khi thực hiện trên chủng vi sinh vật thuần khiết 4.1.1 Phân lập chủng
Nhóm coliforms nói chung rất đa dạng vì chúng bao gồm các vi sinh vật hiếu khí và kị khí tùy ý. Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng và biểu hiện sinh hóa cho phép phân lập nhiều chủng coliformskhác nhau.
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã phân lập được 3 chủng coliforms từ các mẫu tôm sú. Trong đó có 2 chủng coliforms chưa xác định được tên, chúng tôi ký hiệu hai chủng này là C1 và C2, chủng coliform thứ 3 được xác định là E. coli. Đặc điểm sinh hóa của 3 chủng coliforms này được thể hiện qua Bảng 4.1.
Bảng 4.1: Biểu hiện sinh hóa của 3 chủng Coliforms được phân lập
Ký hiệu chủng
Các biểu hiện của phản ứng sinh hóa
Indol MR VP Citrate
C1 + - - +
C2 + + - +
Chủng C1 Indol (+), MR (-),VP (-), Citrate (+) Chủng C2 Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate Chủng E.coli Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-)
Hình 4.1: Các thử nghiệm sinh hoá trong nghiệm pháp IMViC
4.1.2 Xác định mật độ Coliforms trong các độ pha loãng
Mục đích của khảo sát này nhằm xác định mật độ vi khuẩn coliforms trong dịch tăng sinh nhằm để làm cơ sở cho việc gây nhiễm vào trong các khảo sát tiếp theo.
Chủng vi khuẩn thuần C1 và C2 trên môi trường TSA được cấy sang môi trường canh Tryptone ủ ở 370C trong thời gian từ 24 - 48 giờ. Pha loãng dịch canh khuẩn theo phương pháp pha loãng dãy thập phân, bắt đầu từ 100 đến 10-9. Xác định mật độ vi sinh vật trong các nồng độ pha loãng khác nhau bằng phương pháp đổ đĩa môi trường TSA. Thí nghiệm được thực hiện trên 4 nồng độ pha loãng liên tiếp. Mỗi khảo sát được lặp lại 3 lần. Kết quả định lượng, giới hạn định lượng trên môi trường VRB được thể hiện qua bảng 4.2.
Bảng 4.2. Kết quả định lượng các chủng thuần C1 và C2 trong các độ pha loãng
Kết quả định lượng (CFU/ml)
10-6 10-7 10-8 10-9
C1
Lần 1 KXĐ 231 18 0
Lần 2 KXĐ 136 5 0
Lần 3 KXĐ 164 8 0
Mật độ tế bào trung bình (CFU/ml) KXĐ 177 10 0
C2
Lần 1 190 13 0 0
Lần 2 86 7 0 0
Lần 3 112 9 0 0
Mật độ tế bào trung bình (CFU/ml) 129 10 0 0
Ghi chú: KXĐ: không xác định
Kết quả thể hiện trên Bảng 4.2 cho thấy các chủng C1 và C2 có tốc độ tăng trưởng khác nhau khi tăng sinh trong cùng thời gian trong môi trường canh Trypton. Sau khi tăng sinh qua đêm ở nhiệt độ 370C chủng C1 có mật độ vi khuẩn đạt khoảng 1,7 x 109 CFU/ml, trong khi chủng C2 đạt mật độ thấp hơn, khoảng 1,3 x 108 CFU/ml. Kết quả này làm cơ sở cho việc dự đoán mật độ vi khuẩn trong canh thang sau khi tăng sinh sử dụng cho việc gây nhiễm vào mẫu trong các thí nghiệm tiếp theo.
4.1.3 Xác định giới hạn định tính E. coli
Mục đích của quá trình này là xác định giới hạn phát hiện E. coli khi thực hiện với chủng vi khuẩn thuần khiết mà không có sự tác động của các thành phần khác trong mẫu. Mật độ E. coli trong các độ pha loãng cũng được xác định tương tự như xác định mật độ các dòng coliforms ở phần 4.1.2.
Khảo sát được thực hiện với các độ pha loãng 10-7, 10-8, 10-9, 10-10. Cấy 1ml mỗi độ pha loãng vào môi thường BGBL ủ 440C để định tính E. coli. Đồng thời với việc phân tích định tính, mật độ E. coli trong mỗi dịch pha loãng cũng được xác định lại bằng cách cấy 0,1ml vào đĩa petri có chứa môi trường EMB ủ 370C. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Kết quả khảo sát được trình bày như trên bảng 4.3.
