Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này

-1- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC KHOA HỌC Nguyễn Ngọc Mai “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này”. -2- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B MỞ ĐẦU Chitin phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, là polysaccharide phổ biến thứ hai sau cellulose. Nó là một chuỗi polymer chứa các đơn phân là N-acetylglucosamine đƣợc liên kết bởi liên kết β-1,4-glucoside, có trọng lƣợng phân tử cao, không hòa tan trong nƣớc và các dung môi hữu cơ khác. Chitin là thành phần cấu trúc chính trong vỏ và lớp biểu bì của động vật chân đốt, giáp xác, các loài côn trùng và trong thành tế bào của nấm. Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành các sản phẩm khác nhau nhƣ N-acetylglucosamine, chitobiose hay chitotriose. Chitinase có trong nhiều loại cơ thể sống khác nhau bao gồm vi khuẩn, nấm, động vật không xƣơng sống, thực vật và động vật có xƣơng sống. Chitinase đƣợc ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp nhƣ là một tác nhân nhằm kiểm soát nấm gây bệnh thực vật, kiểm soát côn trùng. Trong y dƣợc, chitinase có giá trị trong phòng trừ dịch bệnh, tổng hợp chitooligosaccharide hoạt hóa… Hiện nay, ngƣời ta đã nghiên cứu tách chiết chitinase phân giải chitin từ các nguồn khác nhau nhƣ vi khuẩn, nấm, động vật, thực vật… nhƣng chỉ có chitinase do vi sinh vật tổng hợp, đặc biệt là từ nấm sợi mới có hoạt tính cao, ổn định với nhiệt độ và pH. Hiện nay, đối với việc phòng ngừa côn trùng có hại cho cây trồng thì biện pháp biến nhất vẫn là sử dụng thuốc trừ sâu hóa học. Việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học với liều lƣợng ngày càng cao, tần suất nhiều đang ảnh hƣởng nghiêm trọng đến sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng sinh thái. Với ƣu điểm vƣợt trội về sự thân thiện với con ngƣời và môi trƣờng thì thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc sinh học đang là sự lựa chọn có tiềm năng lớn trong xu hƣớng phát triển nền nông nghiệp bền vững. Lecanicillium lecanii là một trong số những chủng nấm entomopathogenic, mà trƣớc đó đã đƣợc biết đến rộng rãi nhƣ Verticillium lecanii, nhƣng hiện nay đƣợc hiểu là một dạng anamorphic trong nhóm Trùng thảo. Hầu -3- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B hết, entomopathogens đều kí sinh trên cơ thể côn trùng. Tuy nhiên, một số entomopathogens có thể tồn tại trên cây trồng. Vì vậy, L. lecanii spp. có thể có hai vật chủ là côn trùng và thực vật. Trong tự nhiên, nấm Lecanicillium spp. kí sinh và gây bệnh đối với côn trùng phá hoại cây, đặc biệt là rệp. Lecanicillium có độc lực rất mạnh đối với một số loài rệp nhƣ: rệp đào (Myzus persicae) và rệp bông (Aphis gossypii). Do vậy, bào tử nấm Lecanicillium spp. rất đƣợc quan tâm trong vấn đề kiểm soát côn trùng và sâu hại cây. Từ những vấn đề thực tiễn đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này”. Mục tiêu đề tài: Sử dụng biện pháp đột biến để cải biến chủng, tăng hoạt tính chitinase. Đồng thời, tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase. Nội dung đề tài: - Gây đột biến chủng nấm lecanicillium lecanii bằng cách sử dụng hóa chất gây đột biến NTG (N–methyl–N'–nitron–nitrosoguanidine) và tia UV (tia cực tím). - Sàng lọc các chủng nấm kí sinh côn trùng có hoạt tính chitinase cao nhất. - Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng đột biến sàng lọc. - Xác định tính chất chitinase. -4- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITINASE 1.1.1. Giới thiệu về chitinase Chitinase [poly-β-1,4-(2-acetalmido-2-deoxy)-D-glucoside glucanohydrolase] thuộc