Tạo kháng thể đơn dòng kháng protein e7 human papillomavirus type 16

Lời cảm ơn Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với PGS.TS. Hồ Huỳnh Thùy Dương. Cô đã hướng dẫn và tạo cho tôi rất nhiều cơ hội trong học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Sinh, những người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức khoa học quý báu giúp tôi hiểu và yêu thích lĩnh vực này. Tôi xin cảm ơn các bạn, các em trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, mọi người đã giúp đỡ, động viên và cho tôi những lời khuyên rất hữu ích trong nghiên cứu khoa học. Cuồi cùng, tôi xin cảm ơn anh Phong, anh đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong cuộc sống. Nhờ anh mà tôi yên tâm làm nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Trần Quốc Vũ Chương 1 – Tổng quan tài liệu -1- MỞ ĐẦU Kể từ khi công trình nghiên cứu về phương pháp tạo tế bào lai (hybridoma) do hai nhà khoa học Cesar Milstein và Georges Kohler được công bố, kháng thể đơn dòng đang được phát triển một cách nhanh chóng, và dần trở nên quan trọng trong cuộc chiến chống lại bệnh tật. Chúng được sử dụng như là công cụ chẩn đoán cũng như điều trị cho nhiều bệnh ung thư. Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là căn bệnh ung thư phổ biến ở phụ nữ trên thế giới, hằng năm có khoảng 250.000 người tử vong vì căn bệnh này. Ở Việt Nam mỗi năm có khoảng 5.174 ca mắc và 2.472 ca tử vong vì UTCTC [32]. Do đó, việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm, hiệu quả để giảm thiểu tỉ lệ tử vong do UTCTC là rất cần thiết. Nhằm mục đích phát triển một phương pháp chẩn đoán UTCTC hiệu quả, dễ thực hiện, dễ tiếp cận, chi phí thấp đối với bệnh nhân và có thể triển khai rộng rãi, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của Human papillomavirus type 16”. Ngoài ra, kết quả của luận văn này cũng sẽ góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam với nhiều ứng dụng đa dạng. Luận văn được thực hiện với mục tiêu chính là tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của HPV type 16, đây là protein của HPV type nguy cơ cao có thể sử dụng như một chỉ thị phân tử quan trọng cho việc chẩn đoán và theo dõi diễn tiến của UTCTC. Nội dung của của luận văn này tập trung vào các điểm sau: - Tạo các dòng tế bào lai sản xuất KTĐD kháng protein E7 của HPV-16 từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp được tinh sạch. Chương 1 – Tổng quan tài liệu -2- - Sản xuất và thu nhận KTĐD kháng protein E7 của HPV-16 bằng phương pháp nuôi cấy in vitro các dòng tế bào lai. - Kiểm tra các đặc tính của KTĐD thu nhận được bằng phương pháp Western blot, miễn dịch huỳnh quang, ELISA. -i- MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. HUMAN PAPILLOMAVIRUS VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 3 1.1.1. Sơ lược về tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 3 1.1.2. UTCTC do Human papillomavirus 4 1.1.3. Chu trình xâm nhiễm của HPV 5 1.2. PROTEIN E7 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE NGUY CƠ CAO 6 1.2.1. Cấu trúc protein E7 6 1.2.2. Vai trò của protein E7trong phát sinh ung thư 7 1.3. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 10 1.3.1. Cấu trúc của kháng thể 10 -ii- 1.3.2. Sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể 11 1.3.3. Kháng thể đơn dòng và một số ứng dụng 13 1.4. SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG BẰNG KỸ THUẬT TẠO TẾ BÀO LAI (HYBRIDOMA) 14 1.4.1. Các bước chính trong sản xuất KTĐD 15 1.4.2. Một số công trình trong và ngoài nước liên quan đến việc tạo KT ĐD kháng protein E7 của Human papillomavirus 24 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 26 2.1.1. Tế bào 26 2.1.2. Kháng nguyên 26 2.1.3. Chuột dùng gây đáp ứng miễn dịch 26 2.1.4. Hóa chất – Môi trường: 27 2.2. PHƯƠNG PHÁP 31 2.