PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn

1. HỆ VI SINH VẬT MICROBIOTA CỦA NGƢỜI

2.3.10. PCR nhân gen 16S rARN của vi khuẩn

1-10 ng ADN tách chiết từ các chủng vi khuẩn đƣợc sử dụng làm khuôn để khuếch đại gen 16S rARN của vi khuẩn. Cặp mồi đƣợc sử dụng để nhân toàn bộ gen

16S rARN [63]: Mồi Trình tự mồi (5' - 3') Kích thƣớc sản phẩm PCR 8F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG ~ 1,5 kb 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT Chƣơng trình PCR: - Bƣớc 1: T = 94oC, 5 phút - Bƣớc 2: T = 94oC, 60 giây - Bƣớc 3: T = 55oC, 45 giây - Bƣớc 4: T = 72oC, 45 giây Lặp lại 35 chu kỳ từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 - Bƣớc 5: T = 72oC, 5 phút 2.3.11. Giải trình tự

Sản phẩm PCR khuếch đại gen của các chủng vi khuẩn đƣợc làm sạch bằng Kit QIAquick PCR Purification của hãng Qiagen (Đức), và đƣợc gửi đi giải trình tự tại hãng Macrogen (Mỹ). Kết quả giải trình tự của gen có thể mang lỗi nhƣ đọc thiếu nucleotide; không xác định đƣợc nucleotide; các nucleotide bị gối lên nhau... Vì vậy

cần tiến hành phân tích những sai sót đó, căn cứ vào trình tự trên hai mạch đơn theo nguyên tắc bổ sung giữa hai mạch.

2.3.12. Định tên vi khuẩn

Các trình tự gen 16S rARN thu đƣợc sau khi giải trình tự đƣợc quét bằng chƣơng trình Blast qua kho dữ liệu NCBI Databasesđể so sánh với trình tự các vi sinh vật đã biết lƣu trữ trong Database, qua đó định tên chủng vi khuẩn.

CHƢƠNG III

3.1. ĐẶC ĐIỂM CÁC BỆNH NHÂN 3.1.1. Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày 3.1.1. Đặc điểm tuổi, giới, độ pH dạ dày

Các đặc điểm về tuổi và giới tính của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu (danh sách bệnh nhân đƣợc liệt kê trong phần phụ lục I) đƣợc liệt kê ở bảng 1.

Bảng 1. Phân bố bệnh nhân nghiên cứu theo nhóm tuổi và giới tính

Giới Nhóm tuổi Tổng <19 <20-29 <30-39 <40-49 <50-59 >60 Nam 0 4 7 2 2 0 15 Nữ 0 3 4 3 2 0 12 Tổng 0 7 11 5 4 0 27 Tỉ lệ % 0 25,9 40,7 18,5 14,8 0 100 Tuổi trung bình 36,3

Qua bảng, có thể thấy viêm dạ dày cấp tính chảy máu gặp chủ yếu ở các bệnh nhân có độ tuổi trung bình là 36,3, nhiều nhất ở nhóm tuổi 30-39 với tỷ lệ 40,7%. Kết quả này tƣơng tự nhƣ trong nghiên cứu của Bs. Sinh, Bệnh viện Giao thông Vận Tải năm 2010 [9]. Trong số 27 bệnh nhân nghiên cứu, nam có 15 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ 55,6 %, nữ có 12 trƣờng hợp chiếm tỷ lệ 44,4 %. Sự khác biệt giữa 2 giới không có ý nghĩa thống kê (P>0,05). Kết quả này cũng khá giống với một số nghiên cứu khác [9], [1].

Tuy nhiên, khi so sánh với các nghiên cứu của một số tác giả khác trong nƣớc và ngoài nƣớc thì độ tuổi trung bình của các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu trong nghiên cứu của chúng tôi trẻ hơn nhiều [4], [2], [27], [16]: cả những ngƣời <30 tuổi cũng bị chảy máu. Sự trẻ hóa tuổi trung bình của các bệnh nhân cho thấy có sự thay đổi đặc điểm dịch tễ của bệnh.

kiềm ~8.

