TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH và TÍNH CHẤT của PROTEASE từ nội TẠNG và đầu tôm sú

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khoá: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VĂN NAM Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon) Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn : Sinh viên thực : PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG NGUYỄN VĂN NAM ThS NGUYỄN LỆ HÀ Khóa : 2003 - 2007 Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ISOLATION, PURIFICATION AND CHARTERIZATION OF PROTEASE FROM THE HEPATOPANCREAS AND HEADS OF BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon) Graduation thesis Major : Biotechnology Advisor: Student: Dr NGUYEN TIEN THANG NGUYEN VAN NAM Ms NGUYEN LE HA Term : 2003 – 2007 HCMC, 08/2007 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Bộ Mơn Cơng Nghệ Sinh Học, Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Viện Sinh Học Nhiệt Đới Thành Phố Hồ Chí Minh Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nơng Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Thầy Nguyễn Tiến Thắng, Đỗ Thị Tuyến, cán trực thuộc phòng Các Chất Có Hoạt Tính Sinh Học, Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp Hồ Chí Minh tận tình hướng dẫn, cung cấp nhiều kiến thức tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực tập viện Cơ Nguyễn Lệ Hà, người tận tình hướng dẫn giải đáp thắc mắc suốt trình thực đề tài Thầy Bùi Minh Trí anh chị cán nghiên cứu Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ cho thực tập nghiên cứu đề tài trung tâm Các bạn bè thân yêu lớp CNSH K29 động viên, chia kinh nghiệm buồn vui suốt thời gian học tập bên hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tơi q trình nghiên cứu đề tài Các bạn thực tập phòng Viện Sinh Học Nhiệt Đới giúp đỡ nhiều trình nghiên cứu đề tài Con cảm ơn cha me, người thân trang bị tinh thần lẫn vật chất hành trang cho bước vào đời Tháng 08 năm 2007 Nguyễn Văn Nam iv TÓM TẮT KHĨA LUẬN Nguyễn Văn Nam, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh Tháng 08/2007 “TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TƠM SÚ (Penaeus monodon)” Hội đồng giáo viên hƣớng dẫn:  PGS-TS Nguyễn Tiến Thắng  Ths Nguyễn Lệ Hà Để hiểu biết tính chất biến đổi hệ protease nhằm có biện pháp bảo quản hữu hiệu chế biến nguyên liệu tôm sau thu hoạch tận dụng triệt để nguồn phế phụ phẩm tôm để thu chế phẩm protease Đề tài tiến hành khảo sát khả tách chiết protease từ mẫu đầu nội tạng tôm dung môi: nƣớc cất, nƣớc muối sinh lý, đệm phosphate Tris-HCl với tỷ lệ khác Chọn dung môi với tỷ lệ chiết thích hợp thu DC; Khảo sát khả tủa tác nhân: cồn ethylic, acetone muối sulfate amon với nồng độ (tỷ lệ) khác Chọn tác nhân tủa với nồng độ (tỷ lệ) thích hợp tủa DC thu CPT; Khảo sát tính chất tối ƣu cho hoạt động protease CPT mẫu nội tạng từ tác nhân tủa tốt nhất; Tinh protease CPT tác nhân