Tách chiết, tinh sạch và cố định enzyme bromelin từ dứa

Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme.. Ngày nay, enzyme đã được sản xuất và sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ th

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ T I 2

1.2.1 M t u t n qu t 2

1.2.1 M t u t 2

1.3 MỤC Đ C N IÊN C U 2

1.4 P ƯƠN P ÁP N IÊN C U 3

1.4.1 N n ứu lý t uyết 3

1.4.2 N n ứu t ự n ệm 3

1.5 I I N CỦA ĐỀ T I 3

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

2.1 SƠ Ư C VỀ C A 4

2.1.1 s v sự p t tr n y ứ 4

2.1.2 T n p n n n tron ứ 5

2.1.3 C p n tr n y ứ t o nzyme bromelain 6

2.1.3.1 Qu 6

2.1.3.2 Thân 6

2.1.3.3 6

2.1.3.4 R 6

2.2 I I T I U SƠ Ư C VỀ N M 7

2.3 ENZYME PROTEASE 8

2.3.1 t ệu s l enzyme protease 8

Prot s t ự v t 10

2.3.2 n n n ym prot s 10

2.4 N M ROM AIN T U N N T A 11

2.4.1 t ệu n ym rom lain 11

2.4.2 T n t v t lý n ym rom l n 11

2.4.3 T n t o n ym rom l n 12

C u t o o 12

C u tr n n rom l n 13

2.4.4 o t t n n ym rom l n 13

C ế t n 14

C yếu t n n ến o t t n n ym rom l n 14

2.4.5 n n n ym rom l n 16

Tron n n ệp t ự p m 16

Tron y 17

M t s n ym rom l n t n m 17

2.4.6 T n n n n ứu tron v n o n về n ym rom l n 18

N n ứu tron n 18

N n ứu n o n 18

2.5 T U T CƠ N C U N C PROT IN T 19

2.6 CÁC P ƯƠN P ÁP TỦA PROT IN 19

2.6.1 T n mu sul t n n n u 19

2.6.2 T n un m u 20

2.6.5 T n t ện phân 21

2.7 S C Đ N N M 21

2.7.1 Đ n n n ym n 21

2.7.2 T n t u v n n ym n 21

Ưu m 21

N m 22

2.7.3 C yếu t n n ến o t t n n ym n 22

2.7.4 C p n p p n n ym 23

2.7.4.1 P n p p l n ết n ym v v t l ệu n 23

2.7.4.2 P n p p p t v t l 24

2.7.4.3 P n p p n t 24

2.7.4.4 P n p p u m 25

2.7.5 Đ m t n t N tr l n t 25

2.7.6 n n n ym n 26

2.7.6.1 Tron n n ệp 26

2.7.6.2 Tron y 26

2.7.6.3 Tron n n ứu o 27

2.7.6.4 Tron o vệ m tr ờn 27

2.7.7 T n n n n ứu tron n v n o n 27

2.7.7.1 T n n n n ứu tron n 27

2.7.7.2 T n n n n ứu n n o 28

CHƯƠNG 3: V T LI U V PHƯƠNG PH P 29

3.1.2 t 30

3.1.3 T ết 30

3.2 P ƯƠN P ÁP T N I M 31

3.2.1 C ết t n ym từ ế p m ứ 31

3.2.2 P n p p n m l n prot n v o t t n rom l n từ ết n ym t 32

3.2.2.1 X n m l n prot n n p n p p r or 33

3.2.2.2 X n o t t n n ym t o p n p p Am no 35

3.2.3 T n ym n p n p p t n n 9 0, mu Ammonium sulfate (NH4)2SO4 v aceton(CH3COCH3) 39

3.2.3.1 N uy n tắ 39

3.2.3.2 P n p p t n ệm t n ym n n 9 0 39

P n p p t n ệm t n mu Ammonium sulfate 40

3.2.3.4 Ph n p p t n ệm t n ton 41

3.2.4 P n p p n t lệ n 9 0 n n mu (N 4)2SO4 v t lệ ton t u t n ym rom l n 42

3.2.5 P n p p n p n ệt t u v ền n ệt o o t n n ym rom l n 42

3.2.5.1 X n p t u o o t n rom l n 42

3.2.5.2 X n n ệt t u o o t n rom l n 42

3.2.5.3 o s t ền n ệt 43

C n n ym rom l n tr n t N tr l n t n p n p p n t 43

P n p p n ệu su t n prot n v ệu su t

n o t t n n ym n 43