Hình 8. Xác định độ pH dịch dạ dày của 27 bệnh nhân bị chảy máu dạ dày

3.1.2. Hình ảnh nội soi dạ dày của các bệnh nhân

Các hình ảnh chụp nội soi chảy máu dạ dày của các bệnh nhân đƣợc trình bày ở hình 9. Xem xét hình ảnh, có thể nhận thấy niêm mạc dạ dày ngƣời bệnh bị phù nề, có các vùng trợt và xuất huyết. Các vết trợt và vị trí chảy máu phân bố lan tỏa khắp niêm mạc hoặc phân bố khƣ trú. Tại địa điểm bị chảy máu có thể có những đám bầm tím hoặc chảy màu vào trong lòng dạ dày.

Các bệnh nhân 1, 3, 5, 6, 9, 10, 12, 14, 15, 18, 21 có hình ảnh nội soi chảy máu dạ dày mức độ nhẹ, nốt chảy máu nhỏ màu đỏ hoặc nâu sẫm rải rác. Các bệnh nhân 7, 8, 11, 16, 17, 19, 24, 25, 26 chảy máu dạ dày mức độ vừa, có một lƣợng vừa phải những nốt nhỏ, vừa, mảng trợt xuất huyết nhỏ màu đỏ, nâu hoặc đen trên nền niêm mạc dạ dày phù nề, xung huyết. Các bệnh nhân 2, 4, 13, 20, 22, 23, 27 chảy máu dạ dày mức độ nặng, có nhiều mảng viêm trợt vừa và lớn trong dạ dày, hình ảnh là những mảng viêm trợt đen.

3.2. XÁC ĐỊNH HP STATUS CỦA CÁC BỆNH NHÂN

Nhiễm H. pylori, hay còn đƣợc gọi là HPstatus của 27 bệnh nhân đƣợc xác định dựa trên kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn (bao gồm gen glmM, gen hspA,

Hình 9. Ảnh chụp dạ dày xuất huyết của 27 bệnh nhân 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

gen cagA, gen 23S rARN. PCR nhân các gen này trực tiếp từ mẫu ADN genome tách từ sinh thiết dạ dày của bệnh nhân.

Chúng tôi xem xét đồng thời nhiều gen bởi lẽ trên thực tế, rất nhiều chủng H.

pylori có thể có hoặc khiếm khuyết một số gen, nghĩa là có khả năng mẫu bệnh phẩm

chứa vi khuẩn H. pylori nhƣng vì không có gen nên không đƣợc thể hiện trên kết quả PCR. Bên cạnh đó, lại có thể có những loài vi khuẩn khác chƣa biết cũng có chứa những gen tƣơng tự nhƣ gen của H. pylori, đồng nghĩa với việc, có sự xuất hiện của gen nhƣng chƣa chắc sản phẩm PCR ấy đã đƣợc khuếch đại từ gen của H. pylori. Việc kết hợp nghiên cứu trên nhiều gen và thống kê sự xuất hiện đồng thời của các gen ấy trong mẫu ADN bệnh phẩm cho phép chúng tôi khẳng định chắc chắn hơn về sự xuất hiện của vi khuẩn H. pylori trong mẫu sinh thiết bệnh nhân, cũng nhƣ tỷ lệ nhiễm H.

pylori ở các bệnh nhân này.

Kết quả nhân từng gen đƣợc trình bày trong bảng 2. Bệnh nhân đƣợc cho là bị nhiễm H. pylori đƣợc xác định là có chứa tất cả hoặc ít nhất là 3/4 gen nghiên cứu. Sau khi thống kê sự xuất hiện của các gen, chúng tôi xác định đƣợc tỷ lệ bệnh nhân nhiễm HP là 23/27 bệnh nhân, chiếm 85,19%.

