Đậu phộng Arachis hypogaea L., họ đậu (Fabaceae), định hướng tìm kiếm sự hiện diện của Resveratrol

 TRẦN VĂN PHƯƠNG KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC RỄ CÂY ĐẬU PHỘNG ARACHIS HYPOGAEA L., KIẾM SỰ HIỆN DIỆN CỦA RESVERATROL Chuyên ngành : Hóa Hữu Cơ Mã số : 60.44.27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA H

Trang 1



TRẦN VĂN PHƯƠNG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC RỄ CÂY

ĐẬU PHỘNG ARACHIS HYPOGAEA L.,

KIẾM SỰ HIỆN DIỆN CỦA RESVERATROL

Chuyên ngành : Hóa Hữu Cơ

Mã số : 60.44.27

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TÔN THẤT QUANG

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - NĂM 2012

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn:

Cô GS TS Nguyễn Kim Phi Phụng và Thầy TS Tôn Thất Quang đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn, quan tâm và động viên em trong quá trình học tập

và thực hiện luận văn

Thầy PGS TS Trương Thế Kỷ, Cô PGS TS Nguyễn Ngọc Hạnh, thầy TS Nguyễn Trung Nhân đã nhận lời tham gia Hội đồng, phản biện, đóng góp ý kiến

để em hoàn thành luận văn

Tất cả các quí Thầy, Cô trong khoa Hóa, đặc biệt là các Thầy, Cô trong bộ môn Hóa Hữu cơ đã giảng dạy và tạo mọi điều kiện cho em trong lúc học tập tại trường

Các anh chị nghiên cứu sinh, học viên cao học các khóa trước, các bạn cùng khóa K18 và các em sinh viên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thực nghiệm

Và cuối cùng tôi muốn tỏ lòng biết ơn đến các thành viên trong gia đình tôi

đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện luận văn này

Xin chân thành cảm ơn

Trang 3

MỤC LỤC

Danh mục các hình vẽ

Danh mục các sơ đồ và bảng biểu

Danh mục các từ viết tắt và kí hiệu

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẶC TÍNH THỰC VẬT 2

1.1.1 Giới thiệu về họ Đậu (Fabaceae) 2

1.1.2 Giới thiệu chi Arachis 2

1.1.3 Giới thiệu về cây đậu phộng 5

1.2 NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH RESVERATROL 5

1.2.1 Giới thiệu resveratrol 5

1.2.2 Tác dụng đề phòng bệnh tim mạch của resveratrol 6

1.2.3 Tác dụng kháng khối u của resveratrol 7

1.2.4 Tác dụng đối với viêm khớp của resveratrol 8

1.2.5 Tác dụng phòng bệnh tiểu đường của resveratrol 8

1.2.6 Tác dụng chống lão hóa của resveratrol 8

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH CÂY ĐẬU PHỘNG 8

1.4 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC 9

1.4.1 Hàm lượng resveratrol trong cây đậu phộng 9

1.4.2 Một số hợp chất được cô lập từ cây đậu phộng 9

Chương 2 THỰC NGHIỆM 13

2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 13

2.1.1 Hóa chất 13

2.1.2 Thiết bị 13

2.2 TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TỪ RỄ CÂY ĐẬU PHỘNG – ARACHIS HYPOGAEA 14

2.2.1 Điều chế các loại cao 14

Trang 4

2.2.2 Cô lập một số hợp chất hữu cơ 14

2.3 ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL TỪ CÂY ĐẬU PHỘNG – ARACHIS HYPOGAEA 15

2.3.1 Điều chế các loại cao 15

2.3.2 Phân tích các loại cao 15

Chương 3 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 16

3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU 16

3.1.1 Thu hái và xử lí mẫu 16

3.1.2 Xác định độ ẩm 16

3.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 17

3.2.1 Điều chế cao các loại cao từ rễ để khảo sát thành phần hóa học 17

3.2.2 Điều chế các mẫu cao để định lượng resveratrol 20

3.3 LY TRÍCH, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY

ARACHIS HYPOGAEA 21

3.3.1 Cô lập hợp chất từ cao cloroform 21

3.3.2 Cô lập hợp chất từ cao etyl acetate 22

3.3.3 Cô lập hợp chất từ cao metanol 1 23

3.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT ĐÃ CÔ LẬP ĐƯỢC 28

3.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất HYPO 1 28

3.4.2 Hợp chất HYPO 2 31

3.4.3 Hợp chất HYPO-3 32

3.5 ĐỊNH LƯỢNG RESVERATROL 52

Chương 4 KẾT LUẬN 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Trang 5

Trang

Hình 1.1 Cây đậu phộng - Arachis hypogaea (1 tháng tuổi) 3

Hình 3.1 Sắc ký lớp mỏng các loại cao điều chế được theo Sơ đồ 3.1 19

Hình 3.2 Sắc ký lớp mỏng các hợp chất cô lập được trong rễ cây đậu phộng -

28

Trang 6

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ VÀ BẢNG BIỂU

Trang

Sơ đồ 3.1 Qui trình điều chế các loại cao từ rễ cây đậu phộng - Arachis

18

Sơ đồ 3.2 Qui trình điều chế các loại cao của rễ, thân, lá cây đậu phộng -

20

Bảng 1.1 Hàm lượng resveratrol trên vỏ hạt ở một số giống cây đậu phộng 10

Bảng 1.2 Hàm lượng resveratrol trên rễ ở một số giống cây đậu phộng 10

Bảng 3.1 Khối lượng và thu suất các loại cao thu được so với cao thô etanol

ban đầu (120 g)