3.2.7 P n p p o s t n n yếu t lý o ến o t t n n ym rom l n n tr n N tr l n t 44

3.2.7.1 o s t n n p 44

3.2.7.2 o s t n n n ệt 45

3.2.7.3 o s t ền n ệt 45

3.2.8 o s t s l n t s n rom l n n tr n N tr l n t 45

3.2.9 u t n s n ym rom l n ứ n sắ ý l l 46 3.2.9.1 N uy n tắ 46

3.2.9.2 T ết v t 46

3.2.9.3 C t ến n 47

3.2.9.4 T n ệu su t về o t t n n ym prot s v t n s

n ym s u t n s n sắ ý l l 49

3.2.10 X n tr n l n p n t n ym rom l n n p n p p ện S S - PAGE 49

3.2.10.1 N uy n tắ 50

3.2.10.2 T ết v t 50

3.2.10.3 P n p p 52

3.2.10.4 X n tr n l n p n t prot n 54

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ V I N LU N 55

4.1 M Ư N PROT IN V O T T N N M ROM AIN C C I T T CÁC P N TRÊN QU A 55

l n 9 0 56

4.2.2 X n p n ệt t u v ền n ệt o o t t n rom l n p n tron t n v t lệ ứ n 58

4.2.2.1 p t u 58

4.2.2.2 N ệt t u 59

4.2.2.3 o s t ền n ệt 60

O SÁT TÁC N N TỦA N M ROM AIN MU I AMMONIUM SULFATE 61

4.3.1 H m l n prot n v o t t n rom l n p n tron t là mu Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) 61

4.3.2 X n p n ệt t u v ền n ệt o o t t n rom l n p n tron t mu v n n 62

4.3.2.1 p t u 62

4.3.2.2 N ệt t u 63

4.3.2.3 o s t ền n ệt 64

O SÁT TÁC N N TỦA N M ROM AIN AC TON (CH3COCH3) 66

4.4.1 H m l n prot n v o t t n rom l n p n tron t là aceton (CH3COCH3) 66

4.4.2 X n p n ệt t u v ền n ệt o o t t n rom l n p n tron t aceton v t lệ ứ 5 aceton 67

4.4.2.1 p t u 67

4.4.2.2 N ệt t u 68

4.6 C Đ N N M ROM AIN TRÊN NATRIA INAT 71

4.6.1 ết qu qu tr n n n ym rom l n tr n t m n Natrialginate 71

4.6.2 ệu su t n prot n v ệu su t n o t t n n ym bromelain trên gel Natrialginate 71

4.6.3 So s n m l n v o t t n n ym rom l n n v m l n v o t t n n ym tr n 72

4.6.4 o s t o t t n n ym n tr n N tr l n t t o p n ệt v ền n ệt 72

4.6.4.1 o s t o t t n n ym n t o p 72

4.6.4.2 o s t o t t n n ym n theo n ệt 74

4.6.4.3 o s t o t t n n ym n theo ền n ệt 75

4.6.5 o s t s l n t s n rom l n n tr n N tr l n t 76

4.6.6 So s n ền n ệt ế p m n ym n u tr n v n ym n tr n N tr l n t 78

4.7 TIN S C N M ROM AIN TRÊN IO P-100 79

4.7.1 m l n prot n v o t t n rom l n tr t n s 79

4.7.2 T n s n ym n sắ ý l l v t n s 79

4.7.3 T n s n ym t v n 9 0 79

4.7.4 T n s n ym t v mu Ammon um sul ate 80

4.7.5 T n s n ym t v ton 82

4.7.6 So s n ết qu ế p m n ym t v n ym s u

qu qu tr n sắ ý l l 83

4.8.1 T n p n m u ện 84

4.8.2 ết qu ện 84

CHƯƠNG 5: KẾT LU N V KIẾN NGHỊ 87

5.1 T U N 87

5.2 KI N N 89

T I LI U THAM KHẢO I PHỤ LỤC III

Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme bromelain cũng đang được nghiên cứu Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme Bằng cách cố định enzyme trong chất mang không tan trong nước enzyme có thể tách ra khỏi cơ chất dễ dàng sau phản ứng Thêm vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan hiếm enzyme như hiện nay