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột 31 2.2.2. Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) 32 2.2.3. Phương pháp nhân dòng tế bào lai sản xuất KTĐD in vitro và thu nhận KTĐD 35 2.2.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của KTĐD 36 2.2.5. Phương pháp ELISA 36 -iii- 2.2.6. Phương pháp chuyển gene vào tế bào CHO-K1 37 2.2.7. Xác định ái lực của các KTĐD bằng phương pháp ELISA 37 2.2.8. Các phương pháp kiểm tra đặc tính của KTĐD 38 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1. TẠO CÁC DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV-16 41 3.1.1. Kết quả gây đáp ứng miễn dịch chuột BALB/c 41 3.1.2. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sản xuất KTĐD 42 3.1.3. Kết quả sàng lọc các dòng tế bào lai tạo kháng thể kháng protein E7 HPV- 16 42 3.2. THU NHẬN KTĐD TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 44 3.2.1. Xác định isotype của KTĐD 44 3.2.2. Kết quả thu nhận KTĐD 45 3.3. CÁC ĐẶC TÍNH CỦA KTĐD 46 3.3.1. Xác định hằng số ái lực của KTĐD 46 3.3.2. Tính đặc hiệu của KTĐD với protein E7 HPV-16 tái tổ hợp 49 3.3.3. Tính đặc hiệu của KTĐD với protein E7 HPV-16 biểu hiện tự nhiên trong tế bào CaSki 53 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 58 -iv- TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 62 -v- DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS : Ammonium persulphate AP : Alkaline phosphatase bp : Base pair dH 2 O : Nước cất (distilled water) DTT : Dithiothreitol E. coli : Escherichia coli EDTA : Ethylene diamine tetra-acetic acid GST : Glutathione S-transferase HPV : Human papillomavirus HRP : Horseradish peroxidase Kb : Kilo base kDa : Kilo Dalton KTĐD : kháng thể đơn dòng OD : Mật độ quang (Optical Density) PBS : Phosphate buffered saline PEG : Polyethylene glycol pRb : Retinoblastoma protein -vi- SDS : Sodium dodecyl sulfate SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel electrophoresis RPMI : Roswell Park Memorial Institute TRITC : Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate TBS : Tris buffer saline TBST : Dung dịch rửa TBS + Tween TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylethylene diamine UTCTC : Ung thư cổ tử cung -vii- DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1: Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch ở chuột……………….19 Bảng 1.2 So sánh phương pháp sản xuất KTĐD in vitro và in vivo…….23 Bảng 2.1. Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch chuột BALB/c 31 [...]... [27] Fiedler và cộng sự (2005) đã tạo kháng thể đa dòng kháng protein E7 của HPV18 và -45 trên dê từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp Kháng thể đa dòng tạo được phản ứng đặc hiệu với protein E7 trong tế bào chuyển gene, tế bào HeLa biểu hiện tự nhiên protein E7 và các mẫu sinh thiết của bệnh nhân UTCTC Đồng thời, các kháng thể đa dòng cho phép định lượng protein E7 trong tế bào ung thư [13] -24-... quan đến việc tạo KT ĐD kháng protein E7 của Human papillomavirus Ngoài nước Theo Jeon và cộng sự (2007), nhóm nghiên cứu tạo KTĐD kháng protein E7 HPV -16 trên chuột từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp Kết quả cho thấy KTĐD 130-9-7 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV -16 biểu hiện trong tế bào nuôi cấy được chuyển gene HPV -16 và các mẫu phết tế bào cổ tử cung của bệnh nhân nhiễm HPV -16 Nhóm nghiên... hợp của kháng nguyên và kháng thể tùy thuộc từng loại kháng nguyên và kháng thể Điểm khác biệt quan trọng giữa tương tác kháng thể -kháng nguyên với các tương tác protein- protein khác là trong vùng paratope của kháng thể có nhiều gốc amino acid thơm Những amino acid này đóng vai trò chính trong các tương tác nói trên [21] 1.3.3 Kháng thể đơn dòng và một số ứng dụng Trong đáp ứng miễn dịch, nhiều dòng tế... hiện protein E7 Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh protein E7 của các type nguy cơ cao như HPV -16, -18 và -45 biểu hiện mạnh trong các mẫu sinh thiết của bệnh nhân UTCTC ở giai đoạn ung thư xâm lấn [9] Do đó, sự biểu hiện vượt mức của protein E7 type nguy cơ cao, đặc biệt là của HPV -16 hứa hẹn là một chỉ thị phân tử đặc hiệu cho UTCTC 1.3 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 1.3.1 Cấu trúc của kháng thể Kháng. .. B được hoạt hóa và tổng hợp nhiều kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau của cùng một kháng nguyên cho trước Tập hợp các kháng thể này được gọi là kháng thể đa dòng Trong khi đó, kháng thể đơn dòng (KTĐD) là kháng thể chỉ nhận diện một epitope duy nhất trên một kháng nguyên Do đó, tất cả các KTĐD cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào của tế bào B [23] KTĐD... được kháng nguyên thích hợp, việc lựa chọn và chất lượng cùa kháng nguyên quyết định sự tạo thành công một kháng thể Trước khi phát triển bất kỳ một kháng thể nào, cần xác định rõ mục tiêu sử dụng kháng thể đó Việc lựa chọn kháng nguyên phù hợp sẽ làm tăng khả năng sản xuất ra kháng thể với các đặc tính mong muốn Cụ thể, các kháng thể sử dụng trong kỹ thuật Western blot phải có khả năng phát hiện các protein. .. này Hai protein muộn L1 và L2 được biểu hiện tạo nên lớp vỏ capsid của virus Protein E4 tương tác với các protein trong bộ xương tế bào giúp lắp ghép các phần tử virus mới tạo các hạt virion Các hạt virion được phóng thích ra ngoài bằng cách nảy chồi để tiếp tục một chu trình xâm nhiễm tiếp theo [5], [29] 1.2 PROTEIN E7 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE NGUY CƠ CAO 1.2.1 Cấu trúc protein E7 Protein E7 là một... (retinoblastoma protein) Motif LXCXE trong vùng bảo tồn CR2 là vị trí gắn của protein E7 với họ protein pRb Protein E7 của HPV type nguy cơ thấp và type nguy cơ cao đều có khả năng gắn với protein pRb nhưng E7 của type nguy cơ cao có ái lực gắn mạnh hơn Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy chỉ có tương tác giữa protein E7 type nguy cơ cao với pRb mới kích hoạt con đường phân hủy pRb thông qua ubiquitin... nhiều hơn là đáp ứng miễn dịch thể Nhưng nếu kháng nguyên được tiêm nhắc lại thì đáp ứng miễn dịch dịch thể sẽ tăng lên, tạo một đáp ứng với nồng độ kháng thể cao và bền vững [21] Đường tiêm kháng nguyên vào cơ thể Nhiều phương pháp tiêm kháng nguyên vào cơ thể động vật được sử dụng như: tiêm dưới da, vào khoang bụng, bắp thịt, hay tĩnh mạch Đường tiêm kháng nguyên vào cơ thể ảnh hưởng đến cường độ và... tác giữa kháng nguyên và kháng thể [21], [23] Lực tương tác giữa kháng nguyên – kháng thể Tương tác giữa kháng thể với kháng nguyên là tương tác giữa epitope và paratope Tương tác này thuộc loại tương tác không cộng hóa trị thuận nghịch, được hình thành bởi những lực liên kết sau:  Liên kết tĩnh điện là liên kết giữa các amino acid mang điện tích trái dấu trong chuỗi bên của kháng thể và kháng nguyên . xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam với nhiều ứng dụng đa dạng. Luận văn được thực hiện với mục tiêu chính là tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của HPV type 16, đây là protein của HPV type. của kháng thể 10 -ii- 1.3.2. Sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể 11 1.3.3. Kháng thể đơn dòng và một số ứng dụng 13 1.4. SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG BẰNG KỸ THUẬT TẠO. HPV 5 1.2. PROTEIN E7 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE NGUY CƠ CAO 6 1.2.1. Cấu trúc protein E7 6 1.2.2. Vai trò của protein E7trong phát sinh ung thư 7 1.3. KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 10 1.3.1.