TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)

Nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng enzyme đƣợc phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến nay. Công nghệ sản xuất enzyme đã đem lại lợi nhuận lớn cho nhiều nƣớc, sản lƣợng và kim ngạch mua bán các chế phẩm enzyme trên thị trƣờng thế gới tăng 20-30% mỗi năm. Việt Nam là nƣớc có nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzyme. Trong đó protease là enzyme thủy phân có giá trị thƣơng mại rất lớn. Nó đƣợc ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, mỹ phẩm đặc biệt trong y học hiện đại. Chính vì thế đã có nhiều nghiên cứu tách chiết thu nhận protease từ nhiều nguồn gốc khác nhau: động vật, thực vật, vi sinh vât. Gần đây, do những nhu cầu về vệ sinh, an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lƣợng và do đó, chế phẩm protease từ vi sinh vật ngày càng cao. Trong khi đó, chế phẩm protease thu nhận từ thực vật và mô động vật luôn đƣợc coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút đƣợc sự quan tâm của các phòng thí nghiệm cũng nhƣ các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thƣơng mại. Tôm là loại động vật thuỷ sinh đang đứng đầu trong ngành nuôi trồng thuỷ sản. Với mức đóng góp 70 - 80% giá trị tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản nên hiện nay tôm là mặt hàng chế biến xuất khẩu chủ lực của ngành, chủ yếu là tôm đông lạnh. Tôm là thực phẩm có giá trị dinh dƣỡng cao (chứa 21,04% protein – nghiên cứu của Nguyễn Việt Dũng về tôm sú) nên nó là mặt hàng rất đƣợc ƣa chuộng trên thị trƣờng quốc tế. Tôm dùng cho chế biến đƣợc cung cấp từ hai nguồn: đánh bắt và nuôi trồng, trong đó nguồn tôm nuôi đang chiếm ƣu thế và nuôi tôm ở Việt Nam trong những năm gần đây đã trở thành ngành kinh tế quan trọng. Các sản phẩm chế biến tôm chủ yếu là tôm bỏ vỏ, bỏ đầu, tôm bỏ đầu bóc vỏ còn đuôi,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** 000 *** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *** 000 *** TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực hiện : PGS.TS. NGUYỄN TIẾN THẮNG NGUYỄN VĂN NAM ThS. NGUYỄN LỆ HÀ Khóa : 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ISOLATION, PURIFICATION AND CHARTERIZATION OF PROTEASE FROM THE HEPATOPANCREAS AND HEADS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) Graduation thesis Major : Biotechnology Advisor: Student: Dr. NGUYEN TIEN THANG NGUYEN VAN NAM Ms. NGUYEN LE HA Term : 2003 – 2007 HCMC, 08/2007 iv LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh. Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. Thầy Nguyễn Tiến Thắng, cô Đỗ Thị Tuyến, là cán bộ trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, cung cấp nhiều kiến thức và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình thực tập tại viện. Cô Nguyễn Lệ Hà, người đã tận tình hướng dẫn giải đáp những thắc mắc của tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Thầy Bùi Minh Trí và các anh chị cán bộ nghiên cứu của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh đã hướng dẫn và tạo điều kiện giúp đỡ cho tôi thực tập nghiên cứu đề tài tại trung tâm. Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K29 đã động viên, chia sẽ kinh nghiệm buồn vui trong suốt thời gian học tập bên nhau và cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu đề tài. Các bạn thực tập cùng phòng tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới đã giúp đỡ rất nhiều trong quá trình nghiên cứu đề tài. Con cảm ơn cha me, những người thân đã trang bị tinh thần lẫn vật chất và là hành trang cho con bước vào đời. Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Văn Nam v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nguyễn Văn Nam, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007. “TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)”. Hội đồng giáo viên hƣớng dẫn:  PGS-TS. Nguyễn Tiến Thắng.  Ths. Nguyễn Lệ Hà. Để hiểu biết về tính chất và sự biến đổi của hệ protease nhằm có những biện pháp bảo quản hữu hiệu trong chế biến nguyên liệu tôm sau khi thu hoạch và tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm của tôm để thu chế phẩm protease. Đề tài tiến hành khảo sát khả năng tách chiết protease từ mẫu đầu và nội tạng tôm của dung môi: nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý, đệm phosphate và Tris-HCl với các tỷ lệ khác nhau. Chọn ra dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả năng tủa của các tác nhân: cồn ethylic, acetone và muối sulfate amon với các nồng độ (tỷ lệ) khác nhau. Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp tủa DC thu CPT; Khảo sát các tính chất tối ƣu cho hoạt động protease CPT của mẫu nội tạng từ tác nhân tủa tốt nhất; Tinh sạch protease CPT của các tác nhân tủa với nồng độ thích hợp từ mẫu nội tạng và mẫu đầu tôm bằng sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel P 100. Xác định trọng lƣợng phân tử protease sau tinh sạch bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE. Kết quả thí nghiệm: dung môi tách chiết Tris-HCl với tỷ lệ mẫu/dd Tris- HCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa cồn của mẫu nội tạng hoạt động tối ƣu ở nhiệt độ 47 o C, pH 7,0, nồng độ muối ăn 3%. Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh sạch có trọng lƣợng phân tử nằm trong khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da. vi MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN IV TÓM TẮT KHÓA LUẬN . V DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IX DANH SÁCH CÁC BẢNG X DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ XI Chƣơng 1. MỞ ĐẦU . 