Ngày nay, enzyme đã được sản xuất và sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nguyên liệu rất phong phú (dứa,

đu đủ, ) Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ khoảng 30% quả dứa được sử dụng, còn lại 70% phụ phẩm mà chủ yếu là chồi trên quả dứa, thân dứa (Hội thảo quốc gia năm 2005) Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất thải hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm bromelain bởi vì hầu như trên tất cả các bộ phận của cây dứa đều có enzyme Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase Bromelain thân, chồi có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết sản phẩm bromelain thương mại được ly trích từ thân dứa

Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành tách chiết, tinh sạch enzyme bromelain ở quy mô nhỏ Khảo sát các tác nhân tủa, xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme trên chồi dứa Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate bằng phương pháp tủa muối Ammonium sulfate

1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Tách chiết và tinh sạch enzyme bromelain từ chồi dứa

Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate

So sánh các tác nhân tủa của bộ phần chồi dứa sau khi tủa

Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate

o sánh hàm lượng và hoạt t nh enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt t nh enzyme trước khi cố định

Tinh sạch enzyme bromelain

Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di

1.3 MỤC ĐÍCH NGHIÊN C U

Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme bromelain từ lượng phế phẩm lớn là chồi dứa Đồng thời cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate để mang lại hiệu quả kinh tế trong công nghiệp

1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U

1.4.1 Nghiên cứu lý thuyết

Thu thập tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu Tổng hợp phân t ch, so sánh và đánh giá lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp Phân t ch đánh giá điều kiện thực tế về kỹ thuật, kinh tế, xã hội để xác định giới hạn nghiên cứu và phương án thực nghiệm

1.4.2 Nghiên cứu thực nghiệm

Lập kế hoạch thực hiện th nghiệm

Xử lý kết quả bằng Excel và phần mềm Statgraphics

1.5 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI

Vì lý do giới hạn về thời gian và kinh tế, đề tài chỉ thực hiện tủa enzyme với ba tác nhân tủa (muối, cồn và aceton), tinh sạch enzyme bromelain trên Biogel P-100, điện di bằng phương pháp -PAGE và chỉ thực hiện cố định enzyme trên cơ chất Natrialginate ở quy mô phòng thí nghiệm

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 2.1 SƠ Ư C VỀ C ỨA

2.1.1

N M K - M

G N I

N N

L

N

N

K

2.1: 2.2:

0

F (-20 N

H

L

N

H

N N L L

K G L N M

2.1.2 T ƣ

D a có nhi u sinh t C, ch t gum Thành ph n trong 100g d a:

E 0.03-0.29 g

Riboflavin 0.011-0.04 mg

Ascorbic Acid 27.0-165.2 mg

ng 2 : Th nh h n dinh ư ng g ứ

2.1.3 C

2.1.3.1 Q

-

N http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34/3422.ht ml) 2.1.3.2 Thân

K

N

H

N http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34/3422.ht ml) 2.1.3.3

L L

- N K

enzyme bromelain 2.1.3.4 R

- N

K

2.2 GI I THI U SƠ Ƣ C VỀ N

Enzyme hay còn g i là ch t xúc tác sinh h c có b n ch t là protein Enzyme có trong m sinh v t, nó không nh ng làm nhi m v xúc tác cho các ph n ng hóa

h c nh sinh v t (invivo) mà còn xúc tác cho các ph n ng ngoài t bào (invitro) Vì có ngu n g c t sinh v c g i là ch t xúc tác sinh h c (biocatalisateur) nh m phân bi t v i các ch t xúc tác hóa h c khác

