Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme thô .... Phương pháp xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của
Trang 1
ĐỀ TÀI:
TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ CỐ ĐỊNH
ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA
CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TP Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2010
Trang 2LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập và bồi dưỡng tại trường
Em vô cùng biết ơn sự dìu dắt và hướng dẫn nhiệt tình của toàn thể quý Thầy Cô trong Khoa Môi trường và Công nghệ sinh học cùng quý Thầy Cô trực tiếp giảng dạy em trong suốt bốn năm qua, những người đã truyền thụ kiến thức quan trọng để em có thể thực hiện tốt Đồ án tốt nghiệp này
Em xin đặc biệt chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Tiến Thắng và Cô
Đỗ Thị Tuyến đã tạo điều kiện cho em làm Đồ án tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM và đã tận tình hướng dẫn, động viên em trong suốt thời gian làm Đồ án tốt nghiệp tại đây
Em xin cảm ơn các anh chị phụ trách phòng các hoạt chất có hoạt tính sinh học thuộc Viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM đã cung cấp nhiều kiến thức bổ ích
Chân thành cảm ơn tập thể lớp 06DSH đã giúp đỡ, hỗ trợ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và thực tập tại trường
Cuối cùng con xin gởi lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Ba Mẹ và mọi người trong gia đình đã luôn ở bên con chăm sóc, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho con trong suốt quá trình học tập
TP HCM, ngày 1 tháng 7 năm 2010 SVTH: Phan Thị Huỳnh Như
Trang 3NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Điểm số bằng số: _ Điểm số bằng chữ:
TPHCM, ngày tháng năm 2010
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Trang 4TPHCM KHOA MÔI TRƯỜNG & CNSH
NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
HỌ VÀ TÊN: PHAN THỊ HUỲNH NHƯ MSSV: 106111023
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: 06DSH
1 Đầu đề đồ án: TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TỪ DỨA 2 Nhiệm vụ (yêu cầu nội dung và số liệu ban đầu)
3 Ngày giao đồ án:
4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ:
5 Họ tên người hướng dẫn: 1 PGS TS NGUYỄN TIẾN THẮNG 2 CN ĐỖ THỊ TUYẾN 6 Phần hướng dẫn: a
b
c
d
Trang 5Chủ nhiệm bộ môn Người hướng dẫn chính (ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên)
Trang 6CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2
1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2
1.2.1 Mục tiêu cụ thể 2
1.3 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 2
1.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3
1.4.1 Nghiên cứu lý thuyết 3
1.4.2 Nghiên cứu thực nghiệm 3
1.5 GIỚI HẠN CỦA ĐỀ TÀI 3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4
2.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA 4
2.1.1 Lịch sử và sự phát triển của cây dứa 4
2.1.2 Thành phần dinh dưỡng trong dứa 5
2.1.3 Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain 6
2.1.3.1 Quả 6
2.1.3.2 Thân 6
2.1.3.3 Lá 6
2.1.3.4 Rễ 6
2.2 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME 7
2.3 ENZYME PROTEASE 8
Trang 72.3.1.3 Protease thực vật 10
2.3.2 Ứng dụng của enzyme protease 10
2.4 ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA 11
2.4.1 Giới thiệu enzyme bromelain 11
2.4.2 Tính chất vật lý của enzyme bromelain 11
2.4.3 Tính chất hoá học của enzyme bromelain 12
2.4.3.1 Cấu tạo hoá học 12
2.4.3.2 Cấu trúc không gian của bromelain 13
2.4.4 Hoạt tính của enzyme bromelain 13
2.4.4.1 Cơ chế tác động 14
2.4.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme bromelain 14
2.4.5 Ứng dụng của enzyme bromelain 16
2.4.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 16
2.4.5.2 Trong y dược học 17
2.4.5.3 Một số enzyme bromelain thương mại 17
2.4.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain 18
2.4.6.1 Nghiên cứu trong nước 18
2.4.6.2 Nghiên cứu ngoài nước 18
2.5 KĨ THUẬT CƠ BẢN CHUẨN BỊ DỊCH PROTEIN THÔ 19
2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN 19
2.6.1 Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác nhau 19
2.6.2 Tủa bằng dung môi hữu cơ 20
Trang 82.6.5 Tủa bằng các chất đa điện phân 21
2.7 SỰ CỐ ĐỊNH ENZYME 21
2.7.1 Định nghĩa enzyme cố định 21
2.7.2 Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định 21
2.7.2.1 Ưu điểm 21
2.7.2.2 Nhược điểm 22
2.7.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định 22
2.7.4 Các phương pháp cố định enzyme 23
2.7.4.1 Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định 23
2.7.4.2 Phương pháp hấp thụ vật lí 24
2.7.4.3 Phương pháp nhốt 24
2.7.4.4 Phương pháp khâu mạch 25
2.7.5 Đặc điểm, tính chất của Natrialginate 25
2.7.6 Ứng dụng của enzyme cố định 26
2.7.6.1 Trong công nghiệp 26
2.7.6.2 Trong y học 26
2.7.6.3 Trong nghiên cứu khoa học 27
2.7.6.4 Trong bảo vệ môi trường 27
2.7.7 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 27
2.7.7.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 27
2.7.7.2 Tình hình nghiên cứu nước ngoài 28
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 29
Trang 93.1.2 Hóa chất 30
3.1.3 Thiết bị 30
3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 31
3.2.1 Chiết thô enzyme từ chế phẩm dứa 31
3.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng protein và hoạt tính bromelain từ dịch chiết enzyme thô 32
3.2.2.1 Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford 33
3.2.2.2 Xác định hoạt tính enzyme theo phương pháp Amano 35
3.2.3 Tách enzyme bằng các phương pháp tủa bằng cồn 960, muối Ammonium sulfate (NH4)2SO4 và aceton(CH3COCH3) 39
3.2.3.1 Nguyên tắc 39
3.2.3.2 Phương pháp thí nghiệm tủa enzyme bằng cồn 960 39
3.2.3.3 Phương pháp thí nghiệm tủa bằng muối Ammonium sulfate 40
3.2.3.4 Phương pháp thí nghiệm tủa bằng aceton 41
3.2.4 Phương pháp xác định tỉ lệ cồn 960, nồng độ muối (NH4)2SO4 và tỉ lệ aceton tối ưu để tủa enzyme bromelain 42
3.2.5 Phương pháp xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme bromelain 42