tủa với nồng độ thích hợp từ mẫu nội tạng mẫu đầu tôm sắc ký lọc gel áp suất thấp, Bio-Gel P 100 Xác định trọng lƣợng phân tử protease sau tinh kỹ thuật điện di SDS-PAGE Kết thí nghiệm: dung môi tách chiết Tris-HCl với tỷ lệ mẫu/dd TrisHCl =1/7 (w/v); Tác nhân tủa cồn với tỷ lệ DC/dd cồn = 1/6 (v/v); Protease CPT tủa cồn mẫu nội tạng hoạt động tối ƣu nhiệt độ 47oC, pH 7,0, nồng độ muối ăn 3% Kết điện di SDS-PAGE cho thấy enzyme sau tinh có trọng lƣợng phân tử nằm khoảng từ 37.775 Da đến 69.257 Da v MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN IV TÓM TẮT KHÓA LUẬN V DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT IX DANH SÁCH CÁC BẢNG X DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ XI Chƣơng MỞ ĐẦU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME .3 2.1.1 Lược sử cơng trình nghiên cứu enzyme 2.1.2 Định nghĩa enzyme .4 2.1.3 Cấu tạo phân tử 2.1.4 Danh pháp quốc tế phân loại .6 2.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động enzyme 2.2 KHÁI QUÁT PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA TÔM .8 2.2.1 Giới thiệu tôm .8 2.2.2 Khái quát protease 10 2.2.2.1 Định nghĩa protease 10 2.2.2.2 Protease tôm 11 2.2.2.3 Tình hình nghiên cứu protease nƣớc nƣớc 12 a) Nghiên cứu nƣớc 12 b) Nghiên cứu nƣớc 13 2.2.3 Ứng dụng protease 14 2.3 PHƢƠNG PHÁP TÁCH VÀ LÀM SẠCH ENZYME TRONG NGHIÊN CỨU 15 2.3.1 Phương pháp trích ly enzyme .15 2.3.2 Phương pháp làm enzyme .16 2.3.3 Giới thiệu phương pháp sắc ký lọc gel 18 2.3.3.1 Bản chất phƣơng pháp .18 2.3.3.2 Chọn lựa chuẩn bị gel 20 a) Chọn lựa gel 20 b) Chuẩn bị gel bảo quản .20 2.3.3.3 Dựng cột chuẩn bị mẫu .20 a) Dựng cột lọc gel 20 b) Chuẩn bị mẫu .21 2.3.3.4 Một số ứng dụng phƣơng pháp lọc gel 21 vi 2.3.3.5 Ƣu nhƣợc điểm sắc ký lọc gel 22 a) Ƣu điểm 22 b) Nhƣợc điểm 22 2.4 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ BẰNG ĐIỆN DI SDS-PAGE .22 2.5 PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG XÚC TÁC CỦA ENZYME .24 2.5.1 Phương pháp Biuret 24 2.5.2 Phương pháp Lowry 25 2.5.3 Phương pháp Bradford 25 2.5.4 Phương pháp BCA [Bicinchoninic Acid] (1985) 26 2.5.5 Phương pháp đo phổ .26 Chƣơng VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 27 3.2 VẬT LIỆU, HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ NGHIÊN CỨU 27 3.2.1 Vật liệu 27 3.2.2 Hóa chất 28 3.2.3 Thiết bị 28 3.3 CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐÃ ÁP DỤNG 29 3.4 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 3.4.1 Chiết rút thu dịch chiết protease nội tạng đầu tôm sú .29 3.4.2 Thu nhận chế phẩm protease 29 3.4.3 Bố trí thí nghiệm 30 3.4.3.1 Xác định dung môi chế độ tách chiết protease từ nội tạng đầu tôm sú thích hợp 31 3.4.3.2 Xác định tác nhân tủa thích hợp nồng độ thu CPT từ DC 32 3.4.3.3 Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến hoạt tính protease CPT .33 a) Nhiệt độ 33 b) pH 33 c) Nồng độ muối ăn 34 3.4.4 Tinh enzyme