Bảng 4.3: Kết quả phát hiện E. coli trong các độ pha loãng khác nhau
Độ pha loãng 10-7 10-8 10-9 10-10
Mật độ tế bào E. coli
gây nhiễm lý thuyết
Lần 1 KXĐ 30 2 0 Lần 2 KXĐ 55 4 0 Lần 3 KXĐ 25 2 0 Trung bình KXĐ 37 3 0 Kết quả phát hiện (E. coli/ml) Lần 1 + + + - Lần 2 + + + - Lần 3 + + + - Ghi chú: KXĐ: không xác định
Kết quả trên bảng 4.3 cho thấy phương pháp đã áp dụng cho phép phát hiện
E. coli trong dịch canh khuẩn thuần với mật độ tối thiểu là 2 CFU/ml. Tuy nhiên đây là giới hạn phát hiện của phương pháp đối với canh khuẩn thuần, không có sự can thiệp của các thành phần hóa học và hệ vi sinh vật trong mẫu.
4.2 Xác định khả năng đinh lượng các dòng coliforms và khả năng định tính
E. coli trên sản phẩm thủy hải sản.
4.2.1 Xác định khả năng định lượng các dòng coliformskhác nhau trên sản phẩm tôm Amaebi.
Khi xác định được mật độ coliforms trong canh khuẩn sau khi tăng sinh qua đêm của 2 chủng C1 và C2, đồng thời ta đã biết được mật độ của từng chủng có trong các độ pha loãng, chúng tôi chọn ra một độ pha loãng có mật độ thích hợp để gây nhiễm vào mẫu thủy hải sản không bị nhiễm coliforms (mẫu gây nhiễm đã được phân tích và khẳng định không có coliforms trước đó). Theo tính toán của chúng tôi, độ pha loãng được chọn để tiến hành gây nhiễm là 10-4. Loại mẫu được chọn để gây nhiễm là sản phẩm tôm Amaebi thành phẩm.
Hút 1ml dịch vi khuẩn đã pha loãng ở nồng độ 10-4 gây nhiễm vào 10g mẫu tôm Amaebi, thêm vào 90ml dung dịch pha loãng saline peptone water, tiến hành định lượng coliforms trong mẫu đã gây nhiễm. Kết quả định lượng được trình bày trên Bảng 4.4
Bảng 4.4: Kết quả định lượng chủng C1 và C2 sau khi nhiễm vào sản phẩm tôm Amaebi
Chủng Lần lập lại Mật độ gây nhiễm lý thuyết (CFU/g) Mật độ phát hiện thực tế (CFU/g) Độ thu hồi (%) Trung bình (%) C1 Lần 1 2,31 x 104 5 x 103 21,6 40,6 Lần 2 1,64 x 104 8,4 x 103 51,2 Lần 3 1,75 x 104 8,7 x 103 49 C2 Lần 1 1,9 x 103 1,2 x 103 63,2 61,5 Lần 2 7,6 x 103 4,7 x 103 61,8 Lần 3 3,2 x 103 1,9 x 103 59,4
Kết quả trên Bảng 4.4 cho thấy khi gây nhiễm vào mẫu với mật độ trong khoảng 103-104 (CFU/g) thì kết quả định lượng được nằm trong khoảng 103 (CFU/g). Độ thu hồi cao nhất 63,2%, thấp nhất là 21,6%. Kết quả trên Bảng 4.4 cũng cho thấy các chủng Coliforms khác nhau khi gây nhiễm vào mẫu thì có độ thu hồi cũng khác
nhau. Đối với chủng C1 khi gây nhiễm vào mẫu tôm Amaebi có độ thu hồi là 40,6% trong khi đó chủng C2 khi gây nhiễm vào mẫu trên thì có độ thu hồi là 61,5%.
Với độ thu hồi trong phương pháp định lượng coliforms như trên là không cao. Những yếu tố làm tác động đến độ thu hồi là: Tính chất và hệ vi sinh vật trong mẫu. Nếu trong mẫu có chứa nhiều yếu tố bất lợi cho sự sống sót coliforms như tồn dư chất tẩy rửa, nhiệt độ của mẫu khi gây nhiễm… sẽ cho kết quả thu hồi thấp. Mặt khác nếu mẫu có nhiều vi sinh vật khác nhau thì độ thu hồi cũng giảm do sự cạnh tranh phát triển của các vi sinh vật và sự lầm lẫn trong quá trình phân tích.