3.2.5.1 Xác định pH tối ưu cho hoạt động của bromelain 42
3.2.5.2 Xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của bromelain 42
3.2.5.3 Khảo sát độ bền nhiệt 43
3.2.6 Cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate bằng phương pháp nhốt 43
Trang 103.2.6.3 Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố
định hoạt tính của enzyme cố định 43
3.2.7 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá đến hoạt tính của enzyme bromelain được cố định trên Natrialginate 44
3.2.7.1 Khảo sát ảnh hưởng của pH 44
3.2.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 45
3.2.7.3 Khảo sát độ bền nhiệt 45
3.2.8 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate 45
3.2.9 Bước đầu tinh sạch enzyme bromelain chồi dứa bằng sắc ký lọc gel 46 3.2.9.1 Nguyên tắc 46
3.2.9.2 Thiết bị và hóa chất 46
3.2.9.3 Các bước tiến hành 47
3.2.9.4 Tính hiệu suất về hoạt tính enzyme protease và độ tinh sạch của enzyme sau tinh sạch bằng sắc ký lọc gel 49
3.2.10 Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di SDS - PAGE 49
3.2.10.1 Nguyên tắc 50
3.2.10.2 Thiết bị và hóa chất 50
3.2.10.3 Phương pháp 52
3.2.10.4 Xác định trọng lượng phân tử của protein 54
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 55
4.1 HÀM LƯỢNG PROTEIN VÀ HOẠT TÍNH ENZYME BROMELAIN DỊCH CHIẾT THÔ CÁC BỘ PHẬN TRÊN QUẢ DỨA 55
Trang 11là cồn 960 56
4.2.2 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa cồn với tỉ lệ 1 dứa : 4 cồn 58
4.2.2.1 pH tối ưu 58
4.2.2.2 Nhiệt độ tối ưu 59
4.2.2.3 Khảo sát độ bền nhiệt 60
4.3 KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ MUỐI AMMONIUM SULFATE 61
4.3.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là muối Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) 61
4.3.2 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa muối với nồng độ 60% 62
4.3.2.1 pH tối ưu 62
4.3.2.2 Nhiệt độ tối ưu 63
4.3.2.3 Khảo sát độ bền nhiệt 64
4.4 KHẢO SÁT TÁC NHÂN TỦA ENZYME BROMELAIN LÀ ACETON (CH3COCH3) 66
4.4.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là aceton (CH3COCH3) 66
4.4.2 Xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa aceton với tỉ lệ 1 dứa : 5 aceton 67
4.4.2.1 pH tối ưu 67
4.4.2.2 Nhiệt độ tối ưu 68
4.4.2.3 Khảo sát độ bền nhiệt 69
Trang 124.6 CỐ ĐỊNH ENZYME BROMELAIN TRÊN NATRIALGINATE 71
4.6.1 Kết quả quá trình cố định enzyme bromelain trên chất mang Natrialginate 71
4.6.2 Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme bromelain trên gel Natrialginate 71
4.6.3 So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định 72
4.6.4 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH, nhiệt độ và độ bền nhiệt 72
4.6.4.1 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo pH 72
4.6.4.2 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo nhiệt độ 74
4.6.4.3 Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định theo độ bền nhiệt 75
4.6.5 Khảo sát số lần tái sử dụng bromelain cố định trên Natrialginate 76
4.6.6 So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu trước khi cố định và enzyme cố định trên Natrialginate 78
4.7 TINH SẠCH ENZYME BROMELAIN TRÊN BIOGEL P-100 79
4.7.1 Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain trước khi tinh sạch 79
4.7.2 Tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel với các thông số 79
4.7.3 Tinh sạch enzyme đã tủa với cồn 960 79
4.7.4 Tinh sạch enzyme đã tủa với muối Ammonium sulfate 80
4.7.5 Tinh sạch enzyme đã tủa với aceton 82
4.7.6 So sánh kết quả giữa chế phẩm enzyme thô và dịch enzyme sau khi đã qua quá trình sắc ký lọc gel 83
Trang 134.8.1 Thành phần mẫu điện di 84
4.8.2 Kết quả điện di 84
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 87
5.1 KẾT LUẬN 87
5.2 KIẾN NGHỊ 89
TÀI LIỆU THAM KHẢO I PHỤ LỤC III
Trang 14STT VIẾT TẮT CHÚ THÍCH
tính theo đơn vị quốc tế U)
Trang 15Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100g dứa 5
Bảng 2.2: Protease động vật 10
Bảng 2.3: Ứng dụng protease trong Công nghiệp 10
Bảng 2.4: Tính chất vật lí của bromelain thân 12
Bảng 2.5: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản lên hoạt tính enzyme bromelain 16
Bảng 3.1: Bảng số liệu dựng đường chuẩn Albumin 34
Bảng 3.2: Bảng số liệu dựng đường chuẩn Tyrosin 37
Bảng 3.3: Tỉ lệ tủa bằng cồn 96 0 đối với dịch enzyme từ chồi dứa 39
Bảng 3.4: Nồng độ tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 đối với dịch enzyme từ chồi dứa 40 Bảng 3.5: Tỉ lệ tủa bằng aceton đối với dịch enzyme từ chồi dứa 41
Bảng 4.1: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain dịch chiết thô của các bộ phận trên quả dứa 55
Bảng 4.2: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ trong dịch tủa là cồn 96 0 57
Bảng 4.3: Sự biến thiên hoạt tính enzyme bromelain theo pH (tủa cồn) 58
Bảng 4.4: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo nhiệt độ (tủa cồn) 59
Bảng 4.5: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo độ bền nhiệt ở nhiệt độ 60 0 C (dịch tủa cồn tỉ lệ 1:4) 60
Bảng 4.6: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là muối Ammonium sulfate ((NH 4 ) 2 SO 4 ) 61
Bảng 4.7: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo pH (tủa muối) 62
Bảng 4.8 : Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo nhiệt độ ( tủa muối) 63
Bảng 4.9 : Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo độ bền nhiệt ở nhiệt độ 50 0 C (dịch tủa muối nồng độ 60%) 65
Bảng 4.10: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain bộ phận chồi trong dịch tủa là aceton (CH 3 COCH 3 ) 66
Bảng 4.11: Sự biến thiên hoạt tính bromelain theo pH (tủa aceton) 67
Trang 16(tủa aceton) 69
Bảng 4.14: So sánh khi tủa enzyme bromelain trong cồn, muối và aceton 70
Bảng 4.15: Hiệu suất cố định protein và hiệu suất cố định hoạt tính của bromelain 72
Bảng 4.16: Hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định 72
Bảng 4.17: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định trên Natrialginate theo pH 73 Bảng 4.18: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ 74
Bảng 4.19: Sự biến thiên hoạt tính bromelain cố định trên Natrialginate theo độ bền nhiệt 75