sắc ký lọc gel 35 3.4.5 Xác định trọng lượng phân tử phương pháp điện di SDS-PAGE 35 3.4.6 Phương pháp xử lý số liệu .35 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 4.1 XÁC ĐỊNH DUNG MÔI VÀ TỶ LỆ CHIẾT TÁCH ENZYME 36 4.1.1 Khả tách chiết protease nước cất tỷ lệ khác 36 4.1.2 Khả tách chiết protease nước muối sinh lý tỷ lệ khác 38 4.1.3 Khả tách chiết protease đệm phosphate pH 7,0 tỷ lệ khác 39 4.1.4 Khả tách chiết protease đệm Tris-HCl pH 7,5 tỷ lệ khác 41 4.1.5 Lựa chọn dung môi tách chiết protein-enzyme thích hợp .42 4.2 XÁC ĐỊNH TÁC NHÂN TỦA THU HỒI CHẾ PHẨM TỪ DC 44 vii 4.2.1 Khả tủa protease cồn tỷ lệ khác 44 4.2.2 Khả tủa protease acetone nồng độ khác .46 4.2.3 Khả tủa protease (NH4)2SO4 nồng độ muối bão hòa khác 47 4.2.4 So sánh khả tủa thu CPT tác nhân 49 4.3 KHẢO SÁT MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN HOẠT TÍNH PROTEASE CỦA CPT 51 4.3.1 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính enzyme proease CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 51 4.3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính protease CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 52 4.3.3 Ảnh hưởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease CPT từ mẫu nội tạng tôm sú 53 4.4 TINH SẠCH PROTEASE CPT BẰNG SẮC KÝ LỌC GEL 55 4.5 XÁC ĐỊNH TRỌNG LƢỢNG PHÂN TỬ- ĐIỆN DI SDS – PAGE 59 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 5.1 KẾT LUẬN 64 5.2 ĐỀ NGHỊ 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 PHỤ LỤC Phụ lục chƣơng 69 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford Xác định hoạt tính protease phương pháp Amano 3 Phương pháp sắc ký lọc gel Điện di SDS-PAGE a) Chuẩn bị hộp điện di b) Chuẩn bị mẫu protein 10 c) Đƣa mẫu vào giếng 10 Phụ lục chƣơng 80 viii DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT NT: nội tạng DC: dịch chiết CPT: chế phẩm thơ TN: thí nghiệm ĐC: đối chứng dd: dung dịch HT: hoạt tính HTR: hoạt tính riêng HL: hàm lƣợng MW: molecular weight OD: optical density SDS: sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis TEMED : N, N, N’, N’-tetramethylethylenediamine UV: ultra viole ix DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 2.1 Nội dung nhóm phƣơng pháp xác định khả xúc tác enzyme 24 Bảng 4.5 Hàm lƣợng protein hoạt tính protease từ DC dung môi mẫu nội tạng đầu 42 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng tác nhân tủa đến hoạt tính protease hàm lƣợng protease CPT 49 Bảng 4.14 Hoạt tính riênng, độ tinh hiệu suất tinh enyzme protease sau sắc ký lọc gel 58 Bảng 4.16 Trọng lƣợng phân tử protein mẫu nội tạng chạy điện di SDS-PAGE 62 Bảng 4.17 Trọng lƣợng phân tử protein mẫu đầu chạy điện di SDS-PAGE 62 x Mẫu đƣợc pha loãng cho mật độ quang đo đƣợc khoảng đƣờng chuẩn Kết tính tốn: Từ phƣơng trình đƣờng chuẩn mật độ quang mẫu khoả sát ta suy hàm lƣợng protein mẫu X ( g/ml) có m (g) nguyên liệu Vậy lƣợng protein