4.2.2 Xác định khả năng định tính E. coli trên sản phẩm tôm Amaebi
Chủng E. coli được tăng sinh trong môi trường canh Trypton, pha loãng theo lũy thừa thập phân, định lượng mật độ E. coli trong các độ pha loãng. Gây nhiễm dịch pha loãng canh khuẩn E. coli vào mẫu tôm Amaebi đã được khẳng định là không nhiễm E. coli. Định tính E. coli trong các mẫu đã gây nhiễm. Kết quả khảo sát được trình bày trên Bảng 4.5.
Bảng 4.5: Kết quả định tính E. coli sau khi nhiễm vào sản phẩm tôm Amaebi
Mật độ lây nhiễm (CFU/g) 26 x 104 26 x 103 26 x 102 260 2,6 Khả năng phát hiện
(E. coli/g)
Lần 1 + + + + -
Lần 2 + + + + -
Lần 3 + + + + -
Kết quả trên Bảng 4.5 cho thấy khi gây nhiễm E. coli vào mẫu với mật độ từ 260 (CFU/g) trở lên sẽ cho kết quả phát hiện dương tính, mật độ gây nhiễm thấp hơn thì cho kết quả âm tính. So với giới hạn phát hiện khi tiến hành khảo sát với chủng
E. coli nuôi cấy thuần là 3 (CFU/ml) thì giới hạn phát hiện khi gây nhiễm vào tôm Amaebi như trên là quá cao. Sở dĩ giới hạn phát hiện trong mẫu gây nhiễm cao như trên có thể là do một trong các nguyên nhân như sau: (1) sự ức chế tăng trưởng của các thành phần trong mẫu đồi với sự tăng trưởng của E. coli trong quá trình tăng sinh làm cho vi khuẩn không tăng trưởng và không thể phát hiện được, (2) do sự canh tranh của hệ vi sinh vật khác có mặt trong mẫu ức chế sự tăng trưởng E. coli trong môi trường tăng sinh.
Hình 4.2: Dấu hiệu dương tính E. coli trong môi trường tăng sinh sinh chọn lọc BGBL ống 1, 2, 3 , 4 (+), ống 5 (-)
4.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của việc đông lạnh mẫu đến kết quả đinh lượng Coliforms và định tính E. coli Coliforms và định tính E. coli
Với mục tiêu nghiên cứu sự ảnh hưởng của các yếu tố khác nhau đến kết quả phân tích của coliforms và E. coli, do thời gian thực hiện đề tàicó hạn nên trong nội dung này chúng tôi chỉ tiến hành khảo sát sự ảnh hưởng của việc đông lạnh mẫu đến kết quả phân tích của coliforms và E. coli.
Mẫu tôm Amaebi được cân và pha loãng thành huyền phù 10-1 trong dung dịch pha loãng saline peptone water, gây nhiễm vào mỗi mẫu 1ml dịch có chứa vi khuẩn chủng C1và C2 ở nồng độ pha loãng 10-4, với E. coli là 10-3. Mỗi chủng vi khuẩn được gây nhiễm vào 2 mẫu. Một mẫu được phân tích ngay sau khi gây nhiễm, một mẫu được bảo quản đông lạnh trong khoảng 20 - 24 giờ trước khi phân tích. So sánh kết quả coliforms và E. coli trên mẫu đông lạnh và mẫu không đông lạnh.
4.3.1 Ảnh hưởng của sự đông lạnh mẫu đến kết quả định lượng coliforms
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của việc đông lạnh mẫu đến kết quả định lượng coliformsđược trình bày trên Bảng 4.6. và Biểu đồ 4.1.
Bảng 4.6. Kết quả định lượng chủng C1 và C2
Kết quả định lượng trung bình 3 lần lập lại lg(CFU/g)
Chủng coliformsC1 Chủng coliformsC2
Mật độ nhiễm lý thuyết 3,3 2,6
Mẫu không đông lạnh 4,3 3,7
Mẫu đông lạnh 4,0 2,9
Biểu đồ 4.1: Kết quả định lượng Coliforms trong mẫu đông lạnh và không đông lạnh
Kết quả trên Bảng 4.6 và Biểu đồ 4.1 cho thấy khi nhiễm vào mẫu thì mật độ coliforms ở cả 2 mẫu đông lạnh và không đông lạnh điều có sự gia tăng về số lượng so với mật độ nhiễm vào. Tuy nhiên sự gia tăng của chúng có sự chênh lệch ở cả hai nhóm. Ở mẫu không đông lạnh mật độ tế bào vi khuẩn tăng cao hơn so với mẫu có qua quá trình đông lạnh. Đối với chủng C1 số lượng chênh lệch giữa hai mẫu đông lạnh và không đông lạnh là 0,3 lg(CFU/g). Ở chủng C2 sự chênh lệch này là 0,8 lg(CFU/g). Tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa. Kết quả này cho phép chúng tôi kết luận sự đông lạnh chỉ có thể làm chậm sự phát triển của vi khuẩn Coliforms.