Bảng 4.20: Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme bromelain cố định trên Natrialginate qua các lần tái sử dụng 76
Bảng 4.21: So sánh độ bền nhiệt của chế phẩm enzyme ban đầu và enzyme cố định trên Natrialginate 78
Bảng 4.22: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của chế phẩm enzyme thô (chồi dứa) trước khi chạy sắc ký 79
Bảng 4.23: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng cồn 96 0 sau khi chạy sắc ký 80
Bảng 4.24: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4 sau khi chạy sắc ký 81
Bảng 4.25: Hàm lượng protein và hoạt tính bromelain của dịch chiết enzyme tủa bằng aceton sau khi chạy sắc ký 82
Bảng 4.26: Kết quả tinh sạch enzyme bormelain của chồi dứa 83
Bảng 4.27: Giá trị Rf và LogM của thang chuẩn 85
Bảng 4.28: Trọng lượng phân tử enzyme tủa bằng cồn 96 0 và đã qua sắc ký 86
Bảng 4.29: Trọng lượng phân tử enzyme tủa bằng muối và đã qua sắc ký 86
Bảng 4.30: Trọng lượng phân tử enzyme tủa bằng aceton và đã qua sắc ký 86
Trang 17Trang
Hình 2.1 : Dứa trước khi thu hoạch 4
Hình 2.2 : Dứa sau khi thu hoạch 4
Hình 2.3 : Bột bromelain bổ sung vào thức ăn gia súc do Thái Lan sản xuất 17
Hình 2.4 : Chất chiết từ lá và thân dứa được sản xuất dưới dạng viên nén, mỗi viên chứa 200mg bromelain 17
Hình 3.1 : Chồi dứa 29
Hình 3.2 : Mắt dứa 29
Hình 3.3 : Thịt dứa 29
Hình 3.4 : Cùi dứa 29
Hình 3.5 : Máy xay dứa 30
Hình 3.6 : Máy đo pH 30
Hình 3.7 : Cân phân tích 30
Hình 3.8 : Máy đo quang phổ UV – Vis 30
Hình 3.9 : Máy ly tâm 31
Hình 3.10: Bể ổn nhiệt 31
Hình 3.11: Dịch chiết thô sau khi ly tâm 32
Hình 3.12: Thiết bị lọc gel áp suất thấp (Bio - Rad) 46
Hình 3.13: Loại muối trước khi chạy sắc ký 48
Hình 3.14: Bộ điện di đứng một chiều của Cole – Parmer (Thuỵ Điển) 49
Hình 4.1 : Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính enzyme các bộ phận trên quả dứa 56
Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain theo tỉ lệ cồn 96 0 57
Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa cồn 58
Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa cồn 59
Trang 18Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain theo
nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 62 Hình 4.7: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain
trong dịch tủa muối (NH 4 ) 2 SO 4 63 Hình 4.8: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme bromelain
trong dịch tủa muối (NH 4 ) 2 SO 4 64 Hình 4.9: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa muối (NH 4-
) 2 SO 4 theo thời gian ủ 65 Hình 4.10: Đồ thị biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính enzyme bromelain theo
tỉ lệ aceton 66 Hình 4.11: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme bromelain
trong dịch tủa aceton 67 Hình 4.12: Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme
bromelain trong dịch tủa aceton 68 Hình 4.13: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa aceton theo
thời gian ủ 69 Hình 4.14: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain trong dịch tủa cồn 96 0 ,
muối Ammonium sulfate và Aceton 70 Hình 4.15: Enzyme bromelain được cố định trong gel Natrialginate 71 Hình 4.16: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel
Natrialginate theo pH 73 Hình 4.17: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel
Natrialginate theo nhiệt độ 74 Hình 4.18: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel
Natrialginate theo độ bền nhiệt 75 Hình 4.19: Đồ thị biểu diễn hoạt tính enzyme bromelain cố định trên gel
Natrialginate theo số lần tái sử dụng 77
Trang 19Hình 4.21: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng cồn 96 0 80 Hình 4.22: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng muối Ammonium sulphate 81 Hình 4.23: Sắc ký dịch enzyme tủa bằng Aceton 82 Hình 4.24: Đồ thị so sánh độ tinh sạch enzyme bromelain với các tác nhân tủa
khác nhau 83 Hình 4.25: Kết quả điện di của hệ enzyme bromelain từ dứa 84 Hình 4.26: Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa LogM của protein trong thang
chuẩn với Rf 85
Trang 20Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme bromelain cũng đang được nghiên cứu Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme Bằng cách cố định enzyme trong chất mang không tan trong nước enzyme có thể tách ra khỏi cơ chất dễ dàng sau phản ứng Thêm vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình trạng khan hiếm enzyme như hiện nay
Ngày nay, enzyme đã được sản xuất và sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghệ thực phẩm, y học, dược phẩm và các ngành công nghiệp khác Đối với nước ta nguồn enzyme từ thực vật có triển vọng lớn vì nguồn nguyên liệu rất phong phú (dứa,
đu đủ, ) Trong quá trình chế biến dứa đóng hộp chỉ khoảng 30% quả dứa được sử dụng, còn lại 70% phụ phẩm mà chủ yếu là chồi trên quả dứa, thân dứa (Hội thảo quốc gia năm 2005) Nếu tận dụng được nguồn phế phẩm thì vừa có thể giảm thiểu chất thải hữu cơ gây ô nhiễm môi trường vừa có thể sản xuất sản phẩm bromelain bởi vì hầu như trên tất cả các bộ phận của cây dứa đều có enzyme Bromelain có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase, esterase Bromelain thân, chồi có thể phân hủy cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp, chúng là enzyme có giá trị kinh tế và hầu hết sản phẩm bromelain thương mại được ly trích từ thân dứa
Trang 21Trong đề tài này chúng tôi đã tiến hành tách chiết, tinh sạch enzyme bromelain ở quy mô nhỏ Khảo sát các tác nhân tủa, xác định pH, nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt cho hoạt động của enzyme trên chồi dứa Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate bằng phương pháp tủa muối Ammonium sulfate
1.2 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Tách chiết và tinh sạch enzyme bromelain từ chồi dứa
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate
So sánh các tác nhân tủa của bộ phần chồi dứa sau khi tủa
Cố định enzyme bromelain trên Natrialginate
So sánh hàm lượng và hoạt tính enzyme bromelain cố định với hàm lượng và hoạt tính enzyme trước khi cố định
