Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở việt nam

MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI 4 1.1.1. Các Microbiota bản địa 5 1.1.2. Các Microbiota bệnh 6 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU MICROBIOTA 7 1.2.1. Phƣơng pháp cổ điển 7 1.2.2. Phƣơng pháp sinh học phân tử 7 1.2.3. Kết hợp phƣơng pháp nuôi cấy cổ điển v phƣơng pháp hiện đại 9 1.3. MICROBIOTA DẠ DÀY NGƢỜI 9 1.3.1. Microbiota bản địa dạ dy ngƣời khỏe mạnh 10 1.3.2. Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh 11 1.4. HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY 12 1.4.1. Các dấu hiệu nhận biết chảy máu dạ dày 12 1.4.2. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày 13 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 16 2.2. PHƢƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 16 2.2.2. Hóa chất, thiết bị máy móc 16 2.2.3. Địa điểm thực hiện nghiên cứu 17 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.3.1. Khám lâm sàng 19 2.3.2. Nội soi và lấy bệnh phẩm 19 2.3.3. Đo pH dịch vị dạ dày 19 2.3.4. Nuôi cấy và phân lập chủng vi khuẩn 20 2.3.5. Nhuộm Gram v quan sát dƣới kính hiển vi thƣờng 21 2.3.6. Test Helicotest 21 2.3.7. Tách chiết ADN từ vi khuẩn và từ sinh thiết 21 2.3.8. Xác định HPstatus của các bệnh nhân 21 2.3.9. PCR nhân gen 23S rARN của H. pylori 22 2.3.10. PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn 23 2.3.11. Giải trình tự 23 2.3.12. Định tên vi khuẩn 24 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25 3.1. ĐẶC ĐIỂM CÁC BỆNH NHÂN 26 3.1.1. Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày 26 3.1.2. Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân 27 3.2. XÁC ĐỊNH HP STATUS CỦA CÁC BỆNH NHÂN 28 3.3. PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ 31 3.4. NGHIÊN CỨU CÁC VI KHUẨN 35 3.4.1. Xác định Gram của các chủng phân lập 35 3.4.2. Định tên vi khuẩn 35 KẾT LUẬN 44 KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO 46 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi và giới tính ……………… 26 Bảng 2. Kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn H. pylori của 27 bệnh nhân ………………………………………………… 30 Bảng 3. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn …………………………………………… 31 Bảng 4. Tên các loài vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm …………………………… 39 Bảng 5. Một số đặc điểm của các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí từ Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu …………………………… 42 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ v ngƣời gi ……………… 5 Hình 2. Cấu trúc bậc hai của 16S rARN ……………………………………………… 8 Hình 3. Microbiota đƣờng tiêu hóa của ngƣời ……………………………………… 10 Hình 4. Hình ảnh nội soi niêm mạc dạ dày xuất huyết ………………………… 13 Hình 5. Đĩa môi trƣờng thạch máu dùng để nuôi cấy vi khuẩn …………………… 17 Hình 6. Hộp giấy đo pH 0~14 (EMD-Mỹ) ………………………………………… 19 Hình 7. Hệ thống bình nuôi cấy kị khí …………………………………………… 20 Hình 8. Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dy ……… 27 Hình 9. Ảnh chụp dạ dày xuất huyết của 27 bệnh nhân …………………………… 28 Hình 10. Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh nhân……………………………………………………………………………………31 Hình 11. Hình ảnh các khuẩn lạc đƣợc nhận định ban đầu giống với H. pylori … 32 Hình 12. H. pylori sau khi nhuộm Gram dƣới kính hiển vi quang học ………………33 Hình 13. Kết quả thử hoạt tính Urease bằng Helicotest …………………………… 33 Hình 14. Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H. pylori …………… 33 Hình 15. Các chủng H. pylori phân lập ở điều kiện kị khí ………………………… 34 Hình 16. Một số chủng vi khuẩn đƣợc phân lập và làm sạch ở điều kiện kị khí ….