Các thí nghiệm đƣợc sử dụng thuộc phòng Các chất chức năng sinh học và Phòng thí nghiệm trọng điểm thuộc Viện Công nghệ Sinh học, Viện hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (Bảng 2.2).
Ngoài ra còn một số dụng cụ thí nghiệm khác nhƣ: bình nón, ống nghiệm, ống đong, cốc đong, đĩa petri, bình pyrex, đầu côn, …
Bảng 2.2: Danh sách các thiết bị thí nghiệm đƣợc sử dụng
Tên thiết bị Xuất xứ
Bể ổn nhiệt BUCHI Thụy Sỹ
Bếp từ Liên Doanh
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Buồng đếm hồng cầu Neubauer Đức
Cân OHAUS PA213 Mỹ
Cân phân tích BL 150S Đức
Kính hiển vi Nikon elipse 80i Nhật Bản
Khuấy từ gia nhiệt AHY Trung Quốc
Lò vi sóng Liên doanh
Máy chụp ảnh gel Dolphin – 1D Mỹ
Máy điện di ngang DNA – Biorad Mỹ
Máy đo pH HANA HI 2211 PH/ORP Meter Ý
Máy đo UV – VIS 725N Trung Quốc
Máy lắc ổn nhiệt Provocell Mỹ
Máy li tâm bàn KUBOTA’2010 Nhật Bản
Máy Vortex Trung Quốc
Micropipet Gilson Pháp
Nồi khử trùng HVE – 50 Nhật Bản
Tủ lạnh 40C và -200C Liên doanh
Tủ lắc ổn nhiệt Wis – 10R Hàn Quốc
Tủ tạo đá Camlab Đức
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật
Định lượng vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer
- Nguyên tắc:
Buồng đếm hồng cầu Neubauer là một phiến kính hình chữ nhật dày khoảng 3mm, đƣợc chia làm ba phần. Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh đọc. Phần giữa đƣợc chia đôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0,1mm tạo ra hai ngăn đếm giống nhau. Mỗi ngăn đếm hình vuông đƣợc chia thành 16 ô lớn. Mỗi ô lớn lại đƣợc chia làm 16 ô nhỏ. Mỗi một ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao 1/10 mm.
- Phương pháp tiến hành:
Buồng đếm và lamen đƣợc lau sạch bằng cồn, thấm khô trƣớc khi cho dịch tế bào vào. Lamen đƣợc đặt trên buồng đếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy có sự giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng đếm và lamen. Sau đó dùng pipet hút một ít dịch tế bào đã đƣợc lắc đều trƣớc và chấm vào cạnh của lamen. Làm nghiêng buồng đếm để dịch tràn láng vào buồng đếm. Để từ 3 đến 5 phút, buồng đếm có chứa dịch đƣợc đƣa lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính 40, thị kính 10. Đối với mẫu đếm quá đặc không thể đếm đƣợc chính xác thì phải pha loãng trƣớc khi đếm, đảm bảo mật độ tế bào không quá lớn (lớn hơn 200 tế bào trong một ô lớn) và nhân hệ số pha loãng khi tính kết quả. Đếm ít nhất 5 ô lớn số lƣợng tế bào nấm, lấy trị số trung bình.
- Phương pháp tính kết quả:
Số tế bào trên một ml mẫu phân tích (N) đƣợc tính nhƣ sau: N (tế bào/ml) = (a x K) / V
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Trong đó: a: Số tế bào trung bình trong một ô lớn V: Thể tích một ô lớn 4 x 10-6ml
K: Hệ số pha loãng
Vậy N (tế bào/ml) = (a x K) / (4 x 10-6) = 0,25 x a x K x 106
Hình 2.1: Cách đếm tế bào trong buồng đếm [115] Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp cấy chan
Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật bằng cấy chan trên bề mặt đĩa giúp ta xác định đƣợc số tế bào sống.