Tinh sạch enzyme bromelain
Xác định trọng lượng phân tử enzyme bromelain bằng phương pháp điện di
1.3 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
Làm cơ sở nghiên cứu để sản xuất enzyme bromelain từ lượng phế phẩm lớn là chồi dứa Đồng thời cố định enzyme bromelain trên cơ chất Natrialginate để mang lại hiệu quả kinh tế trong công nghiệp
Trang 221.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.4.1 Nghiên cứu lý thuyết
Thu thập tài liệu trong và ngoài nước có liên quan đến nội dung nghiên cứu Tổng hợp phân tích, so sánh và đánh giá lựa chọn hướng nghiên cứu phù hợp Phân tích đánh giá điều kiện thực tế về kỹ thuật, kinh tế, xã hội để xác định giới hạn nghiên cứu và phương án thực nghiệm
1.4.2 Nghiên cứu thực nghiệm
Lập kế hoạch thực hiện thí nghiệm
Xử lý kết quả bằng Excel và phần mềm Statgraphics
1.5 GIỚI HẠN ĐỀ TÀI
Vì lý do giới hạn về thời gian và kinh tế, đề tài chỉ thực hiện tủa enzyme với ba tác nhân tủa (muối, cồn và aceton), tinh sạch enzyme bromelain trên Biogel P-100, điện di bằng phương pháp SDS-PAGE và chỉ thực hiện cố định enzyme trên cơ chất Natrialginate ở quy mô phòng thí nghiệm
Trang 23CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY DỨA
2.1.1 Lịch sử và sự phát triển của cây dứa
Dứa là trái cây của miền nhiệt đới, có nguồn gốc từ các quốc gia Brazil, Paraguay ở Trung và Nam Mỹ
Khi Christopher Columbus (1451-1506) thám hiểm châu Mỹ, thấy dứa trồng ở quần đảo Guadeloup rất ngon, bèn mang về triều cống nữ hoàng Tây Ban Nha Isabella Đệ Nhất Từ đó, dứa được đem trồng ở các thuộc địa của Tây Ban Nha, nhất là các quốc gia thuộc khu vực Thái Bình Dương như Phi Luật Tân
Tiếng Anh của Dứa là Pinapple Các nhà thám hiểm Tây Ban Nha thấy trái dứa nom giống như chốp quả thông, bèn đặt tên là “Pina” Người Anh thêm chữ “Apple” để nói rõ hơn về tính ngọt dịu, ăn được của trái này
Tiếng Việt còn gọi Dứa là trái Thơm hay Khóm, có lẽ vì hương thơm dìu dịu thoát ra từ trái dứa vừa chín tới
Hình 2.1: Dứa trước khi thu hoạch Hình 2.2: Dứa sau khi thu hoạch
Trang 24Dứa là trái cây nhiệt đới, thích hợp với môi trường ẩm thấp, nhưng có thể chịu đựng tới nhiệt độ 280F (-20C), nhưng ở nhiệt độ lạnh, cây chậm lớn và trái chua Nông trại trồng dứa quy mô lớn đầu tiên trên thế giới được thiết lập ở Hawaii vào năm 1885 Sau đó, Phi Luật Tân là nước trồng nhiều và sản xuất cảng nhiều nhất Các quốc gia khác ở Đông Nam Á cũng sản xuất một khối lượng dứa khá lớn Dứa có quanh năm, nhưng nhiều nhất vào tháng 3 và tháng 7 Trung bình thời gian từ lúc trồng tới lúc thu hoạch là 18 tháng Dứa thường được hái khi đã chín, sẵn sàng để ăn Hái khi dứa còn xanh, dứa sẽ không chín tiếp vì không có đủ tinh bột để chuyển thành đường
Ở Việt Nam, dứa được trồng rất nhiều ở Phú Thọ, Ninh Bình, Lâm Đồng, Long
An, Kiên Giang, Cần Thơ Dứa Bến Lức vẫn nổi tiếng khắp miền Nam Mỗi trái dứa có thể nặng khoảng từ 1/2 kg đến 3 kg
2.1.2 Thành phần dinh dưỡng trong dứa
Dứa có nhiều sinh tố C, chất xơ pectin và chất gum Thành phần dinh dưỡng trong 100g dứa:
Độ ẩm 81.3-91.2 g Tinh chất Ether 0.03-0.29 g Chất xơ 0.3-0.6 g Nitrogen 0.038-0.098 g
Calcium 6.2-37.2 mg Phosphorus 6.6-11.9 mg
Carotene 0.003-0.055 mg Thiamine 0.048-0.138 mg Riboflavin 0.011-0.04 mg Niacin 0.13-0.267 mg Ascorbic Acid 27.0-165.2 mg
Bảng 2.1: Thành phần dinh dưỡng của 100g dứa
Trang 252.1.3 Các bộ phận trên cây dứa có thể cho enzyme bromelain
2.1.3.1 Quả
Quả dứa thuộc loại quả tụ, do 100-200 quả nhỏ hợp lại Các giống khác nhau thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau Bộ phận ăn được của quả dứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển nên Sau khi hòa tàn thì quả bắt đầu phát triển Đây là bộ phận cho nhiều enzyme bromelain nhất, chiếm 50% protein của quả dứa
(Nguồn:http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34/3422.ht ml)
2.1.3.2 Thân
Thân cây dứa chia làm hai phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy Khi cây đã phát triển đến mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống Năm 1957, Heinicke nhận thấy trong thân cây dứa có một lượng lớn bromelain và người ta bắt đầu tìm cách tách chiết nó và sản xuất dưới dạng thuốc để chữa bệnh
(Nguồn:http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC34/3422.ht ml)
2.1.3.3 Lá
Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc Lá thường dày, không có cuốn, hẹp ngang và dài Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm tốc độ bốc hơi nước ở lá Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai Tuỳ theo giống, một cây dứa trưởng thành có khoảng 60-70 lá (Nguyễn Văn Kế, 2001) Đây cũng là nguồn có thể thu nhận được enzyme bromelain
2.1.3.4 Rễ
Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng) Rễ dứa thuộc loại ăn nông,
Trang 26phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh Bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10-26 cm và phát triển rộng đến 1 m (Nguyễn Văn Kế, 2001) Đây cũng là nguồn có thể thu nhận được enzyme bromelain
2.2 GIỚI THIỆU SƠ LƯỢC VỀ ENZYME
Enzyme hay còn gọi là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme có trong mọi cơ thể sinh vật, nó không những làm nhiệm vụ xúc tác cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật (invivo) mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào (invitro) Vì có nguồn gốc từ sinh vật cho nên enzyme thường được gọi là chất xúc tác sinh học (biocatalisateur) nhằm phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác
Chính nhờ sự có mặt của enzyme mà nhiều phản ứng hóa học rất khó xảy ra trong điều kiện thường ở ngoài cơ thể (do cần nhiệt độ, áp suất cao, acid mạnh hay kiềm mạnh…) nhưng trong cơ thể nó xảy ra hết sức nhanh chóng, liên tục và nhịp nhàng với nhiều phản ứng liên hợp khác trong điều kiện hết sức êm dịu, nhẹ nhàng (370C, áp suất thường, không kiềm mạnh hay acid mạnh…)
Đặc tính quan trọng nhất của enzyme là tính đặc hiệu Tính đặc hiệu là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác sự chuyển hóa một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định: đặc hiệu cảm ứng và đặc hiệu cơ chất