….34 Hình 17. Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn dƣới kính hiển vi Olympia …………… 35 Hình 18. Sản phẩm PCR khuếch đại từ gen 16S rARN ………………………………36 1 MỞ ĐẦU Biến đổi khí hậu Toàn cầu đi kèm với suy thoái tài nguyên, ô nhiễm môi trƣờng lm thay đổi toàn diện, sâu sắc các hệ sinh thái tự nhiên, dẫn đến sự thay đổi nhiều bệnh đ biết cũng nhƣ sự xuất hiện của nhiều bệnh mới. Đây là những thách thức lớn nhất của nhân loại trong thế kỷ 21. Viêm dạ dày cấp tính chảy máu là một Hội chứng hay gặp ở ngƣời trƣởng thành - lứa tuổi phải chịu nhiều áp lực từ công việc lao động, xã hội v gia đình cũng nhƣ dễ nhiễm những thói quen sinh hoạt có hại cho sức khỏe nhƣ hút thuốc lá, nhậu nhẹt và rƣợu chè. Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, cả những ngƣời 20 tuổi cũng bị chảy máu dạ dày. Nguyên nhân sự dịch chuyển về tuổi tác của Hội chứng chƣa đƣợc xác định. Viêm dạ dày cấp tính chảy máu l đợt tiến triển cấp tính của viêm dạ dày mạn tính, có thể biểu hiện bất ngờ và gây ảnh hƣởng nặng nề đến khả năng lao động cũng nhƣ chất lƣợng cuộc sống của ngƣời bệnh. Hội chứng có tỷ lệ tái phát cao sau khi điều trị. Nguyên nhân chính gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu vẫn đang còn l vấn đề tranh cãi [6], [30]. Mối liên quan giữa các bệnh lý viêm loét dạ dày và biến chứng chảy máu dạ dày với vi khuẩn Helicobacter pylori đ đƣợc thừa nhận. Các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu đƣợc điều trị khỏi nhờ liệu pháp kháng sinh. Tuy nhiên thực tế y học lâm sng đ xác nhận, có nhiều trƣờng hợp bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu không nhiễm H. pylori, nhƣng khi phác đồ điều trị có kháng sinh thì mang lại kết quả tốt. Vấn đề đặt ra là, ngoài H. pylori trong dạ dy ngƣời còn có thể có các loài vi khuẩn nào khác liên quan mà khoa học chƣa biết? Hiện tại, trên thế giới cũng nhƣ ở Việt Nam chƣa có nhiều công trình nghiên cứu về viêm dạ dày cấp tính chảy máu và vì thế có ít thông tin về thành phần 2 Microbiota dạ dày của ngƣời bệnh. Sự hạn chế ny có thể ảnh hƣởng rất nhiều đến hiệu quả điều trị – theo dõi diễn biến bệnh cho bệnh nhân. Xuất phát từ nhu cầu hiểu biết và phục vụ công tác chẩn trị các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu, chúng tôi tiến hnh đề tài nghiên cứu “Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở Việt Nam", với mục tiêu là góp phần tìm hiểu thêm về các vi khuẩn có mặt Microbiota dạ dày của nhóm bệnh nhân này. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập các loại vi khuẩn từ bệnh phẩm dạ dày chảy máu ở điều kiện kị khí. 2. Xác định tỷ lệ nhiễm H. pylori của các bệnh nhân. 3. Định tên các vi khuẩn bằng phƣơng pháp giám định gen 16S rARN. 4. Tham khảo các đặc tính của các vi khuẩn đƣợc phân lập qua các dữ liệu trên Internet. 3 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI Microbiota đƣợc định nghĩa l quần thể vi sinh vật sống trong cùng một ổ sinh thái hoặc ở một giai đoạn địa lý riêng biệt. Trong cơ thể ngƣời, các Microbiota gồm khoảng 1000 loài khác nhau. Số lƣợng vi khuẩn trong các ổ sinh thái cộng lại khoảng 10 14 tế bào vi khuẩn, có khối lƣợng khoảng 2 kg, nhiều gấp 10 lần số tế bo cơ thể ngƣời. Microbiota đƣợc hình thành trong quá trình phát triển của con ngƣời, đạt cao điểm ở tuổi trƣởng thành và thoái hóa ở tuổi gi. Nhƣ đ biết, sự ra đời của trẻ sơ sinh gắn liền với sự hình thành nhanh chóng của hệ vi sinh vật đƣờng tiêu hóa với số lƣợng lên tới 10 11 vi khuẩn trên một gram phân: chỉ 24 tiếng sau khi sinh, các loài vi