Chính nh s có m t c a enzyme mà nhi u ph n ng hóa h c r t khó x y ra

u ki ng (do c n nhi , áp su t cao, acid m nh hay

ki m m … nó x y ra h t s c nhanh chóng, liên t c và nh p nhàng v i nhi u ph n ng liên h u ki n h t s c êm d u, nh nhàng (370C, áp su ng, không ki m m nh hay acid m …

c tính quan tr ng nh t c c hi c hi u là kh xúc tác ch n l c, xúc tác s chuy n hóa m t hay m t s ch t nh nh theo m t ki u

Vi c khai thác enzyme t ng v t và th c v t r t ph c t p vì ngu n nguyên li u thu nh u su t th p d n giá thành cao nên h n ch

Vi c s n xu t enzyme t vi sinh v t có nh

 Vi sinh v t có chu k ng và phát tri n r t ng n

 H enzyme c a vi sinh v t vô cùng phong phú

 Vi c c i t o gi ng vi sinh v t o ra nh ng ch ng vi sinh v t có kh

t ng h p ra các lo i enzyme theo ý mu c th c hi n m t cách d dàng trong m t th i gian ng n vì kh ng c a vi sinh v t là

r t cao

 Vi sinh v t có t sinh s n c c nhanh

 Vi sinh v i nghiêm ng t v ng nên có th t n

d ng nh ng ph ph li u công nông nghi s n xu t enzyme và có th d

u khi n các y u t n quá trình nuôi c có th thu

do, m t peptide ng n,pepton

2.3.1 Giới thiệ ơ ƣợc các Enzyme protease

2.3.1.1 Protease vi sinh v t

 Protease từ vi khuẩn

L ng protease s n xu t t vi khu c tính vào kho ng 500 t n, chi m

k ử

Trong các ch ng vi khu n có kh ng h p m nh protease là Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và m t s gi ng thu c chi Clostridium ng h p protease m nh nh t (Nguy n

2.3.1.3 Protease th c v t

Protease th c v t t p trung ch y u m t s cây vùng nhi , d a,

t c protease th c v u cùng thu c m t nhóm enzyme ch a g c – SH trong tâm ho ng

Thí d : papain t m , bromelain t d a, ficin t qu sung

2.3.2 Ứng dụng c a enzyme protease

Trong các lo i enzyme thì enzyme protease có vai trò quan tr vì nó

th y phân protein t y i v i s i,

nó là thành ph n c i và v t nuôi, là ngu n cung câp v t li

lô c v cho s n xu t nh m nâng cao ch i gian

Hi n nay ch ph i m t ph n có ngu n g ng v

c v y u là t vi sinh v t ( Nguy n Ti n Th ng, 2004)

2.4 N R AIN THU NH N T ỨA

2.4.1 G ớ ệ

Bromelain là enzyme có nhi u trong qu d c phát hi n t gi a th kỉ 19

c nghiên c u t gi a th kỉ 20 c ta nghiên c u v Bromelain

c b u t nh -1970

Bromelain là nhóm protease th c v c thu nh n t h c bi t

là t thân (EC-3.4.22.32) và trái d a (EC-3.4.22.33) m i b ph n khác nhau thì Bromelain có pH t c u t khác nhau

Bromelain có trong toàn b cây d u nh t là trong qu Bromelain là nhóm endoprotease có kh t các liên k t peptid n i phân tử chuy n phân tử n nh g i là các peptide (D H Giang, 2005)

Thành ph n ch y u c a Bromelain có ch a nhóm sulfurhydryl th y gi i protein Khi chi t tách và tinh s n có ch a nhóm sulfhydryl c a Bromelain thì thu

c m t enzyme th y phân protein hi u qu in vitro (Nguy c L ng, 2004)

Murachi và c ng s u v tính ch t v t lý c a enzyme Bromelain trích t thân cây d a và th au:

* : –

** :

***

2.4.3 T ấ

2.4.3.1 Cấ ạ

Bromelain thân là m i các protease th c v t khác f ch nó là m t glycoprotein, m i phân tử có glycan g m 3 manose, 2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose (Nguy L ng, 2004) Tùy t n acid amin bromelain thân và qu i khác nhau Bromelain thân có thành ph n acid amin T ấ ệ G

ử

Da

33 200*

32 100**

35 500***

ng 2 : T nh hấ ậ in h n

(Nguy L ng, 2004)

Các nghiên c u ghi nh n, polypeptide c u –

NH2 i v i Bromelin qu u –

NH2 là alanine (Nguy L ng, 2004)

2.4.3.2 Cấ

M

ử

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –

- Gly – Cys – Lys -

i –S-S- (disulfur) –

ử

ử f

ử f N

ử 2+

2.4.4 Hoạt tính c a enzyme bromelain Th t qu d a chỉ có ho t tính Bromelain k t

ho t tính cao nh t là kho c khi chín Khi trái chín, ho t tính bromelain gi m xu t h n M t s nghiên c u cho th y Bromelain có ho t tính khác nhau trên nh t khác nhau N t là hemoglobin thì kh i c a Bromelain m papain g p 4 l t là casein thì kh i c a hai enzyme này

 Ảnh hưởng c a nhiệ độ

Nhi c a ph n ng xúc tác ch u ng b i nhi u y u t : th i gian tác

ng càng dài thì nhi s có nh i làm n ho t tính c a enzyme, n n enzyme, n t, d ng t n t i c a enzyme

Bromelain d ng tinh khi t thì nh y v i nhi t: 5o C, pH = 4-10, Bromelain có

ho t tính t 55oC, pH=6 trong 20 phút, ho t tính gi m 50%

Quá trình s ) m t ho t tính 27% (Nguy L ng,

2004)

pH là y u t quan tr ng nh t n ho t tính xúc tác c a enzyme pH thích h p nh i v i bromelain không nh mà ph thu c vào nhi , th i gian

ph n ng, b n ch t và n ng tinh s ch c a enzyme, b n ch t c a dung

d m, s có m t c a ch t

pH khá r ng t 3- H ng n m trong kho ng 5-8 tùy t: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguy L ng, 2004)

 Ảnh hưởng bởi các ion kim lo i

Các ion kim lo ng g n v i phân tử protein t i các trung tâm ho ng, do

n ho t tính xúc tác c a enzyme Vì bromelain thu c nhóm protease cystein, trung tâm ho ng có nhóm – H u là ho t ch t ho t hóa cho bromelain Ví

d K N f f …

Bromelain b c ch b i nh ng ion ho c h p ch t có ái l c m –SH,

I acetophenol, H2O2, methyl bromur

Các ion kim lo F nh c u trúc phân tử

Trong ch bi n thuỷ s n: Khi s n xu c m m (và m t s loài m ng

th i gian ch bi ng là dài nh t, hi u su t thuỷ m) l i ph thu c r t

nhi u cá Nên hi n nay quy trình s n

xu c m m ng c hoàn thi ử d ng ch ph m enzyme

rút ng n th i gian làm và c i thi c c m m

ctv,1995)

ỉ ỷ

E

ử

ử

G ử

2.4.6 T ƣớ bromelain

2.4.6.1 N ƣớ

ử

M

L M

G N

ử

H G L H

-

H G

- L

2.4.6.2 N ƣớ

ử d ng tỉ l là 0,3% enzyme so v i cá g m papain, tripsin ,ficin và bromelain thêm vào cùng v i 25% mu i ngay t u c a quá trình

s n xu c m i cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark) K t

qu cho th y v i 0,3% bromelain m t ng s cao nh t so v i các enzyme còn l i trên m u cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men v i m u

i ch ng lên men c truy n là 30%

Liang và ctv (1999) nghiên c u ho t tính c a bromelain sau khi b sung polyphenol trích ly t trà xanh c a Trung Qu c cho th y tính b n nhi t c a bromelain