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 1.2. MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI . 2 Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME . 3 2.1.1. Lược sử các công trình nghiên cứu enzyme 3 2.1.2. Định nghĩa về enzyme . 4 2.1.3. Cấu tạo phân tử . 4 2.1.4. Danh pháp quốc tế và phân loại . 6 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 6 2.2. KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM . 8 2.2.1. Giới thiệu về tôm . 8 2.2.2. Khái quát protease 10 2.2.2.1. Định nghĩa protease . 10 2.2.2.2. Protease của tôm 11 2.2.2.3. Tình hình nghiên cứu protease trong nƣớc và ngoài nƣớc 12 a). Nghiên cứu trong nƣớc 12 b). Nghiên cứu ngoài nƣớc 13 2.2.3. Ứng dụng của protease . 14 2.3. PHƢƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU 15 2.3.1. Phương pháp trích ly enzyme. . 15 2.3.2. Phương pháp làm sạch enzyme . 16 2.3.3. Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel . 18 2.3.3.1. Bản chất của phƣơng pháp . 18 2.3.3.2. Chọn lựa và chuẩn bị gel 20 a). Chọn lựa gel . 20 b). Chuẩn bị gel và bảo quản . 20 2.3.3.3. Dựng cột và chuẩn bị mẫu . 20 a). Dựng cột lọc gel . 20 b). Chuẩn bị mẫu . 21 2.3.3.4. Một số ứng dụng của phƣơng pháp lọc gel 21 vii 2.3.3.5. Ƣu và nhƣợc điểm của sắc ký lọc gel 22 a). Ƣu điểm 22 b). Nhƣợc điểm . 22 2.4. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE . 22 2.5. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME . 24 2.5.1. Phương pháp Biuret 24 2.5.2. Phương pháp Lowry 25 2.5.3. Phương pháp Bradford . 25 2.5.4. Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) 26 2.5.5. Phương pháp đo phổ . 26 Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 27 3.2. VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU . 27 3.2.1. Vật liệu 27 3.2.2. Hóa chất 28 3.2.3. Thiết bị 28 3.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG 29 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.4.1. Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng và đầu tôm sú . 29 3.4.2. Thu nhận chế phẩm protease 29 3.4.3. Bố trí thí nghiệm 30 3.4.3.1. Xác định dung môi và chế độ tách chiết protease từ nội tạng và đầu tôm sú thích hợp 31 3.4.3.2. Xác định tác nhân tủa thích hợp và nồng độ thu CPT từ DC 32 3.4.3.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease của CPT . 33 a). Nhiệt độ 33 b). pH . 33 c). Nồng độ muối ăn 34 3.4.4. Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel . 35 3.4.5. Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 35 3.4.6. Phương pháp xử lý số liệu . 35 Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN . 36 4.1. XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME . 36 4.1.1. Khả năng tách chiết protease của nước cất ở các tỷ lệ khác nhau . 36 4.1.2. Khả năng tách chiết protease của nước muối sinh lý ở các tỷ lệ khác nhau . 38 4.1.3. Khả năng tách chiết protease của đệm phosphate pH 7,0 ở các tỷ lệ khác nhau . 39 4.1.4. Khả năng tách chiết protease của đệm Tris-HCl pH 7,5 ở các tỷ lệ khác nhau . 41 4.1.5. Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp . 42 4.2. XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC . 44 viii 4.2.1. Khả năng tủa protease của cồn ở các tỷ lệ khác nhau . 44 4.2.2. Khả năng tủa protease của acetone ở các nồng độ khác nhau . 46 4.2.3. Khả năng tủa protease của (NH 4 ) 2 SO 4 ở các nồng độ muối bão hòa khác nhau . 47 4.2.4. So sánh khả năng tủa thu CPT của các tác nhân . 49 4.3. KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT . 51 4.3.1. Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 51 4.3.2. Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú . 52 4.3.3. Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease của CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 53 4.4. TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL 55 4.5. XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE 59 Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 5.1. KẾT LUẬN 64 5.2. ĐỀ NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC . 1 Phụ lục chƣơng 3 69 1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford 1 2. Xác định hoạt tính protease bằng phương pháp Amano 3 3. Phương pháp sắc ký lọc gel 7 4. Điện di SDS-PAGE . 9 a). Chuẩn bị hộp điện di 9 b). Chuẩn bị mẫu protein . 10 c). Đƣa mẫu vào các giếng 10 Phụ lục chƣơng 4 80 ix DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT NT: nội tạng. DC: dịch chiết. CPT: chế phẩm thô. TN: thí nghiệm. ĐC: đối chứng. dd: dung dịch. HT: hoạt tính. HTR: hoạt tính riêng. HL: hàm lƣợng. MW: molecular weight OD: optical density SDS: sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine UV: ultra viole x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1. Nội dung các nhóm phƣơng pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme . 24 Bảng 4.5. Hàm lƣợng protein và hoạt tính protease từ DC của các dung môi của mẫu nội tạng và đầu 42 Bảng 4.9. Ảnh hƣởng của tác nhân tủa đến hoạt tính protease và hàm lƣợng protease của CPT . 49 Bảng 4.14. Hoạt tính riênng, độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch của enyzme protease sau sắc ký lọc gel 58 Bảng 4.16. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE 62 Bảng 4.17. Trọng lƣợng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE . 62 . Graduation thesis Major : Biotechnology Advisor: Student: Dr. NGUYEN TIEN THANG NGUYEN VAN NAM Ms. NGUYEN LE HA Term : 2003 – 2007 HCMC, 08/2007 iv LỜI CẢM. trang cho con bước vào đời. Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Văn Nam v TÓM TẮT KHÓA LUẬN Nguyễn Văn Nam, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2007. “TÁCH