Enzyme không thể tổng hợp bằng con đường hóa học Do đó muốn thu nhận enzyme chỉ có con đường duy nhất là thu nhận từ cơ thể sinh vật Tất cả các tế bào động vật, thực vật, vi sinh vật đều chứa enzyme nhưng mức độ enzyme thì hoàn toàn khác nhau
Hiện nay người ta khai thác enzyme từ ba nguồn cơ bản:
Động vật (hạn chế)
Thực vật (hạn chế)
Vi sinh vật (phổ biến)
Trang 27Việc khai thác enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp vì nguồn nguyên liệu thu nhận khó khăn, hiệu suất thấp dẫn đến giá thành cao nên hạn chế
Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật có những ưu điểm như sau:
Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn
Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú
Việc cải tạo giống vi sinh vật để tạo ra những chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp ra các loại enzyme theo ý muốn được thực hiện một cách dễ dàng trong một thời gian ngắn vì khả năng thích ứng môi trường của vi sinh vật là rất cao
Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cực nhanh
Vi sinh vật không đòi hỏi nghiêm ngặt về môi trường dinh dưỡng nên có thể tận dụng những phụ phế liệu công nông nghiệp để sản xuất enzyme và có thể dễ dàng điều khiển các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu suất cao trong sản xuất
Sản xuất enzyme từ vi sinh vật hoàn toàn có thể thực hiện theo quy mô công nghiệp
2.3 ENZYME PROTEASE
Enzyme protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) của phân tử protein và peptide thành các acid amin tự
do, một peptide ngắn,pepton
2.3.1 Giới thiệu sơ lược các Enzyme protease
2.3.1.1 Protease vi sinh vật
Protease từ vi khuẩn
Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn, chiếm
Trang 28khoảng 59% lượng enzyme được sử dụng
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis, B mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất (Nguyễn Trọng Cẩn và cs, 1998) Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu
Protease từ nấm
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicillium chysogenum…
Protease từ xạ khuẩn
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S fradiae, S Trerimosus
2.3.1.2 Protease động vật
- Tụy tạng: Đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất và có chứa nhiều enzymenhất
- Dạ dày bê: Trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc nhóm Protease tên là renin Enzyme này đã từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat Renin làm biến đổi casein thành paracasein có khả năng kết tủa trong môi trường sữa có đủ nồng độ Ca2+. Đây là quá trình đông tụ sữa rất điển hình, được nghiên cứu và ứng dụng đầy đủ nhất Trong thực tế nhiều chế phẩm renin bị nhiễm pepsin thì khả năng đông tụ sữa kém đi
Gần đây có nghiên cứu sản xuất protease từ vi sinh vật có đặc tính renin như ở các loài Eudothia Parasitica và Mucor Purillus
Trang 292.3.1.3 Protease thực vật
Protease thực vật tập trung chủ yếu ở một số cây vùng nhiệt đới như đu đủ, dứa,
cây sung, articho và đậu tương Tất cả protease thực vật đều cùng thuộc một nhóm enzyme chứa gốc – SH trong tâm hoạt động
Thí dụ: papain từ mủ đu đủ, bromelain từ dứa, ficin từ quả sung
2.3.2 Ứng dụng của enzyme protease
Trong các loại enzyme thì enzyme protease có vai trò quan trọng hơn cả vì nó thủy phân protein Protein đóng vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người,
nó là thành phần cơ bản của người và vật nuôi, là nguồn cung câp vật liệu như da, lông, tơ phục vụ cho sản xuất nhằm nâng cao chất lượng cũng như gia tăng thời gian bảo quản
Protease pH Chất hoạt hóa
Làm tan protein hạt, làm ổn định bia
Tủa protein sữa và làm chín phomat
Cắt một phần mô liên kết
Bảng 2.3: Ứng dụng protease trong Công nghiệp
Bảng 2.2: Protease động vật
Trang 30Hiện nay chế phẩm protease thương mại một phần có nguồn gốc động vật và thực vật, nhưng chủ yếu là từ vi sinh vật ( Nguyễn Tiến Thắng, 2004)
2.4 ENZYME BROMELAIN THU NHẬN TỪ DỨA
2.4.1 Giới thiệu enzyme bromelain
Bromelain là enzyme có nhiều trong quả dứa, được phát hiện từ giữa thế kỉ 19 nhưng mới được nghiên cứu từ giữa thế kỉ 20 Ở nước ta nghiên cứu về Bromelain được bắt đầu từ những năm 1968-1970
Bromelain là nhóm protease thực vật được thu nhận từ họ Bromeliaceae, đặc biệt
là từ thân (EC-3.4.22.32) và trái dứa (EC-3.4.22.33) Ở mỗi bộ phận khác nhau thì Bromelain có pH tối ưu khác nhau và cấu tạo cũng có sự khác nhau
Bromelain có trong toàn bộ cây dứa, nhưng nhiều nhất là trong quả Bromelain là nhóm endoprotease có khả năng phân cắt các liên kết peptid nội phân tử protein để chuyển phân tử protein thành các đoạn nhỏ gọi là các peptide (Dương Thị Hương Giang, 2005)
Thành phần chủ yếu của Bromelain có chứa nhóm sulfurhydryl thủy giải protein Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl của Bromelain thì thu được một enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.4.2 Tính chất vật lí của enzyme bromelain
Bánh mì
Bánh kẹo
Da
Chất tẩy rửa
Tăng độ dẻo của gluten
Tăng độ giòn
Loại bỏ lông, sắc tố, làm mềm da
Tẩy rửa vết protein
Trang 31Bromelain tan nhẹ trong nước và glycerine nhưng không tan trong dung môi hữu
cơ Murachi và cộng sự năm 1964 đã nghiên cứu về tính chất vật lý của enzyme Bromelain trích từ thân cây dứa và thấy như sau:
* : Tính từ phương pháp sa lắng – khuếch tán
** : Tính từ hằng số sa lắng và độ nhớt bên trong
*** : Tính bằng phương pháp Archibald
2.4.3 Tính chất hoá học của enzyme bromelain
2.4.3.1 Cấu tạo hoá học
Bromelain thân là một protease nhưng nó khác với các protease thực vật khác như papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose,
2 glucosamine, 1 xylose, và 1 fructose (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Tùy từng phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích, thành phần acid amin ở bromelain thân và quả thay đổi khác nhau Bromelain thân có thành phần acid amin thay đổi trong khoảng 321-144 acid amin và 283-161 acid amin đối với bromelain quả
Tính chất vật lí Kí hiệu Giá trị
Hằng số khuếch tán D 7.77 x 10-7 cm2/s