nhóm glycosyl hydrolase, là enzyme thùy phân chitin thành các đơn phân là chitobiose hay chitotriose qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết β-1,4-glucoside giữa C1 và C4 của hai phân tử N-acetyl Glucosamine liên tiếp nhau trong chitin. Kí hiệu của chitinase là EC3.2.1.14 Trong đó: 3 → Hydrolase 2 → Glycosylase 1 → Glycosidase 14 → Chitinase Chitinase còn có các tên gọi khác tùy theo xuất xứ của enzyme là chitodextrinase, β-poly-N-acetylglucosamine, ChiA1 (Bacillus circulans), Chitotriosidase (Homo sapiens), ChiC (Streptomyces griceus)…[98]. Chitinase có thể đƣợc tìm thấy ở những loài có thành phần cấu trúc chứa chitin nhƣ nấm, côn trùng, giáp xác, đến những loài không có chitin nhƣ vi khuẩn, thực vật [59]. Ở những sinh vật chứa chitin, chitinase đóng vai trò chính trong quá trình phát sinh hình thái và phân chia tế bào. Tùy thuộc vào các loài sinh vật khác nhau mà tổng hợp chitinase với mục đích khác nhau. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân hủy chitin tạo ra nguồn carbon. Ở thực vật và động vật, chitinase nằm trong hệ thống chống lại các tác nhân gây bệnh nhƣ nấm bằng cách phá vỡ thành tế bào chứa chitin của nấm [91]. -5- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Cơ chất của chitinase là chitin và một số dẫn xuất của nó. Chitin [111] Chitin [(C 8 H 13 O 5 N) n ] là một trong những dạng polysaccharide phổ biến trong tự nhiên, đƣợc tạo thành bởi các đơn phân là N-acetylglucosamine liên kết với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside. Về mặt cấu trúc , chitin có cấu trúc tƣơng tự nhƣ cellulose, điểm khác biệt duy nhất là nhóm acetamido ở vị trí số 2 trên khung carbon của chitin đƣợc thay bằng nhóm hdroxyl (-OH) ở cellulose [71]. Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của chitinase Chitin có hoạt tính hóa học thấp, màu trắng, cứng và có chứa nitrogen. Nó không hòa tan trong nƣớc, kiềm loãng hay đặc, rƣợu và hầu hết các dung môi hữu cơ thông thƣờng. Nó tan axit vô cơ đặc (HCl, H 2 SO 4 , H 3 PO 4 …) và một số dung môi khác (hexafluro isopropanol, hexafluro acetone…) [69], [94]. Một số động vật không xƣơng sống nhƣ côn trùng, huyễn thể, giáp xác và giun tròn, chitin là một thành phần cấu trúc quan trọng của lớp vỏ. Ở động vật thủy sản, đặc biệt là trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực, hàm lƣợng chitin chiếm khá cao từ 14 – 35% so với trọng lƣợng khô [10]. Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào của nấm và một số tảo Chlorophiceae [85]. Các dẫn xuất của chitinase Chitinase có thể thủy phân một số dẫn xuất của chitin nhƣ glycol-chitin, carboxymethylchitin, chitosan, chitinsulfat, 4-methylumbellferyl-tri N-acetyl chititrioside (MUC – phát huỳnh quang) [33], [60] và không thủy phân một số cơ chất: chitin nitrat, cellulose, hyaluronic acid, alginic acid hoặc mucin. -6- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B 1.1.2. Phân loại chitinase  Dựa vào phản ứng phân cắt Enzyme phân giải chitin bao gồm: endochitinase, chitin-1,4-β-chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase) [60]. Endochitinase (EC 3.2.1.14): là nhóm enzyme phân cắt nội mạch chitin một cách ngẫu nhiên tạo các đoạn oligosaccharide. Các enzyme này đã đƣợc nghiên cứu từ dịch chiết môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc Trichoderma harzianum (2 loại endochitinase: M 1 = 36kDa, pI 1 = 5,3 ± 0,2 và M 2 = 40kDa, pI 2 = 3,9), Gliocladium virens (M = 41kDa, pI = 78). Chitin-1,4-β-chitobiosidase: enzyme phân cắt chitin tạo thành các sản phẩm chính là các dimer chitobiose. N-acetyl-β-D-glucosaminidase (exochitinase): enzyme tiếp tục phân