17

Bảng 3.2 Sắc ký cột silica gel trên cao cloroform ( 17 g) 25

Bảng 3.3 Sắc ký cột silica gel trên cao etyl acetate (15,3 g) 26

Bảng 3.4 Sắc ký cột silica gel trên cao metanol 1 (15,0 g) 27

Bảng 3.5 So sánh phổ NMR của HYPO 1 với acid ursolic 30

Bảng 3.6 Số liệu phổ NMR của HYPO 2 với kaempferol 32

Bảng 3.7 Số liệu phổ NMR của HYPO 3 với β-sitosterol

3-O-β-D-glucopyranoside

35

Bảng 3.8 Số liệu phổ NMR của HYPO 4 với resveratrol 36

Trang 7

Bảng 3.10 So sánh phổ NMR của hợp chất HYPO 6 với

(2S,3S,4R,2’R,8Z)-1-O-β-D-glucopyranosyl-2-(2-hydroxyhexadecanoylamino)

octadeca-8-en-1,2,4-triol

41

Bảng 3.11 So sánh phổ NMR của hợp chất HYPO 7 với soyasapogenol B 46

Bảng 3.12 So sánh phổ NMR của hợp chất HYPO 8 với soyasapogenol E 50

Trang 8

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

S : mũi đơn (singlet)

D : mũi đôi (doublet)

dd : mũi đôi - đôi (doublet-doublet)

dt : mũi đôi ba (doublet of triplet)

HPLC : sắc ký lỏng hiệu năng cao

(High Performance Liquid Chromatography)

HR-MS : khối phổ độ phân giải cao

(High Resolution – Mass Spectroscopy)

NMR : phổ cộng hưởng từ hạt nhân

(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

HSQC : tương quan H-C qua 1 nối

(Heteronuclear Single Quantum Coherence)

HMBC : tương quan H-C qua 2, 3 nối

(Heteronuclear Multiple Bond Coherence)

COSY : phổ tương quan giữa proton-proton (COrrelation SpectroscopY)

NOESY : Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY

DMSO : DiMetyl SulfOxid

Trang 9

MỞ ĐẦU

Trong đời sống con người, các loại cây cỏ trong tự nhiên có một vị trí và vai trò hết sức quan trọng, đặc biệt có nhiều loài đã được sử dụng trong dân gian để làm thuốc chữa bệnh từ rất lâu Vì thế, việc khảo sát thành phần hóa học của những loài cây có giá trị trong tự nhiên là một công việc rất quan trọng và có ý nghĩa thực tiễn

Với điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm, gió mùa, rất thích hợp cho sự sinh trưởng của thực vật, nước ta có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú Đó là điều kiện rất thuận lợi cho việc khảo sát thành phần hóa học của các loài cây cỏ có ích trong tự nhiên

Các nhà khoa học phát hiện hợp chất resveratrol – thành phần của rượu vang đỏ

và vỏ nho, có thể làm chậm quá trình lão hóa, phòng bệnh tim mạch, ung thư….Từ vỏ nho, các dược sĩ đã bào chế được loại thực phẩm chức năng chứa resveratrol dùng để phòng ngừa các bệnh kể trên Tuy nhiên, vỏ nho thu được từ trái nho không nhiều, tương đối đắt nên giá thành sản xuất cao Gần đây, các nhà khoa học còn phát hiện được resveratrol từ rễ cây đậu phộng Ngoài ra cây đậu phộng (Arachis hypogaea) còn

có nhiều ứng dụng trong thực tiễn như: hạt chữa ho sốt đờm, chữa đại tiện táo kết, giúp người bệnh mới khỏi sút cân và phụ nữ ít sữa, phụ nữ ho lâu…Phát hiện gần đây nhất

là rễ có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa, ngăn ngừa bệnh tim mạch, tăng huyết áp

và bệnh ung thư…

Đề tài nghiên cứu của tôi tập trung vào : ‘‘KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA

HỌC CỦA RỄ CÂY ĐẬU PHỘNG ARACHIS HYPOGAEA, ĐỊNH HƯỚNG TÌM

KIẾM SỰ HIỆN DIỆN CỦA RESVERATROL’’, với hy vọng góp phần thêm một hướng mới trong bào chế dược phẩm, có thể giá thành sản phẩm sẽ hạ do rễ cây đậu phộng giá thành thấp

Trang 10

Arachis hypogaea Tổng quan Trang 2

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC TÍNH THỰC VẬT

1.1.1 Giới thiệu về họ Đậu (Fabaceae)[1,2]

Họ Đậu (Fabaceae) là họ lớn thứ hai của thực vật có hoa với 650 chi và trên 18.000 loài Các tên gọi thông thường chủ yếu của các loài trong họ này là Đỗ hay Đậu

và họ này chứa một số loài cây quan trọng bậc nhất trong cung cấp thực phẩm cho con người

Tất cả các thành viên trong họ này đều có hoa chứa 5 cánh hoa, trong dó bầu nhụy lớn khi phát triển được sẽ tạo ra quả thuộc loại quả đậu, hai vỏ của nó có thể tách đôi, bên trong chứa nhiều hạt trong các khoang riêng rẽ Các loài trong họ này theo truyền thống được phân loại trong ba phân họ:

• Phân họ Vang (Caesalpinioideae), hay họ Vang (Caesalpiniaceae)

• Phân họ Trinh nữ (Mimosoideae), hay họ Trinh nữ (Mimosaceae)

• Phân họ Đậu (Faboideae hay Papilionoideae) (họ Fabaceae nghĩa hẹp

hay họ Papilionaceae)