Thể tích riêng phần V 0.743 mL/g
Độ nhớt bên trong [l] 0.039 dl/g
Sự hấp thu A1%
Bảng 2.4: Tính chất vật lí của bromelain thân
(Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Trang 32Các nghiên cứu ghi nhận, polypeptide của Bromelain thân có acid amin đầu –
NH2 là valine và đầu carboxyl là glycine; còn đối với Bromelin quả, acid amin đầu –
NH2 là alanine (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.4.3.2 Cấu trúc không gian của bromelain
Murachi và Busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelain và nhận thấy cách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelain như sau:
Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp –
- Gly – Cys – Lys -
Bromelain là một protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối –S-S- (disulfur)
Tâm hoạt động –Cys đặt cách nhóm imidazole của histidine là 5Å
Chuỗi phân tử gấp nếp phức tạp thành dạng hình cầu
Trong phân tử bromelain thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra, trong phân tử bromelain thân còn có sự hiện diện của các ion Zn2+ với hàm lượng 2 mg/g enzyme có vai trò duy trì cấu trúc không gian của enzyme
2.4.4 Hoạt tính của enzyme bromelain
Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính Bromelain kể từ 3 tháng trước khi chín Trong đó hoạt tính cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín Khi trái chín, hoạt tính bromelain giảm xuống nhưng không mất hẳn
Một số nghiên cứu cho thấy Bromelain có hoạt tính khác nhau trên những cơ chất khác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của Bromelain mạnh hơn papain gấp 4 lần, còn cơ chất là casein thì khả năng phân giải của hai enzyme này
Trang 33tương đương nhau Đối với các cơ chất tổng hợp thì khả năng phân giải của Bromelain yếu hơn papain.
Bromelain có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase, hoạt tính esterase ở bromelain hơn papain và ficin (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
2.4.4.1 Cơ chế tác động
Hầu hết các tác giả đều thừa nhận vai trò của nhóm –SH của cystein, nhóm imidazole của histidine và nhóm disulfur trong hoạt động thủy phân của bromelain Nhóm –SH tham gia tạo thành acyl-thioester trung gian với nhóm carboxyl của cơ chất (nơi các liên kết peptide bị cắt)
Nhóm imidazole làm chất trung gian nhận gốc acid và chuyển cho nhóm anion của chất nhận khác
Cầu nối S-S có vai trò duy trì cấu trúc không gian của bromelain Casein và hemoglobin là 2 cơ chất tự nhiên được dùng nhiều nhất
Đầu tiên, bromelain kết hợp với protein và thủy phân sơ bộ cho ra polypeptide và acid amin Protein kết hợp với nhóm –SH của enzyme khiến nó bị ester hóa rồi nhóm imidazole sẽ khử ester để giải phóng enzyme, acid amin và peptide
Ở giai đoạn đầu, Zn2+ rất quan trọng, chúng kết hợp với nhóm –SH của tâm hoạt động hình thành mercaptid phân ly yếu (nhưng vẫn còn khả năng tạo liên kết phối trí bổ sung với các nhóm chức năng khác của phân tử protein như amin, carboxyl…) Enzyme –SH +Zn2+ => enzyme-S-Zn + H+
Do vậy nhóm –SH trong tâm hoạt động đã bị ester hóa bởi cơ chất, cấu trúc không gian được bảo vệ ổn định
2.4.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelain
Giống như các loại chất sinh học khác, bromelain cũng bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh sạch
Trang 34 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thời gian tác động càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme
Bromelain ở dạng tinh khiết thì nhạy với nhiệt: ở 5o C, pH = 4-10, Bromelain có hoạt tính tối đa trên Casein trong 24h; ở 55oC, pH=6 trong 20 phút, hoạt tính giảm 50%
Quá trình sấy thăng hoa (đông khô) mất hoạt tính 27% (Nguyễn Đức Lượng,
2004)
Ảnh hưởng của pH
pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme pH thích hợp nhất đối với bromelain không ổn định mà phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất của dung dịch đệm, sự có mặt của chất tăng hoạt
Biên độ pH khá rộng từ 3-10 nhưng pH tối ưu thường nằm trong khoảng 5-8 tùy
cơ chất: gelatin:5-6, casein: 7-8 (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Ảnh hưởng bởi các ion kim loại
Các ion kim loại thường gắn với phân tử protein tại các trung tâm hoạt động, do đó ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme Vì bromelain thuộc nhóm protease cystein, trung tâm hoạt động có nhóm –SH đều là hoạt chất hoạt hóa cho bromelain Ví dụ: KCN, Thioglycolic Acid, Cystein, Sulfid, Sisulfid, Cianit…
Bromelain bị ức chế bởi những ion hoặc hợp chất có ái lực mạnh hơn nhóm –SH, các tác nhân oxi hóa, halogen hóa, ankyl hóa như: Iodoacetate, bromoacetate, clo acetophenol, H2O2, methyl bromur
Trang 35Các ion kim loại như: Fe, Cu, Ag, Sb, Zn có xúc tác làm ổn định cấu trúc phân tử
bromelain (Nguyễn Đức Lượng, 2004)
Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản
Bảng 2.5: Ảnh hưởng của trạng thái và điều kiện bảo quản lên hoạt tính
enzyme bromelain
Điều kiện bảo quản Hoạt tính (UI/mg protein)
Dịch chiết Đông khô
Bảo quản ở 4oC trong 5 ngày 830 630
2.4.5 Ứng dụng của enzyme bromelain
2.4.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm
Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường
thời gian chế biến thường là dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất
nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá Nên hiện nay quy trình sản
xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme
bromelain để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm (Salem và
ctv,1995)
Chỉ cần một phần enzyme bromelain là có khả năng thuỷ phân 1000 phần thịt
Enzyme bromelain được rãi lên thịt dưới dạng bột hoặc được ngâm trong dung dịch enzyme hoặc tiêm dung dịch enzyme vào thịt để làm mềm thịt
Sử dụng trong quá trình đông tụ sữa: Thông thường để chế biến các sản phẩm từ
sữa người ta dùng renin Renin là loại enzyme được sử dụng làm đông tụ sữa truyền
thống Tuy nhiên lượng renin sản xuất chưa đáp ứng đủ yêu cầu thực tế Gần đây sử
Trang 36dụng enzyme thực vật trong chế biến sữa đang được phát triển, trong đó bromelain chồi dứa đang được quan tâm vào mục đích này.