cắt chitin từ một đầu cho sản phẩm chính là các nhóm monomer N-acetyl-D-glucosamin. Hình 1.2: Sơ đồ phân cắt chitinase bởi các enzyme thuộc nhóm chitinase [117]  Dựa vào cấu trúc phân tử Chitinase thuộc ba họ Glycohydrolase 18, Glycohydrolase 19 và Glycohydrolase 20 [60]. -7- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Họ Glycohydrolase 18: Là họ lớn nhất với khoảng 180 chi, đƣợc tìm thấy ở hầu hết các loài thuộc Eukaryote, Prokaryote và virus. Họ này bao gồm chủ yếu là chitinase, ngoài ra còn có chitodextrinase, chitobiase và N-acetyl glucosaminidase. Các enzyme chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 có cấu trúc xác định gồm 8 xoắn α/β cuộn tròn, hoạt động thông qua một cơ chế kiểm soát mà trong đó các đoạn β-polymer bị phân cắt tạo ra sản phẩm là β-anomer [43]. Chúng thủy phân các liên kết GlcNAc – GlcNAc, GlcNAc – GlcN bằng cơ chế giữ nguyên cấu hình anomeric. Hoạt tính của các chitinase thuộc họ 18 bị ức chế bởi allosamidin [53]. Các chitinase thuộc họ Glycohydrolase 18 bao gồm những chitinase từ thực vật (Arabidosis, dƣa leo, cây họ đậu, thuốc lá…), nấm (Aphanocladium, Rhizopus, Saccharomyces…), vi khuẩn (Alteromonas, Bacillus, Serratia, Streptomyces…), virus và động vật [53]. Họ Glycohydrolase 19: Họ này gồm hơn 130 chi, thƣờng thấy chủ yếu ở thực vật nhƣ cà chua (Solanum tuberosum), cải (Arabidopsis thaliana), đậu Hà Lan (Pisum sativum)… ngoài ra còn có ở xạ khuẩn Streptomyces griceus, vi khuẩn Haemophilus influenzae… Chúng có cấu trúc hình cầu với một vòng xoắn và hoạt động thông qua cơ chế nghịch chuyển. Họ Glycohydrolase 20 Họ Glycohydrolase 20 bao gồm β-N-acetyl-D-Glucosamine acetylhexosaminidase từ vi khuẩn, Streptomyces và ngƣời. -8- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Hình 1.3: Cấu trúc không gian của họ Glycohydrolase 18 (A) và họ Glycohydrolase 19 (B) [118]  Dựa vào trình tự amino acid Ngoài ra, dựa vào trình tự đầu amin (N), sự định vị của enzyme, điểm đẳng điện, peptide nhận biết và vùng cảm ứng, ngƣời ta phân loại enzyme chitinase thành 5 nhóm [88]: Nhóm I: là những đồng phân enzyme trong phân tử có đầu N giàu cystein nối với tâm xúc tác thông qua một đoạn giàu glycin hoặc prolin ở đầu carboxyl (C) (peptide nhận biết). Vùng giàu cystein có vai trò quan trọng đối với sự gắn kết enzyme và cơ chất chitin nhƣng không cần cho hoạt động xúc tác. Nhóm II: là những đồng phân enzyme trong phân tử chỉ có tâm xúc tác, thiếu đoạn giàu cystein ở đầu N và peptid nhận biết ở đầu C, có trình tự amino acid tƣơng tự chitinase ở nhóm I. Chitinase nhóm II có ở thực vật, nấm, và vi khuẩn. Chúng đƣợc cảm ứng bởi các tác nhân bên ngoài. Nhóm III: trình tự amino acid hoàn toàn khác với chitinase nhóm I và II Nhóm IV: là những đồng phân enzyme chủ yếu có ở lá cây hai lá mầm, 41 – 47% trình tự amino acid ở tâm xúc tác của chúng tƣơng tự nhƣ chitinase nhóm I, phân tử cũng có đoạn giàu cystein nhƣng kích thƣớc phân tử nhỏ hơn đáng kể so với chitinase nhóm I. -9- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Nhóm V: dựa trên những dữ liệu về trình tự, ngƣời ta nhận thấy vùng gắn chitin (vùng giàu cystein) có thể đã giảm đi nhiều lần trong quá trình tiến hóa ở thực vật bậc cao. 1.1.3. Nguồn thu nhận chitinase Chitinase hiện diện ở hầu hết các giới sinh vật bao gồm vi sinh vật, thực vật và động vật [37], [60], [94].  Chitinase vi khuẩn Chitinase đƣợc tìm thấy ở Chromobacterium, Klebsiella, Pseudomonas, Clostridium, Vibrio, Bacillus và đặc biệt ở nhóm Streptomycetes. Vi khuẩn tổng hợp chitinase để phân giải chitin trong môi trƣờng nhằm sử dụng nguồn cacbon cho sự sinh trƣởng và phát triển. Chitinase ở vi khuẩn có thể là enzyme cấu trúc hoặc enzyme cảm ứng. Tuy nhiên trong các môi trƣờng nuôi cấy vi sinh vật. ngƣời ta đều cho thêm chitin nhƣ nguồn cơ chất kích thích làm tăng khả năng tổng hợp chitinase, đồng thời ổn định hoạt tính chitinase sau quá trình tách chiết.  