2.5 THU T CƠ N CHU N CH PR T IN TH

Sau khi l a ch c ngu n cung c p protein vi c ti p theo là ph

v d ng d ch Có nhi bào b ng áp su t th m th u, nghi n b ng thi t b trung tính, nghi n tay, phá t bào b á

k trên thích h xử lí các mô m m, ng v t, th c v i v i vi khu n có v

b o v ch c ch n thì t t nh t nghi n b ng c i th y tinh có thêm v t li hay b t nhôm, ho c xử lí v i lysozine (enzyme phá vách t i v i nh ng t bào

có vách b o v r t ch m men trong m t s ng h p ph i sử d ng máy ép

t o áp su phá v t bào M t s ng h p có th sử d ng máy nghi phá

m u

2.6.1 T a bằng muối sulfate ở các nồ đ khác nhau

tinh s ch protein m phòng thí nghi m, t a b ng ammonium sulfate

c sử d u trong quy trình tách chi t và tinh s

n mu a kh i dung d ch mà không b bi n tính

Khi cho thêm mu i vào protein, các phân tử các ion này b t l y các phân tử c kh i protein, do v y các phân tử protein có

ng liên k t v i nhau và b u t p h p l K m ng mu i vào

u t a N c th c hi u ki n nhi l

bi a protein b ng cách ly tâm và hòa tan tr l i trong dung d m Dung d ch lúc này v n ch a nhi u mu i còn l i trong t a Có nhi ử i kh ng lo i

mu i b c gel Dung d ch sau khi rửa

s ch mu c gi sử d ng cho các quá trình tinh s ch và phân tích ti p theo (D H G

2.7 S C Đ NH N

2.7.1 Đ ố đ

E

ử

ử

M

ử

c qu



ử

 ỉ

 K

 H

H …

2.7.2.2 N ƣợ đ

 H

 M

2.7.3 C ố ƣở đ ạ ố đ

K

ử

M

 B

 …



 ử



2.7.4 C ƣơ ố đ

ử ử

N

ử

ử ỉ

2.7.4.2 P ƣơ ấ ụ

ử

ử E …

–

H

2.7.4.3 P ƣơ ố

 h ng ấ ng gel (entrapment in gel)

G

f N

H CaCl2

 ạ ợ ổ ợ

N

 ạ

E

2.7.6 Ứng dụng c ố đ

2.7.6.1 Trong công nghiệp

Ngày nay, nhi u quy trình ng d ng enzyme c nh trong công nghi công nghi p s n xu c gi i khát, ch bi n s a, s n xu t da, hóa ch …

u bia: Các enzyme amylase, t bào n m men c c sử d ng quy mô l n

Ch bi n s a: Enzyme lactase c th y phân lactose trong s a

N n xu t liên t c glucose b ng glucoseamylase c nh

N Chimotrypsin liên k t c ng hóa tr v i carboximethyl

E c c c dùng trong chu nh Ngoài các ng

d n c c enzyme trong phân tích các chỉ tiêu sinh hóa c ng: glucose, urea, …Enzyme Horseradish peroxidase c nh trên polystyren cùng v i kháng th , giúp chu nhanh và chính xác ( t ELISA)

Enzyme L-asparaginase có kh c ch s phát tri n c a u ác tính, n

tr c ti s b ng

d u c u có g n enzyme vào s có hi u qu cao

2.7.6.3 Trong nghiên c u khoa h c

N n c c ch t nh n glucose nh glucoxydase c i n c n c c oxy trên b m t gel polyacryamide

N n c c vào dung d ch gl t và oxy s khu ch tán vào gel ch a

N y s bi n trong h th n c c ph thu c vào t

ph n ng và n glucose

K n c cholesterol

Cl n c nh n c n

Ngoài ra enzyme c nh còn có th c dùng vào nhi u m

t hóa enzyme zymogen, nghiên c u c u trúc phân tử protein, sử d ng trong

c kí ái l tinh ch m t s ch t có kh c bi t v i enzyme Ngày nay có nhi u quy trình sử d ng t bào c nh xử c th t

hi u qu cao

2.7.6.4 Trong b o vệ ƣờng

Trong công nghi p ch bi n th c ph u, bia, ch bi ng… t th i,

ph ph li u c a nh ng nhà máy này là ngu n ô nhi m n ng do giàu ch t h

sử d ng enzyme c xử c th i sinh h c nh m làm gi m thi u

L H p (1995), c nh vi khu n t (Vibrio cholerea) lên giá th PHEMA

b t b c x , Nguy n Qu c Hi u ch t o ch ph m hormone progesterone th i ch m b t b c x

