Hoạt tính chitinase đƣợc xác định theo phƣơng pháp của Miller (1959) [77]. Nguyên tắc:
Phƣơng pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đƣờng khử N-acetyl- β-D-glucosamine với thuốc thử dinitrosalicylic acid (DNS). Cƣờng độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đƣờng khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bƣớc sóng 540nm
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B Hình 2.3: Cơ sở hóa học của phản ứng định lƣợng đƣờng khử
Đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc tính theo đơn vị quốc tế do Hiệp hội Hóa sinh Quốc tế (International Union of Biochemistry – IUB). Một đơn vị chuẩn của enzyme (1UI) là lƣợng enzyme xúc tác chuyển hóa đƣợc 1µmol chitin sau 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn.
1UI = 1µmol sản phẩm = 1µmol cơ chất (10-6mol)/phút Chuẩn bị
- Dung dịch đường chuẩn: Pha dung dịch glucosamine chuẩn có nồng độ
10µmol/ml. Từ dung dịch glucosamine 10µmol/ml, pha loãng thành các dung dịch glucosamine khác có nồng độ từ 1, 2, …, 10µmol/ml. Bảng 2.5: Pha các nồng độ glucosamine Nồng độ glucosamine (µmol/ml) ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Dung dịch glucosamine 10µmol/ml (µl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Nƣớc cất (µl) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
- Thuốc thử DNS: Cân 5g DNS và 300ml nƣớc cất vào cốc đong, khuấy đều từ
từ cho tan hết ở 500C. Bổ sung thêm 8g NaOH. Cuối cùng cho thêm 150g potassium sodium tartrate (C4H4KNaO6), khuấy đều cho tan hết. Bổ sung thêm nƣớc định mức đủ 500ml. Sau đó để nguội, đổ sang chai tối, tránh ánh sáng.
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
- Thu dịch enzyme thô: Đối với môi trƣờng lỏng, hút 2 ml dịch đem đi ly tâm
12000 vòng/phút, thu dịch nổi. Đối với môi trƣờng xốp, bổ sung thêm nƣớc cất sau đó đem đi lắc trong 2 – 3 giờ. Hỗn hợp sau khi lắc sẽ đƣợc lọc qua giấy lọc để thu dịch thô, đem tiếp đi ly tâm 12000 vòng/phút trong khoảng 3 phút để thu dịch enzyme thô.
Lập đường chuẩn glucosamine
Từ dãy nồng độ glucosamine đã pha sẵn, bổ sung thêm 100µl DNS vào mỗi ống. Đun sôi 5 phút (có đậy nắp), sau đó làm lạnh dần đến nhiệt độ phòng. Thêm vào 1,8ml nƣớc cất, độ pha loãng là 20 lần, đo mật độ quang ở bƣớc sóng 540nm.
Xây dựng đƣờng chuẩn glucosamine với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hoành là nồng độ glucosamine. Phƣơng trình biểu diễn đƣờng chuẩn dạng y = ax + b với y = OD540nm; x = [glucosamine] (µmol/ml) và hệ số tƣơng quan R2 nhờ phần mềm Excel.
Dựa vào kết quả ở bảng phụ lục 1, ta dựng đƣờng chuẩn glucosamine bằng phần mềm Microsoft Excel. Hình 2.4: Đồ thị đƣờng chuẩn Glucosamine y = 0.064x - 0.012 R² = 0.992 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Gi á tr ị OD ở λ = 540nm Nồng độ glucosamine (µmol/ml) ∆OD đƣờng chuẩn glucosamine
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Ta có: Đƣờng chuẩn có phƣơng trình y = 0,064x – 0,012 Hệ số tƣơng quan R2 = 0,992
Xác định hoạt tính chitinase
Chuẩn bị 2 ống eppendorf theo bảng dƣới đây:
Ống Blank (µl) Ống Test (µl)
Dịch enzyme 50 50
Cơ chất (chitin keo 1%) 0 50
DNS 100 0
Ủ hỗn hợp ở 400
C trong 2 giờ
Cơ chất (chitin keo 1%) 50 0
DNS 0 100
Đun sôi cách thủy ở 100oC trong 5 phút. Để nguội, pha loãng đến 2ml. Đem đo OD540nm
Hoạt tính của chitinase đƣợc đo bằng cách sử dụng chitin keo là chất nền. Dịch enzyme (50µl) đƣợc thêm vào 50µl dung dịch chitin keo. Hỗn hợp này đƣợc ủ ở 400
C trong 2 giờ. Sau đó, ta bổ sung thêm 100µl DNS. Đun sôi hỗn hợp trong 5 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng và bổ sung thêm 800µl H2O. Sự thay đổi màu cho thấy lƣợng N-acetylglucosamine (Naga) đƣợc tạo ra, hỗn hợp đƣợc đo ở bƣớc sóng 540nm. Hoạt tính của chitinase đƣợc xác định bằng lƣợng enzyme tạo ra 1µmol Naga trong 1 phút.
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Trong đó: A: lƣợng đƣờng khử sinh ra (µmol/ml) K: hệ số pha loãng
t: thời gian phản ứng