2.4.5.2 Trong y dược học
Bromelain còn có tác dụng làm giảm di căn của bệnh ung thư, liều dùng 200 –
300 mg/kg thể trọng kết hợp với hoá trị hay xạ trị Trong công nghiệp dược phẩm, nhiều hãng dược phẩm ở Châu Âu đã đưa bromelain vào thành phần thuốc Ở Mỹ và Anh có thuốc Aranas do hãng W.H Roser điều chế
Điều trị các bệnh nhiễm trùng (Jayaran và ctv, 1991)
Ngăn ngừa bệnh tiêu chảy ở heo con (Chandler và Mynott, 1998)
Nhờ tác dụng làm dễ tiêu hoá protein, bromelain được điều chế với vài chất khác để bổ sung hay điều trị sự thiếu protease tiêu hoá tự nhiên (Nielsel và ctv, 2001) Thực phẩm chức năng mang tên tinh nghệ - dứa điều trị bệnh loét dạ dày, hành tá tràng, đại tràng, viêm da, bảo vệ gan, mật Đó là thành quả nghiên cứu của các nhà khoa học tại Dự án hoạt chất sinh học Việt - Bỉ (Viện Hóa học, Viện Khoa học - công nghệ VN) năm 2006
Ngoài ra bromelain còn dùng để thuỷ phân gan bò làm cao gan, thuốc bổ
2.4.5.3 Một số chế phẩm enzyme bromelain thương mại
Hình 2.3: Bột bromelain bổ sung
vào thức ăn cho gia súc do Thái
Lan sản xuất
Hình 2.4: Chất chiết từ lá và thân dứa được sản xuất dưới dạng viên nén, mỗi viên chứa
Trang 372.4.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme bromelain
2.4.6.1 Nghiên cứu trong nước
Ở nước ta co nhiều công trình công bố về việc nghiên cứu sử dụng enzyme bromelain, các công trình công bố tập trung trong các lĩnh vực tách chiết, tinh sạch và khả năng ứng dụng của enzyme này Một số công trình nghiên cứu về enzyme bromelain như:
Lê Thị Thanh Mai (1997) nghiên cứu các phương pháp tinh sạch và ứng dụng bromelain cho thấy có thể thu nhận bromelain theo phương pháp kết tủa bằng aceton hay cô đặc theo phương pháp siêu lọc rồi kết tủa bằng aceton, cũng như có thể tinh sạch bromelain theo phương pháp lọc gel sephadex G75 với hiệu suất cao Nghiên cứu này còn cho thấy có thể sử dụng bromelain để rút ngắn thời gian chế biến nước mắm Dương Thị Hương Giang và Lê Thanh Hùng (2002) nghiên cứu điều kiện nhằm ổn định phương pháp tinh sạch bromelain bằng nước khóm thô cho thấy có thể thu nhận và tinh sạch enzyme bromelain bằng phương pháp sắc ký và trao đổi ion trên cột SP-Strea mline với hiệu suất cao
Dương Thị Hương Giang và ctv (2005) nghiên cứu tinh sạch bromelain từ phụ phẩm vỏ dứa cho thấy có thể tinh sạch bromelain bằng phương pháp sắc ký gel mở rộng với hệ thống cột Stream line 50 và gel trao đổi ion âm SP-Strea mline XL với hiệu suất cao
2.4.6.2 Nghiên cứu ngoài nước
Theo Salem và ctv (1995) đã sử dụng tỉ lệ là 0,3% enzyme so với cá gồm papain, tripsin ,ficin và bromelain thêm vào cùng với 25% muối ngay từ lúc đầu của quá trình sản xuất nước mắm trên năm loại cá (sardine, macaroni, bolti, bourri và shark) Kết quả cho thấy với 0,3% bromelain cho hàm lượng đạm tổng số cao nhất so với các enzyme còn lại trên mẫu cá mòi (sardine) sau 180 ngày lên men và cao hơn so với mẫu đối chứng lên men cổ truyền là 30%
Trang 38Liang và ctv (1999) nghiên cứu hoạt tính của bromelain sau khi bổ sung polyphenol trích ly từ trà xanh của Trung Quốc cho thấy tính bền nhiệt của bromelain được tăng lên
2.5 KỸ THUẬT CƠ BẢN CHUẨN BỊ DỊCH PROTEIN THÔ
Sau khi lựa chọn được nguồn cung cấp protein việc tiếp theo là phải đưa protein về dạng dịch Có nhiều phương pháp: phá tế bào bằng áp suất thẩm thấu, nghiền bằng thiết bị trung tính, nghiền tay, phá tế bào bằng phương pháp siêu âm Các phương pháp kể trên thích hợp để xử lí các mô mềm, mô động vật, thực vật Đối với vi khuẩn có vỏ bảo vệ chắc chắn thì tốt nhất nghiền bằng cối thủy tinh có thêm vật liệu chà xát như cát hay bột nhôm, hoặc xử lí với lysozine (enzyme phá vách tế bào) Đối với những tế bào
có vách bảo vệ rất chắc như nấm men trong một số trường hợp phải sử dụng máy ép tạo áp suất cao để phá vở tế bào Một số trường hợp có thể sử dụng máy nghiền để phá mẫu
Sau khi nhận được sinh khối tế bào bị nghiền, công việc tiếp theo là phải tách vách và các mảnh vỡ tế bào ra khỏi dịch chứa protein được giải phóng trong quá trình nghiền Thường người ta sử dụng phương pháp: ly tâm, lọc, tách dịch 2 lớp, tách nucleic acid và lipid Tốt nhất là dịch thô được bảo quản ở nhiệt độ thấp
2.6 CÁC PHƯƠNG PHÁP TỦA PROTEIN