- Phương pháp tiến hành:
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Môi trƣờng PDA đƣợc đem đi hấp khử trùng làm tan thạch, sau đó đỏ vào đĩa petri đã khử trùng khoảng 10 – 15ml môi trƣờng và để nguội. Pha loãng mẫu theo dãy số thập phân 10-1, 10-2…với tỷ lệ 100µl mẫu : 900µl Tween 80 0,05%. Từ nồng độ pha loãng mình cần, hút 100µl dịch pha loãng vào bề mặt thạch, bổ sung thêm 10µl kháng sinh ampicillin 1‰. Dùng que chan, chan đều hỗn hợp trên bề mặt thạch đến khô. Sau 3 ~ 5 ngày, đem ra đếm số lƣợng bào tử mọc trên đĩa thạch.
2.2.2. Quy trình tạo chitin từ vỏ tôm, vỏ cua
Phƣơng pháp tách chitin từ vỏ tôm, vỏ cua đƣợc làm theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Thiết và Đỗ Ngọc Tú (2007) [12].
- Chuẩn bị:
Phụ phẩm vỏ tôm, vỏ cua sau khi thu mua sẽ đƣợc rửa sạch và loại bỏ thịt. Sau đó đem đi sấy khô ở 400
C và nghiền nhỏ.
Vỏ dứa đƣợc nghiền nhỏ trong máy xay sinh tố, sau đó chiết lấy dịch proteinase bromelain bằng nƣớc máy từ 2 đến 3 lần theo tỷ lệ khoảng 1,5 ~ 2 lít nƣớc trên 1kg vỏ dứa.
- Phương pháp tiến hành:
Trong dứa có rất nhiều bromelain – enzyme thủy phân protein, đồng thời còn có nhiều axit hữu cơ. Do vậy, dịch ép bã dứa rất thích hợp để loại bỏ cả protein và các chất khoáng trong quá trình thu nhận chitin từ vỏ tôm, vỏ cua.
Quy trình tách chiết chitin đƣợc tiến hành nhƣ sau: 100g vỏ tôm, vỏ cua sẽ đƣợc hòa vào 300ml dịch chiết enzyme (nƣớc ép bã dứa). Thay dịch enzyme 2 lần vào sáng và chiều trong một ngày. Xử lý liên tục bằng dịch chiết enzyme trong khoảng 1 tuần. Rửa sạch và thu cặn. Quá trình này sẽ loại bỏ hết lƣợng khoáng trong vỏ tôm, vỏ cua. Thử lại với dung dịch HCl 1,2N nếu không thấy sủi bọt là đƣợc. Sau đó, lƣợng protein trong vỏ tôm, vỏ cua sẽ đƣợc xử lý 2 lần với dung dịch
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
NaOH 2% (hoặc 1%) ở 900C trong 45 phút, sau đó rửa sạch bằng nƣớc máy đến pH trung tính. Sản phẩm thu đƣợc là chế phẩm chitin thô còn chứa các chất màu. Các chất màu trong chế phẩm đƣợc tẩy đầu tiên bằng xử lý với dung dịch thuốc tím (KmnO4) 0,1% trong 15 phút, rửa sạch với nƣớc máy. Tiếp đó, xử lý với dung dịch oxalic acid (C2H2O4) 1% ngâm trong 1 đến 2 giờ cho đến khi sản phẩm có màu trắng thì lấy ra, rửa sạch với nƣớc máy. Sau đó đem chế phẩm đi phơi khô tự nhiên hoặc sấy ở 500C, sẽ thu đƣợc chế phẩm chitin sạch.
2.2.3. Phƣơng pháp đột biến bằng NTG
- Cơ chế:
NTG là chất hóa học đƣợc sử dụng trong thực nghiệm nhƣ là một chất gây ung thƣ và gây đột biến. Trong các thí nghiệm sinh học, NTG là tác nhân đột biến hiệu quả cao nhất đối với vi sinh vật. Do vậy, nó thƣờng đƣợc sử dụng làm chất gây đột biến phổ biến hiện nay. NTG có công thức hóa học là C2H5N5O3. Đột biến do NTG gây ra là đột biến điểm. Nó hoạt động bằng cách gây ra sự alkyl hóa, thêm nhóm methyl hoặc ethyl trên các base tạo ra sự thay đổi khi kết cặp của các base gây ra sự kết cặp sai. Khoảng 90% các đột biến hầu nhƣ chỉ xảy ra khi nhóm alkyl đƣợc thêm vào ở O6
của guanine tạo thành O-6-alkylguanine. Sự alkyl hóa này dẫn đến sự kết cặp nhầm với thymine. Kết quả sinh ra đột biến đồng hoán GC thành AT trong lần sao chép tiếp theo. Trong một số rất ít các trƣờng hợp dẫn đến dịch chuyển khung đọc hoặc mất đoạn.