Giá trị kinh tế: Nguồn cây làm rau quan trọng, cây làm thuốc, cây làm thức ăn gia súc, cây làm cảnh và cây cải tạo đất

1.1.2. Giới thiệu chi Arachis

Arachis[2,10] là một chi của khoảng 70 loài thực vật của họ Đậu (Fabaceae), có hoa sống một năm hoặc lâu năm, và có nguồn gốc từ khu vực Nam Mỹ Có một loài

với tên gọi là lạc hay đậu phộng (Arachis hypogaea), có giá trị như một loài cây cung

ứng lương thực có tầm quan trọng toàn cầu; một vài loài khác được trồng với quy mô nhỏ tại Nam Mỹ

Trang 11

Hình 1.1: Cây đậu phộng ̶ Arachis hypogaea (1 tháng tuổi)

Trang 12

Trang 13

1.1.3 Giới thiệu về cây đậu phộng

Lạc, Ðậu phộng - Arachis hypogaea L

Đậu phộng hay đậu phụng, còn gọi là lạc, tên khoa học: Arachis hypogaea L., thuộc họ Ðậu – Fabaceae [2,10], có nguồn gốc tại Trung và Nam Mỹ Nó là loài cây thân thảo, hàng năm, có thể tăng cao từ 3-50 cm Lá mọc đối, kép, hình lông chim với bốn

lá chét, kích thước lá chét dài 1-7 cm và rộng 1-3 cm Hoa dạng hoa đậu điển hình, màu vàng có điểm gân đỏ, cuống hoa dài 2-4 cm Sau khi thụ phấn, quả phát triển thành một dạng quả đậu, dài 3-7 cm, chứa 1-4 hạt (ánh), và quả (củ) thường dấu xuống đất để phát triển Hạt không chia đôi, hình trụ, thon lại giữa các hạt, có vân mạng Hạt hình trứng, có rãnh dọc Trong tên khoa học của loài cây này thì phần tên chỉ tính chất

loài hypogaea có nghĩa là "dưới đất" để chỉ đặc điểm quả được dấu dưới đất Trong

cách gọi tên tiếng Việt, từ "lạc" có nguồn từ chữ Hán "lạc hoa sinh" mà có người cho rằng người Hán đã phiên âm từ "Arachis"

Mùa hoa tháng 5-6

Bộ phận dùng: Hạt, dây lá

Nơi sống và thu hái: Gốc ở Brasil, được nhập vào trồng ở nước ta từ lâu

Hạt lạc (ánh lạc) là loại thực phẩm rất giàu năng lượng vì có chứa nhiều lipid Dây lá dùng tươi

1.2 NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH RESVERATROL

1.2.1 Giới thiệu resveratrol

Vào thập niên 30 của thế kỷ trước, có một học giả người Pháp đã chú ý đến, so sánh khu vực sản xuất nhiều rượu vang khu vực không sản xuất rượu vang, tỷ lệ người cao tuổi ở khu vực sản xuất rượu vang nhiều hơn ở vùng không sản xuất Cho đến thập niên 60, đi sâu điều tra phát hiện cho dù người Pháp và người Mỹ đều thích ăn những thực phẩm nhiều mỡ và nhiều đường, nhưng tỷ lệ mắc bệnh tim mạch chỉ bằng 1/3 người Mỹ, đây cũng chính là cái gọi là “nghịch lý của Pháp” Các nhà dinh dưỡng học

đã ý thức được người Pháp thích uống rượu vang có thể nguyên nhân chính của

Trang 14

“nghịch lý của Pháp”, nhưng cũng không rõ thành phần nào trong rượu vang gây ra tác dụng đó Trong khoảng thời gian rất dài mọi người nghĩ rằng do tác dụng của anthocyanin (tức OPC), nhưng có nghiên cứu liên quan chứng minh có thành phần tác dụng chủ yếu khác Đến năm 1992 nhân viên nghiên cứu của đại học Cornell Mỹ đã tìm thấy resveratrol trong rượu vang, thì mới xem như là tìm thấy “chúa cứu thế” [35]

Tuy rằng người Nhật nghiên cứu thành phần hóa học của cây Polygonum

cuspidatum[37] sớm hơn so với nghiên cứu hàm lượng resveratrol trong rượu vang của đại học Cornell, nhưng lúc bấy giờ không gây nhiều sự chú ý Chỉ đến khi người Mỹ phát hiện resveratrol trong rượu vang [38], và khi làm sáng tỏ người Pháp thích uống rượu vang có hàm lượng resveratrol cao, thì mọi người mới ý thức đến resveratrol có thể là chìa khóa giải đáp “nghịch lý của Pháp”, lập tức gây lên hiệu ứng xôn xao, thế là

đa số nhân viên nghiên cứu sôi nổi chạy theo lĩnh vực nghiên cứu resveratrol Như vậy, tiềm năng của resveratrol đối với sức khỏe con người và động vật được khai thác triệt

để

Resveratrol là thành phần có trong ít nhất 70 loại thực vật, đa số là những thức

ăn thường gặp, bao gồm nho (rượu), đậu phộng, dứa, dâu…

Có thể nói dược tính tốt của resveratrol đếm không hết Chức năng của nó khi mới phát hiện là có thể giúp giảm mỡ máu, trị chứng cao huyết áp; sau đó phát hiện có thể ức chế sự động tụ khác thường của tiểu cầu (chống tắc động mạch), làm rộng mạch máu, cải thiện vi tuần hoàn; nó có thể giúp đề phòng bệnh động mạch vành, xơ cứng động mạch, giúp mạch máu não hồi phục thông suốt, tăng thời gian làm việc của não;

nó còn có chức năng tăng cường miễn dịch, kháng khuẩn, kháng nhiễm virus, tác dụng kháng viêm và kháng dị ứng… Chúng tôi sẽ giới thiệu chức năng chính của resveratrol đối với sức khỏe con người