Chitinase nấm Các loài nấm sợi cũng có khả năng tạo ra chitinase. Các chủng nấm mốc cho chitinase cao nhƣ Trichoderma, Aspergillus, Gliocladium, Calvatia và đặc biệt ở các nấm lớn nhƣ Lycoperdon, Coprinus Tƣơng tự nhƣ ở vi khuẩn, chitinase của nấm cũng đóng vai trò quan trọng về mặt dinh dƣỡng, nhƣng khác là hoạt động của chúng rất linh hoạt trong quá trình phát triển và trong sự phát sinh hình thái của nấm bởi vì chitin là thành phần chính của vách tế bào nấm. Chitinase còn giữ vai trò trong hoạt động kí sinh nấm nhằm đối kháng lại các loài nấm gây bệnh ở thực vật -10- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B  Chitinase thực vật Những thực vật bậc cao có khả năng sinh chitinase nhƣ thuốc lá, cao su, lúa mạch, cà rốt, đậu nành (hạt), khoai lang (lá) Ngoài ra, một số loài tảo biển cũng là nguồn cung cấp chitinase [41]. Chitinase do thực vật tổng hợp nhằm mục đích chống lại các loại côn trùng và nấm kí sinh gây bệnh cho cây trồng [44]. Ngƣời ta đã quan sát thấy chitinase đƣợc tách chiết từ cây cần tây có khả năng ức chế sợi nấm phát triển. Tuy nhiên cũng có tác giả cho rằng chitinase còn có vai trò khác nhƣ tham gia vào quá trình hình thành phôi [35].  Chitinase động vật Ở một số động vật nguyên sinh, từ các mô và tuyến khác nhau trong hệ tiêu hóa của nhiều loài động vật không xƣơng nhƣ ruột khoang, giun tròn, thân mềm, chân đốt có thể thu nhận đƣợc chitinase (ví dụ trong dịch ruột của ốc sên Helix aspersa). Đối với động vật có xƣơng sống, chitinase đƣợc tiết ra từ tuyến tụy và dịch dạ dày của các loài cá, lƣỡng cƣ, bò sát ăn sâu bọ, trong dịch dạ dày của những loài chim, thú ăn sâu bọ. Ngoài ra, chitinase còn đƣợc thu nhận từ dịch biểu bì của giun tròn trong suốt quá trình phát triển và dịch tiết biểu bì của các loài chân đốt vào thời điểm thay vỏ, lột da. Chitinase giúp côn trùng tiêu hóa màng ngoài (cuticun) của chúng trong quá trình biến thái hay lột xác [33]. 1.2. NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHITINASE 1.2.1. Sơ lƣợc nghiên cứu về chitinase  Nghiên cứu trên thế giới So với các enzyme nhƣ protease, amylase… thì chitinase đƣợc nghiên cứu chậm hơn. Chitinase lần đầu đầu tiên đƣợc mô tả bởi Bernad (1911) về ảnh hƣởng [...]... flavus Laura và cs (2006) tiến hành nghiên cứu sản xuất oligosaccharides bằng enzyme thủy phân chitin là chitinase từ nấm Lecanicillium fungicola [36] Năm 2009, PENG và cs đã nghiên cứu vai trò của protease và chitinase trong quá trình lây nhiễm côn trùng của nấm Verticillium lecanii [89] Môi trƣờng thích hợp để sản xuất chitinase từ vi khuẩn hay nấm cũng đƣợc nghiên cứu rất nhiều trên các loại môi trƣờng... hoạt tính chitinase cao trong môi trƣờng xốp Ta sẽ sử dụng dòng đột biến này để nuôi và tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase thích hợp cho dòng đột biến này - Các yếu tố tối ưu bao gồm: Cơ chất: gạo, cám gạo, lõi ngô, bột ngô, gạo và cám gạo (1:1, w/w), gạo và lõi ngô (1:1, w/w), gạo và bột ngô (1:1, w/w), cám gạo và lõi ngô (1:1, w/w), cám gạo và bột ngô (1:1, w/w), lõi ngô và bột... đó chitinase đƣợc chia thành hai họ 18 và 19 [52] Năm 1993, Henrissat và Bairoch phân loại thêm những enzyme từ các loài Flavobacterium, endo-Nacetylglucosaminidase Hai họ này chứa cả endochitinase và exochitinase [53] Những năm gần đây, một số nghiên cứu trên chitinase từ nấm ký sinh côn trùng Năm 1998, Kang và cộng sự (cs) đã tinh sạch và xác định các đặc tính của chitinase trên nấm ký sinh côn trùng. .. Tikhonov và cs tiến hành tinh sạch và xác định đặc tính chitinase từ 2 chủng nấm Verticillium chlamydosporium và V Suchlasporium [100] Năm 2003, LI và cs nghiên cứu việc tăng hoạt tính của β-1,3-glucanse và chitinase trong mô sẹo trên cây bông bằng salicylic acid và sự tác động của độc tính nấm Verticillium dahliae [74] Năm 2005, Duo-Chuan và cs đã tinh sạch và xác định tính chất của chitinase từ Talaromyces... nội sinh của chitinase Chitinase có thể phát huy hiệu quả của các tác nhân kháng nấm ở liều lƣợng không gây tác dụng phụ cho bệnh nhân Ngoài ra, việc kết hợp giữa chitinase và laminarinase đƣợc ghi nhân là hữu hiệu hơn trong việc tấn công vào vách tế bào nấm so với chỉ dùng chitinase [3], [41] 1.3 NẤM KÍ SINH CÔN TRÙNG LECANICILLIUM LECANII Lecanicillium lecanii thuộc chủng nấm entomopathogenic Lecanicillium. .. diệt hại sinh học (bao gồm thuốc diệt côn trùng) đã đƣợc đăng kí với 780 sản phẩm khác nhau [112] Trên thế giới hiện đã có nhiều chế phẩm sinh học diệt côn trùng từ nấm kí sinh côn trùng đƣợc thƣơng mại hóa Theo thống kê của de Faria và Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -25cộng sự (2007), có ít nhất 12 loài (hoặc dƣới loài) nấm đƣợc ứng dụng để sản xuất chế phẩm diệt côn trùng [38] Beevicide và LarvoEnd... xâm nhập vào lớp biểu bì đồng thời các enzyme hủy hoại hệ thống mô, cơ quan của côn trùng Sợi nấm xâm nhập vào khoang máu, lƣu thông qua các chất lỏng của côn trùng và hình thành khối mô dạng sợi nấm trên cơ thể côn trùng Do đó, Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -1 6Lecanicillium spp đƣợc sử dụng trong việc tạo ra thuốc trừ sâu sinh học với một số loài côn trùng có hại trên cây trồng Bào tử nấm Lecanicillium. .. nghiệm và quy mô sản xuất thử nên giá thành còn cao Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -28- Chƣơng II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.1.1 Chủng vi sinh vật Chủng nấm L lecanii 85 (chủng tự nhiên – Le85) đƣợc phân lập từ đồng ruộng Chủng nấm L lecanii Ne180.7 là chủng đột biến từ Le85 bằng cách sử dụng Ethyl methanesulfonate (EMS) kết hợp với NTG cho độc lực diệt rệp cao nhất... bằng NTG và sàng lọc, hai chủng vi khuẩn đột biến có hoạt độ phân giải protein cao hơn 1,5 lần và 2 lần so với hoạt độ của chủng gốc đã thu đƣợc [18] Năm 2012, Vũ Văn Hạnh và các cs tiến hành thí nghiệm nâng cao độc lực diệt rệp đào của chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium bằng đột biến tia UV và Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B -19NTG nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Sàng lọc 42 dòng nấm đột... hợp V lecanii và một số kí sinh vật khác, tác dụng lên ve bét phá hoại mùa màng ENomita và Azaguard Tech là các chất đƣợc chiết từ thực vật ENomita chứa furoflavone đƣợc chiết từ cây Karanjin, tác dụng lên ve bét và côn trùng chích hút Azaguard Tech là chế phẩm chiết từ hạt neem (Azadirachta indica), tác dụng lên hơn 400 loài côn trùng khác nhau, trừ côn trùng có lợi Các chất này giúp kiểm soát sự sinh . đề tài: Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng Lecanicillium lecanii và đánh giá tính chất của enzyme này . Mục. Mai Cao học sinh K4B ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC KHOA HỌC Nguyễn Ngọc Mai Nghiên cứu phát triển chủng, tối ưu môi trường lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh. Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase từ chủng nấm kí sinh côn trùng đột biến sàng lọc. - Xác định tính chất chitinase. -4- Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Chƣơng I: