- Cơ chế:
NTG là chất hóa học đƣợc sử dụng trong thực nghiệm nhƣ là một chất gây ung thƣ và gây đột biến. Trong các thí nghiệm sinh học, NTG là tác nhân đột biến hiệu quả cao nhất đối với vi sinh vật. Do vậy, nó thƣờng đƣợc sử dụng làm chất gây đột biến phổ biến hiện nay. NTG có công thức hóa học là C2H5N5O3. Đột biến do NTG gây ra là đột biến điểm. Nó hoạt động bằng cách gây ra sự alkyl hóa, thêm nhóm methyl hoặc ethyl trên các base tạo ra sự thay đổi khi kết cặp của các base gây ra sự kết cặp sai. Khoảng 90% các đột biến hầu nhƣ chỉ xảy ra khi nhóm alkyl đƣợc thêm vào ở O6
của guanine tạo thành O-6-alkylguanine. Sự alkyl hóa này dẫn đến sự kết cặp nhầm với thymine. Kết quả sinh ra đột biến đồng hoán GC thành AT trong lần sao chép tiếp theo. Trong một số rất ít các trƣờng hợp dẫn đến dịch chuyển khung đọc hoặc mất đoạn.
- Phương pháp tiến hành:
Chủng nấm Ne180.7 là chủng nấm đột biến từ chủng gốc ban đầu Le85 sẽ đƣợc nuôi nhân giống trong môi trƣờng PDB. Sau khoảng thời gian từ 3 – 5 ngày, khi dịch bào tử đạt khoảng 108 CFU/ml, hút 2ml dịch bào tử đem đi ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 40C, thu bào tử và loại dịch. Bổ sung 0,5ml dung dịch NTG và vontex đều. Ủ bào tử trong dịch NTG ở các khoảng thời gian khác nhau 30
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
phút, 60 phút, 90 phút, 120 phút và 150 phút. Sau mỗi khoảng thời gian, hút lần lƣợt 100µl dung dịch bào tử , ngay lập tức đem đi ly tâm 10000 vòng/phút để thu lại bào tử và loại hóa chất. Sau đó rửa bào tử bằng nƣớc cất 2 lần, rồi bổ sung thêm 100µl nƣớc muối sinh lý.
Dịch bào tử đƣợc pha loãng với Tween 80 0,05% ở các nồng độ 10-1, 10-2,… , 10-9 rồi cấy chan trên đĩa petri có chứa môi trƣờng PDA có bổ sung ampicillin với nồng độ 1‰. Các đĩa nấm đƣợc nuôi ở 260C trong khoảng thời gian 3 – 5 ngày thì đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch. Nhặt ngẫu nhiên khuẩn lạc trên đĩa thạch.
Bảng 2.3: Số lƣợng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau khi xử lý NTG
Thời gian Kí hiệu của các thể đột biến
30 phút N30.1, N30.2, N30.3, N30.4, N30.5, N30.6, N30.7, N30.8 60 phút N60.1, N60.2, N60.3, N60.4, N60.5
90 phút N90.1, N90.2, N90.3, N90.4, N90.5, N90.6, N90.7
120 phút N120.1, N120.2, N120.3, N120.4, N120.5, N120.6, N120.7, N120.8 150 phút N150.1, N150.2, N150.3, N150.4, N150.5