1.2.2 Tác dụng đề phòng bệnh tim mạch của resveratrol

Ở Trung Quốc, rất nhiều thực vật chứa resveratrol dùng làm thuốc kháng mỡ máu cao, kháng xơ cứng động mạch mà đã ứng dụng trong dân gian từ rất lâu, ví dụ

Trang 15

như cây Polygonum cuspidatum, hà thủ ô Trong nho chứa lượng resveratrol phong

phú, tỷ lệ mắc bệnh mỡ máu của người Pháp thấp liên quan đến uống rượu vang Điều tra phát hiện cách ngâm khô trong rượu vang đỏ, thông thường chứa lượng resveratrol

là 1 mg/L, cao nhất có thể đạt 7 mg/L, mà trong rượu vang trắng hàm lượng thông thường thấp hơn 0.1 mg/L, ở đây liên quan đến chủng loại nho, điều kiện dất trồng, tình trạng sâu bệnh và công nghệ ủ rượu Trên thực tế sự phát hiện lại của resveratrol,

do Arichi của đại học y khoa Aichi-Nhật phân tích từ cây Polygonum cuspidatum thu

được thành phần hữu hiệu giảm huyết áp Cho nên tác dụng giảm huyết áp của resveratrol là không thể nghi ngờ [40]

Viện y học của Đại học Quốc lập Đài Loan vào năm 2002 đã chứng minh resveratrol có thể bảo vệ tim [41]

1.2.3 Tác dụng kháng khối u của resveratrol

Kể từ năm 1992 khi phát hiện resveratrol trong rượu vang đỏ cho đến nay, những nghiên cứu về nó bắt đầu nổi lên Tuy nhiên, đến năm 1993 mới có báo cáo nhận định rằng resveratrol có hoạt tính ức chế men kích thích của khối u, có tác dụng

ức chế sinh trưởng của tế bào bệnh bạch huyết đối với chuột, nhưng ngày đó vẫn không được chú ý đến

Đến năm 1997, nhóm của Jang đã có nghiên cứu báo cáo về tác dụng kháng khối u của resveratrol trong 3 giai đoạn phát triển của khối u (initiation，promotion，progression), từ đó mới gây sự chú ý của đông đảo mọi người, cũng nhờ vậy mà những nghiên cứu về lĩnh vực này như dòng nước chảy Cho đến cuối tháng 6/2009, có khoảng 15.000 bài luận văn liên nghiên cứu vấn đề liên kháng khối u của resveratrol đã được đăng tải Những nghiên cứu chứng minh resveratrol có nhiều tác dụng để khống chế, ức chế và tiêu diệt tế bào khối u, bao gồm các tác dụng làm cho tế bào khối u tàn lụi và chết đi, ức chế gen đột biến, thay đổi phổ biểu đạt của gen, điều tiết thể hệ miễn dịch, ức chế sinh trưởng mạch máu mới [42,43]

Trang 16

1.2.4 Tác dụng đối với viêm khớp của resveratrol

Nếu sử dụng resveratrol lâu dài, những khớp bị tổn thương sẽ hoàn toàn được trị lành, có liên quan đến khả năng ức chế sự tăng trưởng khác thường tế bào màng hoạt dịch (loại viêm do thấp), thúc đẩy tế bào xương sụn hồi phục lại, cũng có thể nói nếu

sử dụng resveratrol lâu dài hoàn toàn có thể làm cho vết thương viêm khớp hoàn toàn bình phục [44]

1.2.5 Tác dụng phòng bệnh tiểu đường của resveratrol

Năm 2006 là mốc phát triển quan trọng trong giới khoa học, phát hiện tác dụng kháng bệnh tiểu đường tuýp II của resveratrol Khi giáo sư Sinclair của đại học Harvard nghiên cứu chức năng kháng lão hóa của resveratrol, phát hiện con chuột ăn thức ăn có nhiều mỡ động vật, nếu ăn resveratrol (20 mg/kg/ngày), thì sẽ sống lâu hơn, thậm chí không xuất hiện triệu chứng bệnh tiểu đường tuýp II Ý nghĩa của hạng mục nghiên cứu này cho thấy, sử dụng nhiều lượng resveratrol lâu dài, là có thể giúp phòng ngừa bệnh tiểu đường tuýp II [45]

1.2.6 Tác dụng chống lão hóa của resveratrol

Đây chính là một phát hiện vĩ đại “đến trễ” Những người hiểu biết tiến sĩ Sinclair, ai ai cũng nghĩ thầm trong bụng “liệu người ăn nhiều Resveratrol, phải chăng cũng được kéo dài tuổi thọ? Tiến sĩ Sinclair tiếp tục tiến hành thử nghiệm trên chuột, sau khi họ nuôi con chuột đến tuổi “trung niên” đổi sang thực đơn ăn chứa nhiều mỡ và liều lượng lớn resveratrol, kết quả quan sát cho thấy resveratrol đích thực có thể giúp chuột trong điều kiện dinh dưỡng không tốt trở nên khỏe hơn, thọ hơn [46]

Cây đậu phộng (Arachis hypogaea) thuộc chi Arachis, họ Đậu (Fabaceae) có

nhiều ứng dụng trong thực tiễn như: hạt chữa ho sốt đờm, chữa đại tiện táo kết, người bệnh mới khỏi sút cân và phụ nữ ít sữa, phụ nữ ho lâu…Phát hiện gần đây nhất là trong cây đậu phộng có chứa resveratrol có tác dụng làm chậm quá trình lão hóa, ngăn ngừa

Trang 17

bệnh tim mạch, tăng huyết áp và bệnh ung thư…

1.4 NGHIÊN CỨU VỀ HÓA HỌC

1.4.1 Hàm lượng resveratrol trong cây đậu phộng

Năm 2000, Timothy H Sanders và cộng sự [19] đã khảo sát hàm lượng resveratrol trong vỏ hạt đậu ở một số giống cây đậu phộng ở các nước Kết quả được trình bày trong bảng 1.1

Năm 2002, R S Chen, P L Wu and Robin Y Chiou [20] đã khảo sát hàm lượng resveratrol trong rễ ở một số giống cây đậu phộng ở Taiwan Kết quả được trình bày trong bảng 1.2

1.4.2 Một số hợp chất được cô lập từ cây đậu phộng

Năm 2005, Hong Wei Fu [15] đã cô lập được 9-dihydroxy-4,8-dimethoxy coumestan

Năm 2006, Victor S Sobolev [16] đã cô lập được arachidine-1, arachidine-2, arachidine-3 và 3’-isopentadienyl-3,5,4’-trihydroxystilbene

Năm 2008, Victor S Sobolev và các cộng sự [13] đã cô lập được coumaroyl spermidine; N 1

-tri-p-(E,E,E)-coumaroylspermidine, quercetin 3-glucoside, quercetin 3-glucoronide,

isorhamnetin 3-glucoside, isorhamnetin 3-glucoronide từ hoa cây đậu phộng

Năm 2009, Yu-Young Lee [17] đã cô lập sophoradiol, soyasapogenol và

trans-resveratrol

Trang 18

Bảng 1.1: Hàm lượng resveratrol trong vỏ hạt ở một số giống cây đậu phộng [19]

Spanish Small White Spanish 1,792 ± 0,616

Bảng 1.2: Hàm lượng resveratrol trong rễ ở một số giống cây đậu phộng [20]

Resveratrol (µg/g)

Trang 19

Cấu trúc hóa học của một số hợp chất được cô lập từ cây đậu phộng

O

O HO

OH

OH OH

O

O HO

OH OH OH 1'

2' 3' 4' 5' 6'

OH

OH OH

O

O HO

OH OH COOH

1' 2' 3' 4' 5' 6'

3

1'' 6

8

4 5

7

9

10 2

Quercetin 3-glucoside (1) Quercetin 3-glucoronide (2)

OH OH OH

1' 2' 3' 4' 5' 6'

OH OH COOH

1' 2' 3' 4' 5' 6'

3

1'' 6

8

4 5

7

9

10 2

Isorhamnetin 3-glucoside (3) Isorhamnetin 3-glucuronide (4)

O

O OCH 3

OCH 3

OH

HO 3

6

7 8 9

3,9-Dihydroxy-4,8-dimetoxycoumestan (8)

N 1 ,N 5

,N 10

-tri-p-(E,E,E)-Coumaroylspermidine (7)

Trang 20

Trang 21

Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung dịch acid sulfuric 30%, soi đèn UV hoặc dùng hơi iod

Silica gel Si – 60 (Merck) và Li Chroprep Rp – 18 (25 – 40 µm) loại dùng cho sắc ký cột, Merck

Sắc ký lớp mỏng pha thường 25DC – Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel F254, Merck và pha đảo RP-18 F254 , Merck

2.1.2 Thiết bị

Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, ống đong, pipetman)

Máy cô quay chân không Buchi –111, bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath

Các thiết bị ghi phổ:

- Phổ MS : Ghi trên máy HR-MS micrOTOF-Q II 10187

- Kết quả định lượng HPLC: Ghi trên máy HPLC, Agilent 1100 Seri

US, cột C18 − ACE kích thước 150 x 4,6 , 3µm, λ 330nm

Trang 22

Arachis hypogaea Trang 14 Thực nghiệm

- Phổ 1H–NMR, 13C–NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90, phổ HSQC, phổ HMBC và phổ NOESY: Ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance

500 ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz cho phổ 13C-NMR

Các phổ được ghi tại Phòng Phân Tích Trung Tâm, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh

2.2 TRÍCH LY VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ TỪ RỄ CÂY

ĐẬU PHỘNG – ARACHIS HYPOGAEA

2.2.1 Điều chế các loại cao

Rễ cây đậu phộng được thu hái tại Bến Tre, sau đó đem rửa sạch, sấy khô, xay nhuyễn thu được bột cây khô (1,3 kg)

Sử dụng phương pháp ngâm dầm để điều chế cao metanol ban đầu Bột khô của cây được ngâm dung môi metanol trong bình thủy tinh có nắp đậy trong vòng

24 giờ Sau đó lọc phần dịch trích, cô quay và thu hồi dung môi Tiếp tục thực hiện nhiều lần cho đến khi lượng cao thu được không còn đáng kể, thu được cao thô metanol (120,0 g)

Dùng phương pháp trích pha rắn silica gel đối với cao thô metanol, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: eter dầu hỏa (60-

90 0C), cloroform, etyl acetate và metanol Dung dịch thu được từ cột đem cô quay, thu hồi dung môi ở áp suất kém thu được các cao: cao eter dầu hỏa 1, cao eter dầu hỏa 2, cao cloroform, cao etyl acetate, cao metanol 1 và cao metanol 2 Qui trình điều chế được trình bày ở sơ đồ 3.2

2.2.2 Cô lập một số hợp chất hữu cơ

Tiến hành sắc ký cột cổ điển, sắc ký điều chế trên cao cloroform thu được các hợp chất: HYPO 1, HYPO 2, HYPO 3

Tiến hành sắc ký cột cổ điển, sắc ký điều chế trên cao etyl acetate thu được các hợp chất: HYPO 4, HYPO 5, HYPO 6

Trang 23

Sắc ký điều chế trên cao metanol 1 thu được các hợp chất: HYPO 7, HYPO

2.3.1 Điều chế các loại cao

Rễ, thân, lá cây đậu phộng được thu hái tại Bến Tre ở các giai đoạn sinh trưởng 30, 60 và 90 ngày tuổi, sau đó đem rửa sạch, sấy khô, xay nhuyễn thu được bột cây khô, mỗi loại (0,3 kg)

Sử dụng phương pháp đun hoàn lưu bột khô các mẫu cây trong etanol−nước (8:2) để điều chế cao etanol−nước Sau đó lọc phần dịch trích, cô quay và thu hồi dung môi Tiếp tục thực hiện nhiều lần cho đến khi lượng cao thu được không còn đáng kể, thu được cao thô etanol−nước, mỗi loại khoảng (1,0 g) Qui trình điều chế được trình bày ở sơ đồ 3.2

2.3.2 Phân tích các loại cao

Sau khi điều chế xong cao etanol−nước (8:2), thu được 9 mẫu rễ, thân, lá ở các giai đoạn 30, 60, 90 ngày Cân mỗi mẫu 1 g, gửi đi phân tích hàm lượng resveratrol bằng kỹ thuật HPLC-UV so với chất chuẩn là resveratrol

Trang 24

Arachis hypogaea Trang 16 Nghiên cứu và kết quả

Chương 3 NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ

3.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU

3.1.1 Thu hái và xử lí mẫu

Cây tươi được thu hái tại Xã Vang Quới Tây – huyện Bình Đại – tỉnh Bến Tre, vào tháng 09 năm 2010

Tên khoa học của cây là Arachis hypogaea L., được nhận danh bởi Kỹ sư Phan Gia Tân – Giảng viên Đại học Nông Lâm - TP Hồ Chí Minh

Một mẫu cây ép khô được lưu trong quyển sách lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu số US-C017, tại bộ môn Hóa hữu cơ, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, thành phố Hồ Chí Minh

Cây tươi lấy rễ, sau khi thu hái rửa sạch, để ráo, sấy khô ở nhiệt độ 60 oC, xay nhuyễn, thu được bột rễ cây khô (1,6 kg) Phần này được điều chế thành cao metanol

để khảo sát thành phần hóa học của cây

Cây tươi lấy riêng ba bộ phận rễ, thân, lá ở ba giai đoạn sinh trưởng: 30 ngày,

60 ngày, 90 ngày (90 ngày là thời gian thu hoạch hạt) Sau khi loại bỏ những lá sâu bệnh, vàng úa, rửa sạch, để ráo, sấy khô ở nhiệt độ 60 oC, xay nhuyễn, thu được 9 mẫu bột khô của rễ, thân, lá cây (mỗi mẫu 50 g) Phần này được trích bằng hỗn hợp etanol

− nước (8:2) để định lượng hàm lượng resveratrol

3.1.2 Xác định độ ẩm

Cân một khối lượng xác định nguyên liệu rễ tươi, sấy ở nhiệt độ 110 oC đến khi trọng lượng không đổi, cân nguyên liệu khô Lặp lại thí nghiệm 3 lần trên mỗi mẫu, lấy giá trị trung bình Độ ẩm của rễ được tính theo công thức sau

Độ ẩm (%) = Trọng lượng tươi – Trọng lượng khô Trọng lượng tươi x 100

Trang 25

Kết quả độ ẩm trung bình của rễ là 90%

3.2.1 Điều chế cao các loại cao từ rễ để khảo sát thành phần hóa học

Điều chế cao metanol bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng Bột khô của

rễ cây (1,6 kg) được ngâm trong dung môi metanol với thời gian 24 giờ Lọc phần dịch trích, cô quay và thu hồi dung môi Thực hiện nhiều lần, thu được cao metanol (120 g) Sử dụng phương pháp trích pha rắn silica gel trên cao metanol, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi với độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetate và metanol Dung dịch giải ly chứa trong các lọ, mỗi lọ 100 ml Cô quay, tiến hành sắc ký lớp mỏng (SKLM), các lọ có vết giống nhau gom thành một phân đoạn

Toàn bộ qui trình điều chế các loại cao được tóm tắt ở Sơ đồ 2.1 Khối lượng và thu suất các loại cao thu được so với cao metanol ban đầu được trình bày trong Bảng 3.1 Kết quả SKLM các loại cao thu được ở Sơ đồ 2.1 được trình bày trong Hình 2.1

Bảng 3.1 Khối lượng và thu suất các loại cao thu được

so với cao metanol rễ ban đầu (120 g)

Trang 26

Sơ đồ 3.1 Qui trình điều chế các loại cao từ rễ cây đậu phộng - Arachis hypogaea bằng

phương pháp trích pha rắn trên silica gel [5]

• Thu hồi dung môi

• Trích pha rắn trên silica gel, giải ly bằng eter dầu hỏa

• Cô quay thu hồi dung môi

• Sấy khô, xay nhuyễn

CỘT BỎ

CỘT CÒN LẠI

CAO ETER DẦU HỎA 1 (PE1; 9,0 g)

CAO ETER DẦU HỎA 2 (PE2; 12,0 g)

CAO ETYL ACETATE (EA; 15,3 g) CỘT CÒN LẠI

Trang 27

(a) (b) (c) (d) (e)