khuẩn nhƣ Enterobacteriaceae, Enterococcus, Lactobacillus, vi khuẩn gây thối Clostridium và Staphylococcus đ xuất hiện trong phân của trẻ. Hình 1 giới thiệu sự khác biệt của các Microbiota ở ngƣời trẻ v ngƣời già trên 100 tuổi [24]. Thành phần các vi sinh vật trong các Microbiota có thể thay đổi dẫn đến bệnh tật [24]. Chẳng hạn, các bệnh nhân bị tiểu đƣờng tuýp 2 có Microbiota đƣờng ruột bị thoái hóa. Các vi khuẩn sản xuất butyrate, đóng vai trò quan trọng trong cung cấp năng lƣợng cho các tế bo biểu mô v điều khiển các đáp ứng của tế bo chủ giảm đáng kể, trong khi đó các vi khuẩn gây bệnh mang chức năng khử sulphate và kháng với stress oxy hóa lại tăng [54]. Còn rất nhiều điều chƣa biết về thành phần các Microbiota của ngƣời, do khoảng 99% các loài vi khuẩn không thể nuôi cấy đƣợc trong các phòng thí nghiệm [12]. Hiện nay, các nhà khoa học đang áp dụng Metagenomic kết hợp với Genomic, Tin sinh học để tiếp cận thế giới vi sinh vật. Metagenomics cho phép xác định các loài vi sinh vật có trong quần thể vi sinh vật Microbiota phức tạp không cần nuôi cấy chúng. Phân tích Metagenomic cho thấy, mặc dù các Microbiota có thể khác nhau về thành phần do các chế độ ăn uống, nhƣng mỗi ngƣời đều mang một số vi khuẩn đặc trƣng v không thay đổi theo thời gian, bao gồm 400 loại ở ngƣời khỏe mạnh [36]. 5 Hình 1. Sự khác biệt giữa các Microbiota của ngƣời trẻ v ngƣời già [24] Các Microbiota đƣợc chia thành hai loại dựa theo tiêu chí, liệu chúng có gây hại hay không đối với con ngƣời: - Các Microbiota bản địa, bao gồm các vi sinh vật cộng sinh cƣ trú thƣờng xuyên ở mắt v da, đƣờng hô hấp trên, đƣờng tiêu hóa trên v dƣới, đƣờng tiết niệu v sinh sản của phụ nữ v nam giới, dịch cơ thể v máu. - Các Microbiota bệnh, bao gồm các vi sinh vật cơ hội gây hại cho ngƣời. Các loài vi khuẩn sống trong các Microbiota có thể l loi cƣ trú thƣờng xuyên, loi vng lai v loi đi ngang qua ổ sinh thái. Trong một số điều kiện đặc biệt, các vi sinh vật cơ hội có thể xuất hiện. 1.1.1. Các Microbiota bản địa Microbiota của ngƣời khỏe mạnh hay còn đƣợc gọi là bản địa bao gồm các vi Một số vi khuẩn tạo butyrate và loại gây bệnh Nhiều vi khuẩn tạo butyrate Ngƣời trẻ 24-40 tuổi Ngƣời trăm tuổi 99-104 tuổi Một số vi khuẩn tạo butyrate và loại gây bệnh Nhiều vi khuẩn tạo butyrate Ngƣời trẻ 24-40 tuổi Ngƣời trăm tuổi 99-104 tuổi 6 sinh vật không gây bệnh, chủ yếu là vi khuẩn và một vài loại nấm, prostist sống ở khoang miệng, thực quản, đƣờng tiêu hóa, mũi, họng, da và vùng gần quanh mắt. Các loài vi sinh vật ny giúp đỡ bảo vệ cơ thể ngƣời chống lại các loài vi sinh vật gây bệnh do: i. ganh đua gắn với các tế bào biểu bì hoặc tế bào niêm mạc của ngƣời. ii. tranh giành vị trí sinh thái. iii. tranh giành thức ăn để sống. iv, tiết ra các chất giết các loài gây bệnh. Các vi sinh vật trong quần thể Microbiota bản địa gồm (i) các loài vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên không gây hại v có mối quan hệ tƣơng hỗ với ngƣời; (ii) các vi sinh vật vãng lai bao gồm các vi sinh vật chỉ tồn tại một thời gian ngắn từ một vi ngy đến vi tuần trong cơ thể ngƣời do không thể cạnh tranh với các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, bị hệ miễn dịch của chủ tấn công v các điều kiện ở mới thích hợp cho sự phát triển của chúng; (iii) các vi sinh vật đi ngang qua một Microbiota đến một Microbiota khác. 1.1.2. Các Microbiota bệnh Trong điều kiện bình thƣờng, các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh vật vng lai cũng nhƣ các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota bản địa không gây tác hại cho con ngƣời. Tuy