1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI
3.3.PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ
Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sinh thiết dạ dày của 27 bệnh nhân trong điều kiện kị khí. Để đảm bảo các khuẩn lạc nhận đƣợc là vi khuẩn phát triển từ mẫu bệnh, một đĩa môi trƣờng máu đƣợc trải với 30 µl dịch NaCl đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Sau 3-5 ngày ở điều kiện kỵ khí, 23/27 (85,1%) các mẫu bệnh phẩm cho kết quả nuôi cấy dƣơng tính.
Bảng 3. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn
Số bệnh nhân nhiễm vi khuẩn (n = 27) Số lƣợng Tỷ lệ
Âm tính 4 14,81%
Dƣơng tính 23 85,19%
Kết quả cho thấy, một bệnh nhân có thể (i) bị nhiễm một hay nhiều loại vi khuẩn; (ii) các khuẩn lạc đa dạng về hình thái, màu sắc, kích thƣớc, số lƣợng; (iii) các đĩa nuôi cấy giữa các bệnh nhân khác nhau mang các khuẩn lạc khác nhau (Hình 10).
Hình 10. Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh nhân Nguyễn Văn T. 57t (A); BN Vũ Ngọc C. 34t (B); BN Nguyễn Thị H. 57t (C)
Đặc biệt, trên nhiều đĩa nuôi cấy đầu tiên còn thấy một loại khuẩn lạc màu trắng trong, nhỏ li ti nhƣ đầu mũi kim, có trƣờng hợp nhƣ những phẩy bụi bé rất khó nhận thấy (Hình 11). Bằng kinh nghiệm chúng tôi nhận thấy chúng rất giống với khuẩn lạc của Helicobacter pylori, một loại vi khuẩn cƣ trú thƣờng xuyên trong Microbiota dạ dày ngƣời [45].
Để khẳng định chúng có phải là H. pylori không, các phân tích bao gồm (i) test thử Urease; (ii) nhuộm Gram trên tiêu bản; (iii) kiểm tra sự có mặt của gen 23S rARN
đƣợc tiến hành. Những vi khuẩn nào có hình dấu phẩy đặc trƣng dƣới kính hiển vi, bắt màu hồng đỏ với thuốc nhuộm Gram (Hình 12); dƣơng tính với test Urease (Hình 13), và mang gen 23S rARN tƣơng đồng >98 % với gen 23 S rARN của H. pylori (Hình 14) đƣợc xác định là H. pylori. (Trình tự gen 23S rARN của các chủng H. pylori đƣợc trình bày ở Phụ lục IV). Hình 15 là một số chủng trong số 16 chủng H. pylori đƣợc phân lập ở điều kiện kị khí.
Hình 11. Hình ảnh các khuẩn lạc đƣợc nhận định giống với H. pylori
Hình 12.H. pylori sau khi nhuộm Gram dƣới kính hiển vi quang học
Hình 14. Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H. pylori
(1-16): Sản phẩm PCR gen 23S rARN, (N): đối chứng âm, (D): đối chứng dƣơng
Hình 13. Kết quả thử hoạt tính Urease bằng Helicotest
Dƣơng tính: mẫu 2, 3, 4 và 6 (màu đỏ cánh sen). Âm tính: 1 và 5 (màu vàng)
Hình 15. Các chủng H. pylori phân lập ở điều kiện kị khí
Đối với các khuẩn lạc vi khuẩn không phải H. pylori mọc đa dạng trên đĩa nhƣ đã chỉ ra ở trên, chúng tôi cũng tiến hành các bƣớc phân lập và làm sạch từng loại khuẩn lạc ở điều kiện kị khí. quá trình đƣợc nhắc laị từ 3-5 lần cho đến khi nhận đƣợc chủng vi khuẩn thuần nhất, không bị nhiễm. Kết quả phân lập đƣợc 26 chủng vi khuẩn ngoài H. pylori. Các khuẩn lạc vi khuẩn mọc tốt, đồng nhất, và thể hiện rõ sự khác biệt về hình dạng, màu sắc, kích thƣớc khuẩn lạc giữa các chủng. Hình 16 là đĩa phân lập cuối cùng của một số chủng vi khuẩn.