- Phương pháp tiến hành:
Chủng nấm Ne180.7 là chủng nấm đột biến từ chủng gốc ban đầu Le85 sẽ đƣợc nuôi nhân giống trong môi trƣờng PDB. Sau khoảng thời gian từ 3 – 5 ngày, khi dịch bào tử đạt khoảng 108 CFU/ml, hút 2ml dịch bào tử đem đi ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu bào tử và loại dịch. Bổ sung 0,5ml dung dịch NTG và vontex đều. Ủ bào tử trong dịch NTG ở các khoảng thời gian khác nhau 30
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút. Sau mỗi khoảng thời gian, hút lần lƣợt 100µl dung dịch bào tử , ngay lập tức đem đi ly tâm 10000 vòng/phút để thu lại bào tử và loại hóa chất. Sau đó rửa bào tử bằng nƣớc cất 2 lần, rồi bổ sung thêm 100µl nƣớc muối sinh lý.
Dịch bào tử đƣợc pha loãng với Tween 80 0,05% ở các nồng độ 10-1, 10-2,… , 10-9 rồi cấy chan trên đĩa petri có chứa môi trƣờng PDA có bổ sung ampicillin với nồng độ 1‰. Các đĩa nấm đƣợc nuôi ở 260C trong khoảng thời gian 3 – 5 ngày thì đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch. Nhặt ngẫu nhiên khuẩn lạc trên đĩa thạch.
Bảng 2.3: Số lƣợng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau khi xử lý NTG
Thời gian Kí hiệu của các thể đột biến
30 phút N30.1, N30.2, N30.3, N30.4, N30.5, N30.6, N30.7, N30.8 60 phút N60.1, N60.2, N60.3, N60.4, N60.5
90 phút N90.1, N90.2, N90.3, N90.4, N90.5, N90.6, N90.7
120 phút N120.1, N120.2, N120.3, N120.4, N120.5, N120.6, N120.7, N120.8 150 phút N150.1, N150.2, N150.3, N150.4, N150.5
2.2.4. Phƣơng pháp gây đột biến bằng NTG kết hợp với tia UV
- Cơ chế:
Tia UV có thể tạo ra đột bến giữa 2 vòng pyrimidine (cytosine hoặc thymine) để tạo nên 2 liên kết dimer giữa chúng. Thông thƣờng, tia UV hay tạo ra cầu nối dimer giữa các nhóm cytosine ở gần nhau. Việc dimer cytosine có thể tạo ra adenine thay vì guanine đƣợc bổ sung vào sợi mới. Qua quá trình sao chép DNA, thể dại (CC) chuyển thành thể đột biến (TT). Mặc dù, các đột biến điểm dimer cytosine trên DNA có thể đƣợc sửa bởi hệ thống của tế bào nhƣng không thể hết. Kết quả là cặp GC (tự nhiên) chuyển thành AT (đột biến) sau khi chiếu tia UV.
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Chủng Ne180.7 đƣợc đem nuôi lắc ở 280C trong bình nón chứa môi trƣờng PDB. Sau khoảng 3 – 5 ngày, dịch bào tử sẽ đƣợc hút ra và đem đi đếm, bào tử đạt khoảng 108 CFU/ml. Hút ra 2ml dịch bào tử, đem đi ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu bào tử và loại dịch nổi. Bào tử sau khi ly tâm, đƣợc bổ sung thêm 0,5ml dung dịch NTG, đổ ra bề mặt đĩa petri. Bật tia UV (50W), khoảng cách từ nguồn UV đến đĩa khoàng từ 25 – 30 cm. Sau các khoảng thời gian khác nhau gồm 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút, ta lần lƣợt hút ra 100µl. Sau đó, xử lý tƣơng tự nhƣ đối với tạo đột biến bằng NTG.