có gam nguyên liệu là: Hàm lƣợng protein (mg/g) = X 1000 m Hình 3.2 Đƣờng chuẩn albumine Xác định hoạt tính protease phƣơng pháp Amano  Nguyên tắc: Dùng protein “casein” làm chất xúc tác định hoạt tính phân giải protein protease sở định lƣợng sản phẩm tạo thành phản ứng phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lƣợng Tyrosin tƣơng ứng với lƣợng sản phẩm thuỷ phân dƣới tác dụng enzyme  Hoá chất: HCL 0.1 M Ma2CO3 0.4 M Dung dịch Trichloracetic 0.4 M Tyrosin tinh khiết NaOH 0.1 M Thuốc thử Folin H3PO4 1/30 M Đệm phosphate (pH 7) 0.1 M  Dụng cụ thiết bị Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV – Vis Máy đo pH  Xây dựng đƣờng chuẩn tyrosine Bảng 3.2 Đƣờng chuẩn tyrosine Ống số Đối 10 20 30 40 50 60 70 80 90 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch HCl ( l) 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 1 1 1 1 1 Nồng độ ( g/ml) chứng Dung dịch tyrosine chuẩn ( l) Thuốc thử Folin (ml) Pha dung dịch tyrosine nồng độ khác : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 gtyrosine / mlHCl nhƣ bảng 3.3.2 Thêm ml dung dịch Na2CO3 0,4M vào dung dịch tyrosine nồng độ khác thêm ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp Sau trộn đều, để ổn định dung dịch 37 0,50C 20 phút Đo độ hấp thụ dung dịch bƣớc sóng 660 nm Ghi nhận kết As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90 As100 Đối với ống đối chứng dùng ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine Đo độ hấp thu dung dịch bƣớc sóng 660 nm ghi nhận kết Aso Trị số mật độ quang ống từ đến sau trừ trị số ống đối chứng đƣợc giá trị OD1 đến OD9 Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên OD theo nồng độ protein Đồ thị gọi đƣờng chuẩn tyrosine  Xác định hoạt tính protease Hoạt tính enzyme đƣợc khảo sát nhiệt độ 370C pH = Cho ml dung dịch chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ 37 0,50C 10 – 15 phút Sau thời gian ủ, cho ml dịch chiết enzyme thô vào lắc Đem ủ hỗn hợp 37 0,50C Cho vào ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme Để ổn định dung dịch 25 phút, sau lọc dung dịch qua giấy lọc để loại tủa Cho ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc Thêm ml thuốc thử Folin Trộn đều, để yên 37 0,50C 20 phút Khi dung dịch xuất màu xanh, đem đo độ hấp thu bƣớc sóng 660 nm (ghi nhận kết Am) Mẫu đối chứng : lấy ml nƣớc cất thay cho ml dung dịch enzyme tiến hành bƣớc tƣơng tự nhƣ mẫu thí nghiệm với điều kiện Ghi nhận kết độ hấp thụ A0 Hàm lƣợng tyrosine đƣợc giải phóng protease thủy phân đƣợc tính cách lấy Am – A0 lấy kết so với đƣờng chuẩn tyrosine để xác định hoạt tínhprotease theo tính tốn sau : Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) protease đƣợc xác định lƣợng enzyme để tạo lƣợng amino acid tƣơng đƣơng với 100 g tyrosine ml dịch lọc dƣới điều kiện thí nghiệm Ký hiệu là: U Hoạt tính protease (ĐVHT/ml) = (Am – A0).F.1/100.n Hoạt tính protease (ĐVHT/g) = F = [10/ As10 + 20/ As20 (Am – A0).F.1/100.n.V m + 30/ As30 + 40/ As40 + 50/ As50 + 60/ As60 + 70/ As70 + 80/ As80 + 90/ As90+100/ As100]/10 Am : độ hấp thu mẫu A0 : Độ hấp thu ống đối chứng F : Hệ số tƣơng quan hàm lƣợng tyrosine độ hấp thu bƣớc sóng 660 nm đƣờng chuẩn n : Hệ số pha loãng enzyme 1/100 : Hệ số chuyển đổi V : Thể tích dung dịch enzyme m : khối lƣợng chế phẩm enzyme thơ Tính tốn hoạt tính riêng (HTR) protease: từ kết hàm lƣợng protein (mg/ml) hoạt tính protease (U/ml) tính hoạt tính riêng enzyme Số đơn vị hoạt tính HTR (U/mg) = mg protein enzyme Hình 3.3 Đƣờng chuẩn tyrosine Phƣơng pháp sắc ký lọc gel Sử dụng cột sắc ký bio-rad, kích thƣớc 30 x 1,5 cm; thể tích: 53 ml (thể tích = chiều cao cột x (đƣờng kính/2)2 x 3,14 ( ) = 30 x (1,5/2)2 x 3,14) Cân 4g gel Bio-Gel P100, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1M pH 7.0 đựng cốc Sau thể huyền phù đồng hạt gel hình thành, khơng cần phải khuấy, để ổn định 12 20oc suốt q trình hydrate hóa Sau q trình hydrate xảy hồn tồn, gạn lớp bề mặt Chuyển dung dịch vào bình hút chân khơng có gắn với vòi hút chân khơng Khử khí dung dịch khoảng 10-15 phút, lắc nhẹ (xoay) bình Để gel ổn định 90-95% số hạt ổn định, gạn loại lớp bề mặt cách hút để lọai hạt mịn Lặp lại công việc lần để loại 90% hạt mịn làm cản trở trình lọc gel Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ cột cho dung dịch đệm làm đầy 20% thể tích cột Rót dung dịch gel vào cột thành dòng di chuyển nhẹ tránh làm bắn gel, đảm bảo việc nhồi cột tránh bị bọt khí Khi lớp hình thành cột từ đến cm, mở khóa đầu cột cột đƣợc nạp đầy gel (packed) Khi cột đƣợc nạp đầy gel, khóa đầu (outlet) cột gắn flow adaptor Mở khóa đầu cột cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể tích lớp (106 ml) chảy qua cột lúc điều khiển tốc độ chảy Đóng đầu cột điều chỉnh flow adaptor xuống đến lớp gel Nạp mẫu vào bề mặt lớp cách dùng xylanh bơm mẫu vào lớp gel qua flow adaptor Chuẩn bị mẫu: mẫu chạy sắc ký phải (không bị nhiễm bẩn khơng có hạt rắn); hòa tan hoàn toàn dung dịch đệm Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0,45 micrometre) làm gia tăng độ bền/thời gian sử dụng cột tính chất mẫu mà khơng thể đem lọc đƣợc nên ly tâm mẫu Dùng xylanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký, dịch khỏi cột đƣợc đo độ hấp thụ bƣớc sóng 280 nm detector hệ thống sắc ký đƣợc thể độ hấp thu dƣới dạng sắc ký đồ phần mền LP-Data View máy tính Dịch đƣợc thu tự động máy thu mẫu (collector), phân đoạn ml Thu fraction chứa dịch protease tinh qua sắc ký lọc gel, tiến hành xác định hoạt tính protease theo phƣơng pháp Amano, pH 7.0 hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp Bradford Tính hiệu suất hoạt tính protease độ tinh enzyme sau tinh sắc ký lọc gel Tính hiệu suất hoạt tính protease độ tinh enzyme sau tinh sắc ký lọc gel Hiệu suất hoạt tính enzyme  Trong đó: HTenzyme2 x100 HTenzyme1 HTenzyme1: hoạt tính protease trƣớc