Định lượng vi sinh vật bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer
- Nguyên tắc:
Buồng đếm hồng cầu Neubauer là một phiến kính hình chữ nhật dày khoảng 3mm, đƣợc chia làm ba phần. Các phần bên ngăn cách với phần giữa bởi hai rãnh đọc. Phần giữa đƣợc chia đôi do một rãnh ngang và thấp hơn hai phần bên 0,1mm tạo ra hai ngăn đếm giống nhau. Mỗi ngăn đếm hình vuông đƣợc chia thành 16 ô lớn. Mỗi ô lớn lại đƣợc chia làm 16 ô nhỏ. Mỗi một ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2 và chiều cao 1/10 mm.
- Phương pháp tiến hành:
Buồng đếm và lamen đƣợc lau sạch bằng cồn, thấm khô trƣớc khi cho dịch tế bào vào. Lamen đƣợc đặt trên buồng đếm sao cho khi nhìn nghiêng thấy có sự giao thoa ánh sáng ở vị trí tiếp xúc giữa buồng đếm và lamen. Sau đó dùng pipet hút một ít dịch tế bào đã đƣợc lắc đều trƣớc và chấm vào cạnh của lamen. Làm nghiêng buồng đếm để dịch tràn láng vào buồng đếm. Để từ 3 đến 5 phút, buồng đếm có chứa dịch đƣợc đƣa lên kính hiển vi và quan sát ở vật kính 40, thị kính 10. Đối với mẫu đếm quá đặc không thể đếm đƣợc chính xác thì phải pha loãng trƣớc khi đếm, đảm bảo mật độ tế bào không quá lớn (lớn hơn 200 tế bào trong một ô lớn) và nhân hệ số pha loãng khi tính kết quả. Đếm ít nhất 5 ô lớn số lƣợng tế bào nấm, lấy trị số trung bình.
- Phương pháp tính kết quả:
Số tế bào trên một ml mẫu phân tích (N) đƣợc tính nhƣ sau: N (tế bào/ml) = (a x K) / V
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Trong đó: a: Số tế bào trung bình trong một ô lớn V: Thể tích một ô lớn 4 x 10-6ml
K: Hệ số pha loãng
Vậy N (tế bào/ml) = (a x K) / (4 x 10-6) = 0,25 x a x K x 106
Hình 2.1: Cách đếm tế bào trong buồng đếm [115] Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp cấy chan
Phƣơng pháp định lƣợng vi sinh vật bằng cấy chan trên bề mặt đĩa giúp ta xác định đƣợc số tế bào sống.
- Phương pháp tiến hành:
Nguyễn Ngọc Mai Cao học sinh K4B
Môi trƣờng PDA đƣợc đem đi hấp khử trùng làm tan thạch, sau đó đỏ vào đĩa petri đã khử trùng khoảng 10 – 15ml môi trƣờng và để nguội. Pha loãng mẫu theo dãy số thập phân 10-1, 10-2…với tỷ lệ 100µl mẫu : 900µl Tween 80 0,05%. Từ nồng độ pha loãng mình cần, hút 100µl dịch pha loãng vào bề mặt thạch, bổ sung thêm 10µl kháng sinh ampicillin 1‰. Dùng que chan, chan đều hỗn hợp trên bề mặt thạch đến khô. Sau 3 ~ 5 ngày, đem ra đếm số lƣợng bào tử mọc trên đĩa thạch.