Có năm phương pháp lắng tủa protein : tủa bằng muối, bằng dung môi hữu cơ, tủa tại điểm đẳng điện, tủa bằng polymer trung tính không mang điện và bằng các chất
đa điện phân
2.6.1 Tủa bằng muối sulfate ở các nồng độ khác nhau
Để tinh sạch protein ở mức độ phòng thí nghiệm, tủa bằng ammonium sulfate thường được sử dụng bước đầu trong quy trình tách chiết và tinh sạch protein Ở các nồng độ muối cao protein sẽ tủa khỏi dung dịch mà không bị biến tính
Khi cho thêm muối vào protein, các phân tử muối sẽ phân ly thành các ion, chính các ion này bắt lấy các phân tử nước khỏi protein, do vậy các phân tử protein có
Trang 39khuynh hướng liên kết với nhau và bắt đầu tập hợp lại Khi đủ một lượng muối vào thì protein sẽ bắt đầu tủa Nếu quá trình này được thực hiện trong điều kiện nhiệt độ lạnh thì protein sẽ tủa mà không bị biến tính Sau đó thu tủa protein bằng cách ly tâm và hòa tan trở lại trong dung dịch đệm Dung dịch lúc này vẫn chứa nhiều muối còn lại trong tủa Có nhiều phương pháp để rửa muối khỏi protein nhưng người ta thường loại muối bằng phương pháp thẩm tích hay phương pháp lọc gel Dung dịch sau khi rửa sạch muối được giữ để sử dụng cho các quá trình tinh sạch và phân tích tiếp theo (Dương Thị Hương Giang, 2004)
2.6.2 Tủa bằng dung môi hữu cơ
Các dung môi hữu cơ như: aceton, ethanol (được dùng nhiều nhất) Ưu điểm của phương pháp là cho kết quả tủa tốt hơn so với tủa bằng muối, không cần loại muối trước khi chạy sắc kí, cách tiến hành đơn giản Nhưng khi tủa bằng dung môi hữu cơ phải thực hiện trong điều kiện lạnh vì nếu tủa ở nhiệt độ thường sẽ làm biến tính protein, lượng dung môi cần dùng tương đối nhiều
2.6.3 Tủa bằng điểm đẳng nhiệt
Dựa trên tính chất protein có độ hoà tan thấp ở điểm đẳng điện Ở điểm đẳng điện độ hydrate-hoá của protein là cực tiểu làm tăng tương tác giữa các phân tử protein, dẫn đến tạo tủa Khó khăn của phương pháp này là do protein chỉ có khoảng giá trị pH đẳng điện giới hạn Phương pháp này cho hiệu quả không cao, tuy nhiên cách tiến hành phức tạp và thường phải kết hợp với phương pháp tủa bằng dung môi hữu cơ
2.6.4 Tủa bằng các loại polymer
Polyethyleneglycol (PEG) là polymer được sử dụng rộng rãi để tủa protein Cơ chế tủa bằng polymer là tạo tủa protein nhờ giảm mức độ hydrate-hoá của nó Thường người ta dùng nồng độ polymer ở tỉ lệ 5-15% (trọng lượng/thể tích) Ưu điểm của phương pháp này là có thể tiến hành ở nhiệt độ thường, hiệu suất tạo kết tủa cao, tuy nhiên chi phí tốn kém Người ta thường sử dụng 2 loại polymer có MW 6000 và
12000
Trang 402.6.5 Tủa bằng chất đa điện phân
Các chất đa điện phân như polyacrylic acid, polysaccharide và polyphosphate có tính acid cũng được sử dụng để tủa protein, tuy có hạn chế nhất định về mặt công nghệ ở quy mô sản xuất lớn Lợi thế cơ bản của phương pháp này là sử dụng chất đa điện phân ở nồng độ thấp (0.05-0.1%), hiệu suất kết tủa cao Nhược điểm của phương pháp này là rất đắt tiền và dễ biến tính protein (Nguyễn Tiến Thắng, 2009)
2.7 SỰ CỐ ĐỊNH ENZYME
2.7.1 Định nghĩa enzyme cố định
Enzyme cố định (hay còn gọi là enzyme không hoà tan) là những enzyme chuyển động trong không gian bị giới hạn Sự giới hạn của enzyme đạt được bằng cách đưa nó vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha dung dịch tự do mà ở đó nó vẫn có khả năng tiếp xúc được với phân tử cơ chất Pha chứa enzyme cố định thường không tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa nước cao phân tử
Theo Michael Trevan, thuật ngữ cố định (immobilization enzyme, insoluble enzyme) được hiểu là đưa những phân tử enzyme vào những pha riêng rẽ Pha nay được tách riêng với dung dịch tự do Pha enxyme thường không tan trong nước và được gắn với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn
Theo Kalus Mosbach, các chất xúc tác sinh học cố định là enzyme, tế bào, cơ thể sống hoặc tổ hợp giữa chúng trong một trạng thái cho phép sử dụng lại và liên tục
2.7.2 Tính chất ưu và nhược của enzyme cố định
2.7.2.1 Ưu điểm
Enzyme cố định ngày càng sử dụng rộng rãi là nhờ vào những đặc điểm nổi bật:
Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định trong một thời gian dài Do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao, tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền Thuận lợi trong các quá trình tự động hoá và liên tục