tinh (đvht/ml dung dịch enzyme trƣớc tinh sạch) HTtenzyme2: hoạt tính protease sau tinh (đvht/ml dung dịch enzyme sau tinh sạch) Hoạt tính riêng protease sau tinh (dvht/mg) Độ tinh protease sau sắc ký HTenzyme2 HLproteinsautinhsach Hoattinhri engenzyme2 Hoattinhri engenzyme1 Trong đó: Hlproteainsautinhsach: hàm lƣợng protein sau tinh Hoattinhriengenzyme1: hoạt tính riêng protease trƣớc tinh Hoattinhriengenzyme2: hoạt tính riêng protease sau tinh Điện di SDS-PAGE a) Chuẩn bị hộp điện di Khn kính để đổ gel, lƣợc cài hộp điện di phải đƣợc rửa lau khơ cồn Sau ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel  Đổ gel phân tích: Chuẩn bị gel phân tích polyacrylamide 10 % Nƣớc cất ml Acrylamide 30 % 3.3 ml Tris-HCl, (pH 8,8) 2.5 ml SDS 10 % 100 μl APS 10 % 100 μl Dung dịch đƣợc trộn máy khuấy từ, sau cho μl TEMED vào dung dịch, khuấy nhanh chóng dùng pipette 1000 ml cho vào khung kiếng đổ gel Gel đƣợc bơm đến vạch cách lƣợc 0,5 cm Chú ý không bơm nhanh tạo bọt gel Cẩn thận bơm tiếp lớp nƣớc cất lên bề mặt gel để tạo cho bề mặt gel phẳng Gel đông lại 20-30 phút  Đổ gel tập trung Gel tập trung thƣờng đƣợc pha nồng độ % gel có thành phần nhƣ sau Nƣớc cất 2.7 ml Acrylamide 30 % 670 μl Tris-HCl (pH 6,8; M) 2.5 ml SDS 10 % 40 μl APS 10 % μl TEMED μl Khuấy dung dịch máy khuấy từ Trƣớc đổ gel tập trung, ta phải đổ bỏ phần nƣớc phía gel phân tích cách nghiêng dùng giấy thấm Tƣơng tự gel phân tích, sau cho μl TEMED vào, dung dịch phải đƣợc đƣa nhanh vào khung đổ gel Dùng giấy thấm để loại hết nƣớc bề mặt gel phân tích Cho gel tập trung vào, đƣa lƣợc vào lớp gel Chú ý, lƣợc đƣợc đƣa vào cẩn thận để tránh tạo lớp bọt dƣới phía chân lƣợc Gel tập trung đông tụ lại khoảng sau 20 phút Đánh dấu lại vị trí lỗ giếng b) Chuẩn bị mẫu protein Pha mẫu tỷ lệ 1:1 Cho vào ống eppendorf 100 μl mẫu protein 100 μl dung dịch chuẩn bị mẫu nhƣ Trong thí nghiệm mẫu protein/enzyme lấy từ dịch protein sau tinh sắc ký lọc gel Lắc đun cách thủy 95oC, phút, để nguội c) Đưa mẫu vào giếng Sau gel tập trung đông, lắp khung đổ gel vào khung chạy điện di Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dƣới bên điện di Cẩn thận lấy lƣợc cho mẫu vào giếng Lƣợng mẫu 10 μl đƣa vào lỗ giếng Chú ý không để mẫu tràn qua giếng bên cạnh, ghi chép lại vị trí mẫu đƣa vào giếng để dễ thảo luận sau Chạy điện di: Sau hoàn tất việc đƣa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại cho dòng điện qua Dòng điện chạy điện di 25 mA / 80 V Thông thƣờng, thời gian để chạy điện di Ta quan sát q trình dịch chuyển protein nhờ vào dải băng màu xanh Bromophenol Blue R-250 Nhuộm gel: Gel đƣợc lấy khỏi hộp gel cẩn thận cho vào dung dịch nhuộm pha Để làm nhanh trình nhuộm màu, hệ thống đƣợc đặt máy lắc Thông thƣờng thời gian nhuộm khoảng Tẩy màu: Tẩy gel dung dịch tẩy, ngâm gel dung dịch tẩy đặt máy lắc Kết thúc trình tẩy gel nhận thấy gel lớp màu băng protein rõ gel  Phân tích kết quả, chụp hình gel xác định trọng lƣợng phân tử phân tích kết quả, chụp hình gel Đo khoảng cách di chuyển band protein từ gel phân tách tới band protein khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối Tính giá trị Rf : Rf = Khoảng cách di chuyển protein Khoảng cách di chuyển vạch màu bromophenol blue Vẽ biểu đồ lg giá trị trọng lƣợng phân tử protein chuẩn giá trị Rf chúng Trọng lƣợng phân tử vạch protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử xác định thơng qua giá trị Rf chúng Trọng lƣợng phân tử protein chƣa biết trọng lƣợng phân tử xác định thông qua giá trị Rf chúng qua phƣơng pháp ngoại suy từ đồ thị Phụ lục chƣơng Bảng 4.1 Ảnh hƣởng tỷ lệ (mẫu/nƣớc cất) đến hoạt tính protease hàm lƣợng protein DC nội tạng đầu Tỷ lệ mẫu/nƣớc cất (w/v) 1/1 1/2 1/3 Mẫu Nội Tạng Tôm HT HL protein protease (mg/g) (U/g) 5,92 152,34 8,02 214,84 10,32 267,45 Mẫu Đầu Tôm HT HL protein protease (mg/g) (U/g) 10,46 51,51 23,42 52,28 30,37 54,51 1/4 1/5 11,32 10,45 312,15 261,90 36,77 30,76 56,02 55,17 Bảng 4.2 Ảnh hƣởng tỷ lệ (mẫu/nƣớc muối sinh lý) đến hoạt tính protease hàm lƣợng protein DC nội tạng đầu Tỷ lệ mẫu/nƣớc muối sinh lý (w/v) 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm HL protein HT protease HL protein HT protease (mg/g) (U/g) (mg/g) (U/g) 5,16 182,98 12,76 62,96 9,24 320,02 19,13 75,85 10,62 394,32 22,25 82,57 10,32 369,20 19,61 79,10 9,65 337,70 15,54 71,88 Bảng 4.3 Ảnh hƣởng tỷ lệ (mẫu/đệm phosphate) đến hoạt tính protease hàm lƣợng protein DC nội tạng đầu Tỷ lệ mẫu/đệm phosphate (w/v) 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 Mẫu Nội Tạng Tôm HL protein HT protease (mg/g) (U/g) 8,13 213,01 11,82 300,22 15,99 362,38 17,72 405,50 22,10 439,13 25,26 484,75 27,37 511,12 26,96 482.00 26,37 464,40 26,10 453,83 Mẫu Đầu Tôm HL protein (mg/g) 6,61 11,28 15,37 20,04 19,69 21,23 20,04 18,63 15,66 13,26 HT protease (U/g) 54,70 73,79 83,21 87,84 102,59 114,76 121,53 112,76 91,72 84,47 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ (mẫu/đệm Tris-HCl) đến hoạt tính protease hàm lƣợng protein DC nội tạng đầu Tỷ lệ mẫu/đệm Mẫu Nội Tạng Tôm Mẫu Đầu Tôm Tris-HCl (w/v) 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 1/9 1/10 HL protein (mg/g) 5,42 10,37 13,83 15,69 24,02 24,64 28,75 26,32 27,09 25,90 HT protease (U/g) 83,42 208,99 265,77 344,13 460,63 505,24 543,52 509,96 523,95 501,57 HL protein (mg/g) 6,60 12,83 18,61 24,28 27,03 29,67 30,18 30,74 29,24 19,64 HT protease (U/g) 58,85 79,22 85,42 86,08 90,67 102,27 121,54 92,21 77,58 72,05 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng tỷ lệ DC/cồn đến hoạt tính protease hàm lƣợng protein CPT Tỷ lệ DC/cồn (v/v) 1/1 1/2 1/3 1/4 1/5 1/6 1/7 1/8 Mẫu Nội Tạng Tôm HL protein (mg/g) 3,44 6,88 8,24 10,84 12,40 11,83 11,71 10,8 HT protease (U/g) 114,13 186,07 329,50 390,47 465,63 490,19 458,46 406,02 Mẫu Đầu Tôm HTR (U/mg) 33,18 27,05 39,99 36,02 37,55 41,44 39,15 