Hình 3.1 SKLM các loại cao trong sơ đồ 3.1

Ghi chú:

Hình 3.1a: Hệ dung ly eter dầu hỏa : cloroform (95:5)

Hình 3.1b: Hệ dung ly cloroform : metanol (9 : 1)

Hình 3.1c: Hệ dung ly cloroform : metanol (85 :15)

Hình 3.1d: Hệ dung ly cloroform : metanol (8 : 2)

Hình 3.1e: Hệ dung ly cloroform : metanol : nước (18:6: 1)

(a) Cao eter dầu hỏa PE1, PE2 trong sơ đồ 3.1

(b) Cao cloroform C1 trong sơ đồ 3.1

(d) Cao etyl acetat EA trong sơ đồ 3.1

(e) Cao metanol M1 trong sơ đồ 3.1

Hiện hình: Dung dịch H2SO4 30%, đun nóng bản

Trang 28

Nhận xét

Kết quả SKLM (Hình 3.1) cho thấy phân đoạn cao cloroform (C), cao etyl acetate (EA), cao metanol 1 (M1) cho nhiều vết chính rõ ràng, đẹp nên được lựa

chọn để khảo sát Các cao còn lại sẽ được khảo sát sau khi có điều kiện

3.2.2 Điều chế các mẫu cao để định lượng resveratrol

Điều chế cao etanol − nước bằng phương pháp đun hoàn lưu để xác định hàm

lượng resveratrol Bột khô (50 g) của từng bộ phận rễ, thân, lá được trích ba lần, mỗi lần

500 ml với hỗn hợp dung môi etanol − nước (8:2) Mỗi lần trích bằng cách đun hoàn lưu

trong 1 giờ Lọc lấy dung dịch và thêm 500 ml hỗn hợp dung môi mới, thực hiện quá trình

thêm 2 lần nữa Các dung dịch trích được gom lại, đuổi dung môi, thu được cao Cao này

được sử dụng để xác định hàm lượng resveratrol Qui trình điều chế cao được thực hiện

theo qui trình trình bày ở sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Qui trình điều chế các loại cao của rễ, thân, lá cây đậu phộng - Arachis

hypogaea để định lượng resveratrol

• Đun hoàn lưu, với etanol: nước (8:2) (500 ml x 5 lần, mỗi lần 1 giờ)

• Lọc, cô quay thu hồi dung môi

• Sấy khô, xay nhuyễn

TỪNG BỘ PHẬN (50 g)

CAO ETANOL − NƯỚC (1–2 g)

RỄ, THÂN, LÁ

Trang 29

3.3 LY TRÍCH, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY

ARACHIS HYPOGAEA

3.3.1 Cô lập hợp chất từ cao cloroform

Cao cloroform (C, 17.0g) được trộn đều với silica gel rồi nạp vào đầu cột sắc

ký, tiếp theo, tiến hành giải ly bằng các hệ dung môi có độ phân cực theo thứ tự tăng dần từ cloroform đến metanol Dung dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích là

50 ml và được kiểm tra bằng SKLM Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên cao C được trình bày ở bảng 3.2

Nhận xét:

Kết quả sắc ký cột trên cao cloroform thu được 11 phân đoạn (FC 1 – FC 11), trong đó các phân đoạn FC 4, FC 8, FC 9 có sắc ký lớp mỏng cho vết chính rõ, đẹp nên được chọn để khảo sát tiếp Các phân đoạn còn lại cho nhiều vết không rõ ràng nên tạm

thời chưa khảo sát

Khảo sát phân đoạn FC 4 của Bảng3.2

Phân đoạn FC 4 (Bảng 3.2) được thu ở dạng bột, sau khi sắc ký cột nhiều lần với hệ dung ly cloroform − metanol (97:3) và sắc ký điều chế, thu được 1 hợp chất dạng bột, màu trắng (5 mg) Kiểm tra bằng SKLM trên nhiều hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết duy nhất màu hồng sen khi hiện hình bằng dung dịch H2SO4 30%, đun nóng bản (Hình 3.2) Hợp chất này được ký hiệu là HYPO 1

Phần khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất HYPO 1 được trình bày trong mục 3.4

Khảo sát phân đoạn FC 8 của Bảng 3.2

Phân đoạn FC 8 được sắc ký cột với hệ dung môi giải ly cloroform − metanol (9:1), thu được một hợp chất dạng tinh thể, màu trắng (8 mg) Kiểm tra bằng SKLM trên nhiều hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết duy nhất màu tím đen khi hiện hình

Trang 30

bằng dung dịch H2SO4 30%, đun nóng bản (Hình 3.2) Hợp chất này được ký hiệu là HYPO 3

Khảo sát phân đoạn FC 9 của Bảng 3.2

Phân đoạn FC 9 được sắc ký cột với hệ dung môi giải ly cloroform − metanol (9:1), thu được một chất dạng bột, màu vàng (6 mg) Kiểm tra bằng SKLM trên nhiều

hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết duy nhất màu vàng khi hiện hình bằng dung dịch

H2SO4 30%, đun nóng bản (Hình 3.2) Hợp chất này được ký hiệu là HYPO 3

3.3.2 Cô lập hợp chất từ cao etyl acetate

Cao etyl acetate (EA, 15.3 g) được trộn đều với silica gel rồi nạp vào đầu cột sắc

ký, tiếp theo, tiến hành giải ly bằng các hệ dung môi có độ phân cực theo thứ tự tăng dần từ cloroform đến metanol Dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích là 50

ml và được kiểm tra bằng SKLM Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên cao EA được trình bày ở Bảng 3.3