Nhiễm H. pylori là một trong các nguyên nhân gây viêm dạ dày cấp tính chảy máu ở ngƣời. Ngoài gây bệnh, vi khuẩn H. pylori, do ức chế tiết axit dạ dày, còn thúc đẩy quá trình định cƣ của các loại vi khuẩn khác trong Microbiota dạ dày. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các bệnh nhân nhiễm H. pylori hay mang HPstatus+ chiếm 85,19 %. Tỉ lệ này cao hơn so với kết quả trong nghiên cứu của các tác giả khác trong nƣớc. Theo Quách Trọng Đức và cộng sự (2009), tỷ lệ nhiễm H. pylori chỉ là 49,6 % [3]; còn trong nghiên cứu của GS Tạ Long và cộng sự (2010), tỷ lệ này dao động từ 61,2 đến 78,9 % [8]. Con số này cũng cao hơn so với tỷ lệ nhiễm ở các nƣớc phát triển có điều kiện kinh tế - xã hội nhƣ Ý 46,9 % [26]; Nhật Bản 47,8 % [59].

Bảng 2. Kết quả phân tích 4 gen chỉ thị của vi khuẩn H. pylori của 27 bệnh nhân

STT Mã số BN

PCR

glmM hspA cagA 23S rRNA

1 1B - + + + 2 2B - - - - 3 3B + + + + 4 4B + + + + 5 5B + + + + 6 6B - + + + 7 7B + + - + 8 8B + + + + 9 9B + + + + 10 10B - - - - 11 11B + + + + 12 12B + + + + 13 13B - - - - 14 14B + + + + 15 15B + + + + 16 16B - - - - 17 17B + + + + 18 18B + + + + 19 19B + + + + 20 20B + + + + 21 21B + + + + 22 22B + + + + 23 23B + + + + 24 24B + + + + 25 25B + + + + 26 26B + + + + 27 27B + + + +

Số ngƣời nhiễm H. pylori cao ở các bệnh nhân bị viêm dạ dày cấp tính chảy máu xác nhận vai trò gây bệnh lý của vi khuẩn, mặt khác báo động tình trạng đỏ của vệ sinh cộng đồng và vệ sinh an toàn thực phẩm cũng nhƣ tình trạng ô nhiễm môi trƣờng hiện nay.

3.3. PHÂN LẬP CÁC VI KHUẨN Ở ĐIỀU KIỆN KỊ KHÍ

Vi khuẩn đƣợc phân lập từ sinh thiết dạ dày của 27 bệnh nhân trong điều kiện kị khí. Để đảm bảo các khuẩn lạc nhận đƣợc là vi khuẩn phát triển từ mẫu bệnh, một đĩa môi trƣờng máu đƣợc trải với 30 µl dịch NaCl đƣợc sử dụng làm mẫu đối chứng âm. Sau 3-5 ngày ở điều kiện kỵ khí, 23/27 (85,1%) các mẫu bệnh phẩm cho kết quả nuôi cấy dƣơng tính.

Bảng 3. Tỷ lệ bệnh nhân nhiễm vi khuẩn

Số bệnh nhân nhiễm vi khuẩn (n = 27) Số lƣợng Tỷ lệ

Âm tính 4 14,81%

Dƣơng tính 23 85,19%

Kết quả cho thấy, một bệnh nhân có thể (i) bị nhiễm một hay nhiều loại vi khuẩn; (ii) các khuẩn lạc đa dạng về hình thái, màu sắc, kích thƣớc, số lƣợng; (iii) các đĩa nuôi cấy giữa các bệnh nhân khác nhau mang các khuẩn lạc khác nhau (Hình 10).