nhiên khi Microbiota bản địa thay đổi do nhiều lý do nhƣ bị tổn thƣơng trong các trƣờng hợp viêm nhiễm và các bệnh tự miễn (bệnh Crohn, bệnh loét ruột kết, bệnh viêm khớp, bệnh tiểu đƣờng loại 1, bệnh đa khớp, bệnh béo phì ), một vi trong số các vi sinh vật cƣ trú thƣờng xuyên, các vi sinh vật vng lai v ngay đến các vi sinh vật đi ngang qua Microbiota có thể trở thnh vi sinh vật cơ hội gây bệnh. Theo y học hiện đại, các nguyên nhân dẫn đến sự hình thành Microbiota bệnh mang các vi sinh vật cơ hội gây bệnh gồm ba khả năng: 1. Hệ miễn dịch của con ngƣời làm việc sai lệch, các quần thể bản địa có thể phát triển vƣợt và chuyển đến các vùng khác của cơ thể. Ví dụ Escherichia coli thƣờng sống [...]... chỉ có ở các bệnh nhân bị HIV/AIDS đã đƣợc tìm thấy trong thƣợng và hạ vị của các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày [29] Nấm Candida parapsilosis cũng đã đƣợc tìm thấy trong Microbiota dạ dày của các bệnh nhân bị vi m dạ dày mãn tính [10] 1.4 HỘI CHỨNG CHẢY MÁU DẠ DÀY Vi m dạ dày cấp tính chảy máu là hậu quả của các tổn thƣơng vi m loét dạ dày cấp hoặc mãn tính không đƣợc điều trị triệt để Y học hiện. .. cao ở các bệnh nhân bị vi m dạ dày cấp tính chảy máu xác nhận vai trò gây bệnh lý của vi khuẩn, mặt khác báo động tình trạng đỏ của vệ sinh cộng đồng và vệ sinh an toàn thực phẩm cũng nhƣ tình trạng ô nhiễm môi trƣờng hiện nay 3.3 PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sinh thiết dạ dày của 27 bệnh nhân trong điều kiện kị khí Để đảm bảo các khuẩn lạc nhận đƣợc là vi khuẩn. .. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ gây chảy máu dạ dày Chảy máu dạ dày có nhiều nguyên nhân, trong thực tế thƣờng khó xác định chắc chắn vì trên một bệnh nhân có thể có sự phối hợp của nhiều yếu tố Đó là: a) Loét và vi m dạ dày Loét và vi m dạ dày thƣờng gặp ở các bệnh nhân nhiễm H pylori Chảy máu do loét hoặc vi m dạ dày gây mất nhiều máu, có thể dẫn đến tình trạng thiếu máu trầm trọng Các bệnh nhân. .. chỉ có bệnh nhân số 25 có pH dịch vị 26 kiềm ~8 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Hình 8 Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dày 3.1.2 Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân Các hình ảnh chụp nội soi chảy máu dạ dày của các bệnh nhân đƣợc trình bày ở hình 9 Xem xét hình ảnh, có thể nhận thấy niêm mạc dạ dày ngƣời bệnh bị phù nề, có các vùng... pylori lâu ngày và bị vi m, loét, ung thƣ dạ dày, các loại vi sinh vật nhƣ nấm, vi khuẩn đã đƣợc phân lập [51], [14], [23] Năm 1990-1991, vi khuẩn Gastrospirillum hominibee đƣợc phát hiện trong dạ dày ngƣời bệnh vi m dạ dày mạn tính [44], [65] Ở Vi t Nam, năm 2004, GS Giao và cộng sự đã công bố một số vi khuẩn phân lập ở điều kiện kỵ khí từ sinh thiết dạ dày của ngƣời bệnh Vi t Nam [5] Nấm Candida... các nghiên cứu của một số tác giả khác trong nƣớc và ngoài nƣớc thì độ tuổi trung bình của các bệnh nhân bị vi m dạ dày cấp tính chảy máu trong nghiên cứu của chúng tôi trẻ hơn nhiều [4], [2], [27], [16]: cả những ngƣời . các bệnh nhân bị vi m dạ dày cấp tính chảy máu, chúng tôi tiến hnh đề tài nghiên cứu Sự hiện diện của các vi khuẩn kị khí ở các bệnh nhân bị chảy máu dạ dày ở Vi t Nam& quot;, với mục tiêu. dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dy ……… 27 Hình 9. Ảnh chụp dạ dày xuất huyết của 27 bệnh nhân …………………………… 28 Hình 10. Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh. thêm về các vi khuẩn có mặt Microbiota dạ dày của nhóm bệnh nhân này. Nội dung nghiên cứu của luận văn bao gồm: 1. Phân lập các loại vi khuẩn từ bệnh phẩm dạ dày chảy máu ở điều kiện kị khí.