Nhận xét:

Kết quả sắc ký cột trên cao etyl acetate thu được 9 phân đoạn (FEA 1 – FEA 9), trong đó các phân đoạn FEA 4, FEA 6, FEA 8 cho vết chính rõ, đẹp nên được chọn để khảo sát tiếp Các phân đoạn còn lại cho nhiều vết không rõ ràng nên tạm thời chưa

khảo sát

Khảo sát phân đoạn FEA 4 của Bảng 3.3

Phân đoạn FEA 4 (Bảng 3.3) được thu ở dạng bột, sau khi sắc ký cột nhiều lần

Trang 31

với hệ dung ly cloroform − metanol (9:1, 85:15) và sắc ký điều chế, thu được 1 hợp chất bột, màu trắng (6 mg) Khi kiểm tra bằng SKLM trên nhiều hệ dung ly khác nhau hợp chất này chỉ cho một vết duy nhất màu tím đen hiện hình bằng dung dịch H2SO4

30%, đun nóng bản (Hình 3.3) Hợp chất này được ký hiệu là HYPO 6

Phân đoạn FEA6 được sắc ký cột với hệ dung môi giải ly cloroform − metanol (8:2), thu được một chất dạng tinh thể, màu vàng (8 mg) Kiểm tra bằng SKLM trên nhiều hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết màu vàng duy nhất và chuyển sang màu tím đen khi hiện hình bằng dung dịch H2SO4 30%, đun nóng bản (Hình 3.3) Hợp chất này được ký hiệu là HYPO 5

Phân đoạn FEA 8 được sắc ký cột lần lượt với hệ dung môi giải ly cloroform : metanol (8:2, 75:25, 7:3) thu được một chất dạng bột, màu trắng (10 mg) Kiểm tra bằng SKLM trên nhiều hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết duy nhất màu tím sen khi hiện hình bằng dung dịch H2SO4 30%, đun nóng bản (Hình 3.2) Hợp chất này được ký hiệu là HYPO 4

Phần khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất HYPO 4 được trình bày trong mục

3.4

3.3.3 Cô lập hợp chất từ cao metanol 1

Cao metanol 1 (M, 15 g) được trộn đều với silica gel rồi nạp vào đầu cột sắc ký,

Trang 32

tiếp theo, tiến hành giải ly bằng các hệ dung môi có độ phân cực theo thứ tự tăng dần C:Me:H2O (18:6:1; 14:6:1) Dịch giải ly được chứa trong các lọ có dung tích là 50 ml

và được kiểm tra bằng SKLM Các lọ cho kết quả SKLM giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên cao M được trình bày ở Bảng 3.4

Nhận xét:

Kết quả sắc ký cột trên cao metanol 1 thu được 5 phân đoạn (FM 1 – FM 5), trong đó các phân đoạn FM 4 cho các vết chính rõ, đẹp nên được chọn để khảo sát tiếp

Các phân đoạn còn lại cho nhiều vết không rõ ràng nên tạm thời chưa khảo sát

Khảo sát phân đoạn FM 4 của Bảng 3.4

Phân đoạn FM 4 được sắc ký cột lần lượt với hệ dung môi giải ly C:Me:H2O (18:6:1; 14:6:1) sau đó sắc ký cột pha đảo với hệ dung môi giải ly H2O : metanol (6 : 4) thu được hai chất bột, màu trắng

Chất thứ nhất (7 mg), kiểm tra bằng SKLM trên nhiều hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết duy nhất màu xám đen hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản (Hình 3.2g), hợp chất này được ký hiệu là HYPO 7

Chất thứ nhì (6 mg), kiểm tra bằng SKLM trên nhiều hệ dung ly khác nhau chỉ cho một vết duy nhất màu tím xanh hiện hình bằng dung dịch H2SO4 50%, đun nóng bản (Hình 3.2h), hợp chất này được ký hiệu là HYPO 8

Phần khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất HYPO-7 và HYPO-8 được trình bày trong mục 3.4

Trang 33

Bảng 3.2 Sắc ký cột silica gel trên cao cloroform (17 g)

Trọng lượng cao (mg)

FC 8 90 – 97 C : M (90 : 10) 850 Sắc ký cột nhiều lần, thu được HYPO 2

FC 9 98 – 105 C : M (90 : 10) 480 Sắc ký cột nhiều lần, thu được HYPO 3

Trang 34

Bảng 3.3 Sắc ký cột silica gel trên cao etyl acetate (15,3 g)

Trọng lượng cao (mg)

Ghi chú

FEA 1 1 – 10 C (100%) 1510 Không khảo sát

FEA 2 11– 30 C : M (95 : 5) 1200 Không khảo sát

FEA 3 31 – 50 C : M (9 : 1) 1380 Không khảo sát

FEA 4 51 – 70 C : M (85 : 15) 2040 Sắc ký cột nhiều lần thu được HYPO 6 FEA 5 71 – 90 C : M (8 : 2) 1540 Không khảo sát

FEA 6 91 – 110 C : M (8 : 2) 1270 Sắc ký cột nhiều lần thu được HYPO 5 FEA 7 111 – 130 C : M (75 : 15) 1280 Không khảo sát

FEA 8 131 – 150 C : M (7 : 3) 1150 Sắc ký cột nhiều lần thu được

HYPO 4

FEA 9 151 – 190 C : M (6 : 4) đến M (100%) 1920 Không khảo sát

Trang 35

Bảng 3.4 Sắc ký cột silica gel trên cao metanol 1 (15,0 g)

Định dạng
Số trang	70
Dung lượng	5,59 MB