Bảng 2.4: Số lƣợng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau khi xử lý NTG + UV
Thời gian Kí hiệu của các thể đột biến
30 phút NV30.1, NV30.2, NV30.3, NV30.4, NV30.5, NV30.6, NV30.7 60 phút NV60.1, NV60.2, NV60.3, NV60.4, NV60.5, NV60.6, NV60.7 90 phút NV90.1, NV90.2, NV90.3, NV90.4, NV90.5
120 phút NV120.1, NV120.2, NV120.3, NV120.4, NV120.5 150 phút NV150.1, NV150.2, NV150.3, NV150.4
2.2.5. Tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase
Từ các dòng đột biến, chọn ra một dòng đột biến có hoạt tính chitinase cao trong môi trƣờng xốp. Ta sẽ sử dụng dòng đột biến này để nuôi và tối ƣu môi trƣờng lên men xốp sản xuất cao sản chitinase thích hợp cho dòng đột biến này.
- Các yếu tố tối ưu bao gồm:
Cơ chất: gạo, cám gạo, lõi ngô, bột ngô, gạo và cám gạo (1:1, w/w), gạo và lõi ngô (1:1, w/w), gạo và bột ngô (1:1, w/w), cám gạo và lõi ngô (1:1, w/w), cám gạo và bột ngô (1:1, w/w), lõi ngô và bột ngô (1:1, w/w).
Tỷ lệ cơ chất (trong trƣờng hợp cơ chất tối ƣu là hỗn hợp 2 chất): 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2.
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Độ ẩm đƣợc xét trong khoảng từ 20% đến 70% v/w (với khoảng cách 10%). Độ ẩm đƣợc tính bằng lƣợng nƣớc cho vào trên tổng thể tích chung của cơ chất và nƣớc.
Nhiệt độ cho lên men xốp: 260C, 280C, 300C và 370C.
Xét pH tối ƣu cho môi trƣờng lên men xốp từ pH 3 – 10 bằng cách sử dụng dải pH của các đệm citrat (pH 3 – 6), đệm phosphate (pH 7 – 8) và đệm Glycine – NaOH (pH 9 – 10).
Nồng độ chitin (%) bổ sung vào môi trƣờng lên men xốp là 0,01%; 0,05%; 0,1%; 0,5%; 1%; 5% so với khối lƣợng cơ chất.
Nguồn Nito bổ sung vào với nồng độ 0,1%/g cơ chất, bao gồm nguồn nito hữu cơ (cao nấm men, cao thịt, bột đậu tƣơng, pepton) và nguồn nito vô cơ (NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2SO4, KNO3, ure).
Nguồn muối kim loại đƣợc bổ sung vào ở nồng độ 0,1%/g cơ chất, bao gồm các muối MgSO4, MnCl2, FeSO4, CaCl2.
Độ dày cơ chất đƣợc thay đổi từ 5g – 30g cơ chất (với khoảng cách là 5g) trong bình tam giác 250ml.
Thời gian nuôi cấy kéo dài từ 2 ngày – 10 ngày.
2.2.6. Xác định hoạt tính chitinase
Hoạt tính chitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Miller (1959) [77]. Nguyên tắc:
Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử N-acetyl- β-D-glucosamine với thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bƣớc sóng 540nm
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Hình 2.3: Cơ sở hóa học của phản ứng định lƣợng đƣờng khử
Đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc tính theo đơn vị quốc tế do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB). Một đơn vị chuẩn của enzyme (1UI) là lƣợng enzyme xúc tác chuyển hóa đƣợc 1µmol chitin sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1UI = 1µmol sản phẩm = 1µmol cơ chất (10-6mol)/phút Chuẩn bị
- Dung dịch đường chuẩn: Pha dung dịch glucosamine chuẩn có nồng độ
10µmol/ml. Từ dung dịch glucosamine 10µmol/ml, pha loãng thành các dung dịch glucosamine khác có nồng độ từ 1, 2, …, 10µmol/ml. Bảng 2.5: Pha các nồng độ glucosamine Nồng độ glucosamine (µmol/ml) ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dung dịch glucosamine 10µmol/ml (µl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nƣớc cất (µl) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
- Thuốc thử DNS: Cân 5g DNS và 300ml nƣớc cất vào cốc đong, khuấy đều từ
từ cho tan hết ở 500C. Bổ sung thêm 8g NaOH. Cuối cùng cho thêm 150g potassium sodium tartrate (C4H4KNaO6), khuấy đều cho tan hết. Bổ sung thêm nƣớc định mức đủ 500ml. Sau đó để nguội, đổ sang chai tối, tránh ánh sáng.