L L nh vi khu xử lí

ch t h c

Nguy u c nh pectinase thu th p t các

ch ng n m m c, Nguy n Quy u c – amylase thu nh n t

vi khu …

2.7.7.2 Tình hình nghiên c ƣớc ngoài

Nghiên c u enzyme c nh b u t N lson và Griffin quan sát

và cho th y r ng enzyme invertase c a n m men khi h p th vào than có kh

th ng s gi i xu t hi n nhi u báo cáo v kh

c nh các enzyme b ng liên k ng hóa tr trên ch t mang

N f m thành công vi c nh amylase, tripsin, papain, ribonuclease và polyacryamide

N ng th c nghi s n xu t glucose b ng glucoseamylase c i

c ng tác công ty Tanabe Seiyaku - Nh u tiên th c hiên thành công

vi c áp d ng enzyme không hòa tan vào trong s n xu t công nghi p

Nh u nghiên c u vi c c nh enzyme trên ch t mang

n hình là m t s nghiên c KILN u

vi c nh Penicilin G Acylase b ng vi c c c ho t hóa b i

E u vi c c nh enzyme Horseradish Peroxidase (HPR) b t h p v i alginate Asta Zubriene và ctv u vi c c nh hidrolase lên trên các h t chitosan

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 VẬT LIỆU

3.1.1 Chế phẩm enzyme thô

Chồi trên quả dứa và quả dứa

Chồi cắt sát quả dứa, bỏ lá bên ngoài

Quả xanh cắt bỏ vỏ lấy các phần mắt dứa, thịt dứa và chồi dứa

3.1.2 Hóa chất

Hóa chất để tủa enzyme: Cồn 96o uối iu su h t v t

Dung dị h đệm phosphate : NaH2PO4.12H2O, NaH2PO4

Hóa chất xá đị h h ượng protein: thuốc thử Bradfosd

Hóa chất xá định hoạt tính enzyme

Hóa chất du g tr g hươ g há sắc ký: Bio-Gel P-100

Pipept thủy tinh: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml

Pipet man các loại

Đầu típ các loại Cốc thủy tinh 100ml, 250ml

Cân 500g bộ phận thịt dứa, xay nhuyễn, lọc hỗn hợp qua vải thô, tách bằ g ước thu được dịch gọi là enzyme thô

Cân 500g bộ phận mắt dứa, xay nhuyễn, lọc hỗn hợp qua vải thô, tách bằ g ước thu được dịch gọi là enzyme thô

Cân 500g bộ phận cùi dứa, xay nhuyễn, lọc hỗn hợp qua vải thô, tách bằ g ước thu được dịch gọi là enzyme thô

Cân 500g bộ phận chồi dứa, xay nhuyễn, lọc hỗn hợp qua vải thô, tách bằng

ướ thu được dịch gọi là enzyme thô

Dịch lọ thu đượ đ y tâ ạnh ở 150 C 5000 vòng/phút trong 10 phút

Loại bỏ cặn và thu lấy dịch

Thu được thể tí h 900 đối với thịt dứa, 900 ml với mắt dứa, 1000 ml với cùi dứa và 1200 ml với chồi dứa

Bảo quản lạnh ở 50 C

3.2.2 Ph ng ph p ịnh hàm l ợng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme thô

Dịch chiết enzyme thô ở ụ 3 2 1 : hồi dứ ắt dứ thịt dứ v ùi dứ được

xá đị h h ượ g r t i th hươ g há Br df rd v h ạt tí h th hươ g há Amano

3.11 u