Hình 10. Hình ảnh các khuẩn lạc vi khuẩn trên đĩa thạch máu của một số bệnh nhân Nguyễn Văn T. 57t (A); BN Vũ Ngọc C. 34t (B); BN Nguyễn Thị H. 57t (C)

Đặc biệt, trên nhiều đĩa nuôi cấy đầu tiên còn thấy một loại khuẩn lạc màu trắng trong, nhỏ li ti nhƣ đầu mũi kim, có trƣờng hợp nhƣ những phẩy bụi bé rất khó nhận thấy (Hình 11). Bằng kinh nghiệm chúng tôi nhận thấy chúng rất giống với khuẩn lạc của Helicobacter pylori, một loại vi khuẩn cƣ trú thƣờng xuyên trong Microbiota dạ dày ngƣời [45].

Để khẳng định chúng có phải là H. pylori không, các phân tích bao gồm (i) test thử Urease; (ii) nhuộm Gram trên tiêu bản; (iii) kiểm tra sự có mặt của gen 23S rARN

đƣợc tiến hành. Những vi khuẩn nào có hình dấu phẩy đặc trƣng dƣới kính hiển vi, bắt màu hồng đỏ với thuốc nhuộm Gram (Hình 12); dƣơng tính với test Urease (Hình 13), và mang gen 23S rARN tƣơng đồng >98 % với gen 23 S rARN của H. pylori (Hình 14) đƣợc xác định là H. pylori. (Trình tự gen 23S rARN của các chủng H. pylori đƣợc trình bày ở Phụ lục IV). Hình 15 là một số chủng trong số 16 chủng H. pylori đƣợc phân lập ở điều kiện kị khí.

Hình 11. Hình ảnh các khuẩn lạc đƣợc nhận định giống với H. pylori

Hình 12.H. pylori sau khi nhuộm Gram dƣới kính hiển vi quang học

Hình 14. Sản phẩm PCR khuếch đại gen 23S rARN xác định H. pylori

(1-16): Sản phẩm PCR gen 23S rARN, (N): đối chứng âm, (D): đối chứng dƣơng

Hình 13. Kết quả thử hoạt tính Urease bằng Helicotest

Dƣơng tính: mẫu 2, 3, 4 và 6 (màu đỏ cánh sen). Âm tính: 1 và 5 (màu vàng)

Hình 15. Các chủng H. pylori phân lập ở điều kiện kị khí

Đối với các khuẩn lạc vi khuẩn không phải H. pylori mọc đa dạng trên đĩa nhƣ đã chỉ ra ở trên, chúng tôi cũng tiến hành các bƣớc phân lập và làm sạch từng loại khuẩn lạc ở điều kiện kị khí. quá trình đƣợc nhắc laị từ 3-5 lần cho đến khi nhận đƣợc chủng vi khuẩn thuần nhất, không bị nhiễm. Kết quả phân lập đƣợc 26 chủng vi khuẩn ngoài H. pylori. Các khuẩn lạc vi khuẩn mọc tốt, đồng nhất, và thể hiện rõ sự khác biệt về hình dạng, màu sắc, kích thƣớc khuẩn lạc giữa các chủng. Hình 16 là đĩa phân lập cuối cùng của một số chủng vi khuẩn.

3.4. NGHIÊN CỨU CÁC VI KHUẨN

3.4.1. Xác định Gram của các chủng phân lập

Các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí đƣợc xác định sau nhuộm Gram đa phần là Gram dƣơng (Hình17).

Hình 17. Ảnh chụp một số chủng vi khuẩn dƣới kính hiển vi Olympia

Các vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí thường là loại Gram dương (số 1,2,3,5,6) chỉ có số ít là loại Gram âm (số 4)

3.4.2. Định tên vi khuẩn

Để xác định các vi khuẩn nhận đƣợc là loài nào, chúng tôi tiến hành các bƣớc tách chiết ADN từ các chủng vi khuẩn phân lập, nhân bản toàn bộ gen 16S rARN. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel Agarose 1.5 % (Hình 18), sau đó đƣợc tinh sạch và đọc trình tự gen. Trình tự 16S rARN đƣợc trình bày ở phụ lục III.