Đối với mẫu không đông lạnh, mật độ coliforms được phát hiện cao hơn mật độ gây nhiễm ban đầu. Kết quả này có thể do vi khuẩn khỏe mạnh có thể phát triển từ khi gây nhiễm mẫu cho đến khi phân tích.
Khi so sánh giữa kết quả định lượng coliforms của mẫu đã qua quá trình đông lạnh và mẫu không qua quá trình đông lạnh thì ta thấy kết quả của hai quá trình này
không có sự khác biệt. Điều này cho phép kết luận sự đông lạnh trong thời gian ngắn không ảnh hưởng đến mật độ coliforms trong mẫu. Kết quả ngày cũng phù hợp với các nghiên cứu của các tác giả khác đã công bố.
4.3.2 Ảnh hưởng của sự đông lạnh mẫu đến kết quả định tính E. coli
Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của việc đông lạnh mẫu đến kết quả định tính
E. coli được trình bày trong Bảng 4.7
Bảng 4.7. Kết quả khảo sát sự định tính E. coli trong tôm Amaebi đông lạnh và không đông lạnh
Số lần lập lại Kết quả phát hiện (E. coli/g)
Lần 1
Mật độ tế bào gây nhiễm trong mẫu (CFU/g)
8 x 103 8 x 102 80 8 ND
Mẫu không đông lạnh + + + + -
Mẫu đông lạnh + + + + -
Lần 2
Mật độ tế bào gây nhiễm trong mẫu (CFU/g)
12 x 103 12 x 102 120 12 ND
Mẫu không đông lạnh + + + + -
Mẫu đông lạnh + + + + -
Lần 3
Mật độ tế bào gây nhiễm trong mẫu (CFU/g)
5 x 103 5 x 102 50 5 ND
Mẫu không đông lạnh + + + + -
Mẫu đông lạnh + + + + -
8,3 x 103 8,3 x 102 83 8 ND
+ + + + -
Ghi chú: ND – Not detected: Không phát hiện
Kết quả trên bảng 4.7 cho thấy không có sự khác biệt về kết quả định tính
E. coli giữa đông lạnh và không đông lạnh. Cả hai đối tượng đều cho kết quả dương tính với E. coli khi mật độ gây nhiễm từ 5 - 8 (CFU/g). Điều này cho phép chúng tôi kết luận E. coli không bị tác động khi đông lạnh mẫu trong thời gian ngắn. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu của một số nghiên cứu khác đã công bố.
Chương 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
Với mục tiêu nghiên cứu khả năng phân tích của phương pháp, các yếu tố tác động đến kết quả phân tích coliforms, E. coli, giới hạn phát hiện, sự tác động của các yếu tố lên kết quả phân tích, chúng tôi đã tiến hành khảo sát trên 2 chủng coliforms và 1 chủng E. coli. Sau quá trình khảo sát, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
- Đã phân lập và xác định được đặc điểm sinh hóa của 2 chủng coliforms C1, C2 và 1 chủng E. coli.
- Xác định mật độ tăng trưởng của coliforms trong môi trường canh Trypton ở 37oC qua đêm là khoảng 108-109 (CFU/ml). Đây là cơ sở để xác định mật độ tế bào gây nhiễm vào các mẫu cho mục đích nghiên cứu tiếp theo.
- Xác định được giới hạn phát hiện của phương pháp định tính E. coli đối với canh khuẩn thuần là 3 (CFU/ml)
- Độ thu hồi của phương pháp định lượng coliforms trong mẫu tôm là 40 - 60%. - Khả năng gới hạn phát hiện E.coli khi gây nhiễm vào mẫu tôm Amaebi nguyên liệu với mật độ là từ 260 (CFU/g) trở lên.
- Việc đông lạnh mẫu trong thời gian ngắn không ảnh hưởng đến kết quả phân tích Coliforms và E. coli trong mẫu .
5.2 Đề nghị
Do giới hạn về thời gian và điều kiện thí nghiệm nên vấn đề nghiên cứu của chúng tôi chỉ đạt ở mức khởi đầu. Nếu đề tài được tiếp tục, chúng tôi có một số đề xuất như sau:
- Thực hiện khảo sát các nội dung trên với nhiều chủng coliforms khác, khảo sát với nhiều loại mẫu khác nhau.