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
- Thu dịch enzyme thô: Đối với môi trƣờng lỏng, hút 2 ml dịch đem đi ly tâm
12000 vòng/phút, thu dịch nổi. Đối với môi trƣờng xốp, bổ sung thêm nƣớc cất sau đó đem đi lắc trong 2 – 3 giờ. Hỗn hợp sau khi lắc sẽ đƣợc lọc qua giấy lọc để thu dịch thô, đem tiếp đi ly tâm 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút để thu dịch enzyme thô.
Lập đường chuẩn glucosamine
Từ dãy nồng độ glucosamine đã pha sẵn, bổ sung thêm 100µl DNS vào mỗi ống. Đun sôi 5 phút (có đậy nắp), sau đó làm lạnh dần đến nhiệt độ phòng. Thêm vào 1,8ml nƣớc cất, độ pha loãng là 20 lần, đo mật độ quang ở bƣớc sóng 540nm.
Xây dựng đƣờng chuẩn glucosamine với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hoành là nồng độ glucosamine. Phƣơng trình biểu diễn đƣờng chuẩn dạng y = ax + b với y = OD540nm; x = [glucosamine] (µmol/ml) và hệ số tƣơng quan R2 nhờ phần mềm Excel.
Dựa vào kết quả ở bảng phụ lục 1, ta dựng đƣờng chuẩn glucosamine bằng phần mềm Microsoft Excel. Hình 2.4: Đồ thị đƣờng chuẩn Glucosamine y = 0.064x - 0.012 R² = 0.992 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gi á tr ị OD ở λ = 540nm Nồng độ glucosamine (µmol/ml) ∆OD đƣờng chuẩn glucosamine
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Ta có: Đƣờng chuẩn có phƣơng trình y = 0,064x – 0,012 Hệ số tƣơng quan R2 = 0,992
Xác định hoạt tính chitinase
Chuẩn bị 2 ống eppendorf theo bảng dƣới đây:
Ống Blank (µl) Ống Test (µl)
Dịch enzyme 50 50
Cơ chất (chitin keo 1%) 0 50
DNS 100 0
Ủ hỗn hợp ở 400
C trong 2 giờ
Cơ chất (chitin keo 1%) 50 0
DNS 0 100
Đun sôi cách thủy ở 100oC trong 5 phút. Để nguội, pha loãng đến 2ml. Đem đo OD540nm
Hoạt tính của chitinase đƣợc đo bằng cách sử dụng chitin keo là chất nền. Dịch enzyme (50µl) đƣợc thêm vào 50µl dung dịch chitin keo. Hỗn hợp này đƣợc ủ ở 400
C trong 2 giờ. Sau đó, ta bổ sung thêm 100µl DNS. Đun sôi hỗn hợp trong 5 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng và bổ sung thêm 800µl H2O. Sự thay đổi màu cho thấy lƣợng N-acetylglucosamine (Naga) đƣợc tạo ra, hỗn hợp đƣợc đo ở bƣớc sóng 540nm. Hoạt tính của chitinase đƣợc xác định bằng lƣợng enzyme tạo ra 1µmol Naga trong 1 phút.
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Trong đó: A: lƣợng đƣờng khử sinh ra (µmol/ml) K: hệ số pha loãng
t: thời gian phản ứng
2.2.7. Xác định một số tính chất lý hóa của chitinase