1 2 3

1 2 3 4 N P

Hình 18. Sản phẩm PCR khuếch đại từ gen 16S rARN

(1-4): Sản phẩm PCR gen 16S rARN của chủng phân lập số 1 đến chủng 4 N: đối chứng âm, P: đối chứng dƣơng

Các trình tự 16S rARN của các chủng vi khuẩn phân lập sẽ đƣợc xử lý bằng chƣơng trình Blast trên kho dữ liệu NCBI Database để so sánh với các chủng trên ngân hàng thế giới, qua đó định tên loài vi khuẩn. Vi khuẩn định tên có gen 16S rARN tƣơng đồng ít nhất 98% với gen 16S rARN của loài vi khuẩn đã biết. Ví dụ, một chủng vi khuẩn đƣợc định tên là Rothia dentocariosa có gen 16S rARN giống 100% với vi khuẩn đã biết trong quĩ gen.

Rothia dentocariosa ATCC 17931 strain ATCC 17931 16S ribosomal RNA, complete

sequence. Sequence ID: ref|NR_074568.1|Length: 1515Number of Matches: 1 Related Information

Range 1: 4 to 1510GenBankGraphicsNext MatchPrevious Match

Score Expect Identities Gaps Strand

2784 bits(1507) 0.0 1507/1507(100%) 0/1507(0%) Plus/Plus Query 1 GTTTGATTCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAT 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 4 GTTTGATTCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGAT 63 Query 61 GAAGCCTAGCTTGCTAGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACGTGAGTGACCTAC 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 16S rARN

Query 121 CTTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCAATCTCCGC 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 124 CTTTGACTCTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATACGACCAATCTCCGC 183 Query 181 ATGGGGTGTTGGTGGAAAGCGTTATGGAGTGGTTTTAGATGGGCTCACGGCCTATCAGCT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 184 ATGGGGTGTTGGTGGAAAGCGTTATGGAGTGGTTTTAGATGGGCTCACGGCCTATCAGCT 243 Query 241 TGTTGGTGAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 244 TGTTGGTGAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCG 303 Query 301 GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 304 GCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG 363 Query 361 CACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGT 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 364 CACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGT 423 Query 421 AAACCTCTGTTAGCATCGAAGAAGCGAAAGTGACGGTAGGTGCAGAGAAAGCGCCGGCTA 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 424 AAACCTCTGTTAGCATCGAAGAAGCGAAAGTGACGGTAGGTGCAGAGAAAGCGCCGGCTA 483 Query 481 ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGC 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 484 ACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGC 543 Query 541 GTAAAGAGCTTGTAGGCGGTTGGTCGCGTCTGCTGTGAAAGGCTGGGGCTTAACCCTGGT 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 544 GTAAAGAGCTTGTAGGCGGTTGGTCGCGTCTGCTGTGAAAGGCTGGGGCTTAACCCTGGT 603 Query 601 TTTGCAGTGGGTACGGGCTAACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGC 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 604 TTTGCAGTGGGTACGGGCTAACTAGAGTGCAGTAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGC 663 Query 661 GGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAA 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 664 GGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGGTCTCTGGGCTGTAA 723 Query 721 CTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATG 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 724 CTGACGCTGAGAAGCGAAAGCATGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATG 783 Query 781 CCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACG 840 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 784 CCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGGGACATTCCACGTTTTCCGCGCCGTAGCTAACG 843 Query 841 CATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGG 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 844 CATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGAAATTGACGGG 903 Query 901 GGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAA 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 904 GGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCAA 963 Query 961 GGCTTGACATATACTGGACTGCGTCAGAGATGGCGTTTCCCTTCGGGGCTGGTATACAGG 1020 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 964 GGCTTGACATATACTGGACTGCGTCAGAGATGGCGTTTCCCTTCGGGGCTGGTATACAGG 1023 Query 1021 TGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG 1080 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1024 TGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCG 1083 Query 1081 CAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGT 1140 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1084 CAACCCTCGTTCTATGTTGCCAGCACGTGATGGTGGGGACTCATAGGAGACTGCCGGGGT 1143

