ít mà ta chọn nồng độ cấy khác nhau, sao cho mỗi thể tích cấy xác định trên đĩa sẽ có mật độ khuẩn lạc mọc trên đĩa từ 10 – 100 khuẩn lạc.
- Cấy mẫu
Hút 0,1ml mẫu có nồng độ pha loãng thích hợp cấy vào đĩa có chứa môi trường EMB đã chuẩn bị trước, ta nên cấy mỗi độ pha loãng 2 đĩa. Sau đó dùng que cấy tam giác vô trùng trang đều trên bề mặt cho đến khi khô mặt. Ta lật ngược đĩa, ủ ở 370 C/24 giờ.
- Bước đọc kết quả: Đếm những khuẩn lạc dẹt, có ánh kim tím trên mặt, đường kính 1mm, mọc trên đĩa.
Chú ý: Ta chỉ nên chọn các đĩa có số khuẩn lạc mọc trong khoảng từ 10 – 100 để đếm. Vì với những đĩa có số khuẩn lạc mọc > 100 thì kích thước nhỏ và không rõ ràng.
Hình 3.2: Hình dạng E. coli trên môi trường EMB
- Bước khẳng định: Chọn 2 khuẩn lạc đặc trưng cấy chuyển sang môi trường TSA, ủ ở 370C/24 giờ. Sau đó cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hóa:
Sau khi cấy sang các môi trường thử nghiệm sinh hoá: Tryptone broth, - Methyl Red – Voges Proskauer broth, Simmons Citrate, ủ ở 370 C/24 – 48 giờ. Ta tiến hành thử nghiệm:
+ Thử nghiệm Indol: nhỏ vào ống nghiệm chứa môi trường Tryptone broth 1ml ether lắc đều, sau đó nhỏ vào 5 giọt thuốc thử Kovac,s để yên quan sát.
Kết quả: (+)Vòng đỏ xuất hiện trên bề mặt môi trường.
(-) Không có vòng đỏ xuất hiện màu của nó là màu của thuốc thử.
+ Thử nghiệm MR: Nhỏ vài giọt thuốc thử Methyl red vào ống chứa môi trường - Methyl Red – Voges Proskauer broth, quan sát độc kết qua ngay.
(-) Môi trường vẫn giữ nguyên màu vàng. Trường hợp môi trường có màu cam, cần tiếp tục ủ ống môi trường trong 4 ngày và thực hiện lại thử nghiệm
+ Thử nghiệm VP: Thêm một ít KOH 40% (khoảng 0,2 - 0,3ml) làm kiềm môi trường, tiếp theo ta thêm vào 0,2ml thuốc thử α – napton 5% trong cồn tuyệt đối. Lắc mạnh để oxy hòa tan, quan sát.
Kết quả: (+) Môi trường chuyển sang màu đỏ huyết (-) Môi trường vẫn giữ màu đậm.
+ Thử nghiệm Citrate: Sau khi cấy vi sinh vật vào môi trường, ủ ở nhiệt độ 370C. Quan sát trên môi trường simmon citrate agar
Kết quả: (+) Trên môi trường có xuất hiện sinh khối và chuyển sang màu xanh da trời.
(-) Khi trên môi trường không có sinh khối và không chuyển màu.
Hinh 3.3: Kết quả thử nghiệm sinh hóa E. coli
Ống 1 Indol (+), ống 2 Indol (-), ống 3 MR (+), ống 4 MR (-), ống 5,6 VP (-), ống 7,8 Citrate (-)