37,594 HL protein (mg/g) 11,60 12,30 15,49 16,70 18,17 18,40 15,20 13,91 HT HTR protease (U/mg) (U/g) 64,13 5,53 79,35 6,45 99,56 6,43 105,86 6,34 111,03 6,11 121,98 6,63 99,26 6,53 90,98 6,54 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm acetone với DC đến hoạt tính protease hàm lƣợng protein CPT Nồng độ acetone với mẫu (%) Mẫu Nội Tạng Tôm HL protein (mg/g) HT protease (U/g) HTR (U/mg) Mẫu Đầu Tôm HL protein (mg/g) HT HTR protease (U/mg) (U/g) 7,43 10,80 11,94 14,80 14,16 13,73 50% 55% 60% 65% 70% 75% 114,95 211,43 304,08 471,98 427,55 417,76 8,77 16,51 25,32 31,70 33,04 33,16 17,18 17,94 17,59 17,09 16,85 16,48 115,37 164,03 127,45 106,14 89,07 64,15 6,72 9,14 7,22 6,24 5,28 3,88 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ phần trăm muối sulfate amon bão hòa với DC đến hoạt tính protease hàm lƣợng protein CPT Mẫu Nội Tạng Tơm Nồng độ (%) sulfate amon bão hòa với DC HL protein (mg/g) 50% 55% 60% 65% 70% 75% 15,20 20,89 20,60 22,58 22,70 20,15 Mẫu Đầu Tôm HT HTR protease (U/mg) (U/g) 413,77 450,75 456,11 485,17 496,49 467,77 HL protein (mg/g) 24,30 21,45 21,12 21,36 21,74 23,08 8,49 16,35 20,10 21,30 23,12 20,70 HT protease (U/g) 43,98 79,73 97,75 109,54 122,73 107,27 HTR (U/mg) 5,18 4,88 4,86 5,14 5,34 5,18 Bảng 4.10 Ảnh hƣởng nhiệt độ hoạt động đến hoạt tính protease CPT tủa cồn từ mẫu nội tạng Nhiệt độ 30 37 47 57 67 77 Hoạt tính (U/g) 357,28 497,15 577,01 362,46 126,29 29,13 Bảng 4.11 Ảnh hƣởng pH hoạt động đến hoạt tính protease CPT tủa cồn từ mẫu nội tạng pH Hoạt tính (U/g) 378,68 430,40 552,49 414,09 349,27 Bảng 4.11 Ảnh hƣởng nồng độ muối ăn đến hoạt tính protease CPT tủa cồn từ mẫu nội tạng Nồng độ muối ăn (%) 11 13 15 17 19 21 Enzyme tinh từ CPT tủa với Cồn Acetone Peak Peak Peak Peak HT protease (U/g) 449,16 457,80 552,49 442,23 423,62 394,34 373,11 324,54 298,13 235,67 213,57 201,76 Mẫu Nội Tạng HT HL protein protease (mg/g) (U/g) 96,20 2,01 329,83 3,11 124,36 3,24 Mẫu Đầu HT HL protein protease (mg/g) (U/g) 31,24 1,89 69,01 2,14 21,05 1,23 311,59 5,46 77,12 1,98 Peak 137,03 1,76 27,85 1,43 Peak 410,86 5,25 94,04 2,03 Muối Peak Bảng 4.9 Hoạt tính protease hàm lƣợng protein enzyme sau tinh Bảng 4.14 Giá trị Rf trọng lƣợng phân tử thang chuẩn protein Rf Trọng lƣợng phân tử (Kdal) lg(trọng lƣợng phân tử) 0.140 0.244 0.372 0.523 0.756 0.907 97.4 66.2 45 31 21.5 14.4 1.989 1.821 1.653 1.491 1.332 1.158 ... tài: Tách chiết, tinh tính chất protease từ nội tạng đầu tôm sú 1.2 MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI Mục đích chung đề tài tách chiết tinh protease từ nội tạng đầu tôm sú nhƣ tính chất. ..BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ TÍNH CHẤT CỦA PROTEASE TỪ NỘI TẠNG VÀ ĐẦU TÔM SÚ (Penaeus monodon)... chiết protease nội tạng đầu tôm sú .29 3.4.2 Thu nhận chế phẩm protease 29 3.4.3 Bố trí thí nghiệm 30 3.4.3.1 Xác định dung môi chế độ tách chiết protease từ nội tạng đầu tơm sú