Query 1141 CAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCA 1200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1144 CAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTTCA 1203 Query 1201 CGCATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCTAA 1260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1204 CGCATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGTTGCGATACTGTGAGGTGGAGCTAATCCCTAA 1263 Query 1261 AAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAG 1320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1264 AAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAG 1323 Query 1321 TAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT 1380 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1324 TAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGT 1383 Query 1381 CAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTGGTGGGGGGAGCCGT 1440 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1384 CAAGTCACGAAAGTTGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCTAACCCTGGTGGGGGGAGCCGT 1443 Query 1441 CGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCG 1500 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 1444 CGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACTAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCG 1503 Query 1501 GCTGGAT 1507 ||||||| Sbjct 1504 GCTGGAT 1510

Từ 26 chủng vi khuẩn phân lập ở điều kiện kị khí, chúng tôi đã xác định đƣợc danh tính của 13 loài vi khuẩn và 1 chủng chƣa có tên. Bảng 4 trình bày tên của các vi khuẩn chúng tôi tìm thấy trong nghiên cứu này và tần số bắt gặp của nó ở các bệnh nhân. Một loại vi khuẩn có thể xuất hiện ở một hay nhiều bệnh nhân. Các chủng đƣợc phân lập chủ yếu thuộc chi Streptococcus và chi Bacillus, chi Rothia. Ngoài ra còn một chủng vi khuẩn chƣa biết tên có trình tự gen 16S rARN không giống bất cứ loài nào đã biết.

Các chủng vi khuẩn thuộc họ Acinetorbacter, Mycobacterium và

Sphingobacterium đƣợc phân lập từ 10 mẫu đối chứng của các bệnh nhân có niêm mạc

dạ dày hoàn toàn bình thƣờng. Không một chủng H. pylori nào đƣợc tìm thấy trong dạ dày của các bệnh nhân thuộc nhóm đối chứng trên.

Bảng 4. Tên các loài vi khuẩn phân lập từ bệnh phẩm STT Tên loài Tần số bắt gặp 1 Actinomyces odontolyticus 3,85 % 2 Bacillus licheniformis 7,69 % 3 Bacillus megaterium 3,85 % 4 Bacillus pumilus 3,85 % 5 Helicobacter pylori 85,19 % 6 Ochrobactrum intermedium 3,85 % 7 Rothia dentocariosa 3,85 % 8 Rothia mucilaginosa 11,54 % 9 Streptococcus infantis 3,85 % 10 Streptococcus parasanguinis 15,38 % 11 Streptococcus pneumoniae 3,85 % 12 Streptococcus rubneri 11,54 % 13 Streptococcus salivarius 23,08 % 14 unknown 3,85 %

Nhƣ chúng ta đã biết, hệ tiêu hóa ngƣời bao gồm nhiều ngăn với hệ vi sinh vật khác nhau. Số lƣợng và chủng loại các vi sinh vật trong hệ tiêu hóa tăng dần khi đi xuống phần dƣới, với số lƣợng nhiều nhất ở manh tràng, trực tràng và ít nhất ở dạ dày. Sở dĩ nhƣ vậy là bởi dạ dày là nơi có độ pH quá axit (1-2) do dịch dạ dày tiết ra, điều kiện này đƣợc coi là quá khắc nghiệt, các loài vi sinh vật trôi rửa từ phía trên thực quản và khoang miệng cũng nhƣ từ phía dƣới ở tá tràng không thể xâm nhập và tồn tại trong dạ dày [43], [55], [56], [64]. Theo GS. Perlin (2013), chỉ có các vi khuẩn chịu đƣợc axit nhƣ H. pylori hay một số vi khuẩn thuộc các chi Lactobacillus, Streptococcus là 2 chi bao gồm các loài chịu đƣợc pH thấp là có khả năng sống sót [29].