Tạo kháng thể đơn dòng kháng protein e7 human papillomavirus type 16

Nội dung của của luận văn này tập trung vào các điểm sau: - Tạo các dòng tế bào lai sản xuất KTĐD kháng protein E7 của HPV-16 từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp được tinh sạch..

Lời cảm ơn

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với PGS.TS Hồ Huỳnh Thùy Dương Cô

đã hướng dẫn và tạo cho tôi rất nhiều cơ hội trong học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy, Cô trong khoa Sinh, những người

đã truyền đạt cho tôi những kiến thức khoa học quý báu giúp tôi hiểu và yêu thích lĩnh vực này

Tôi xin cảm ơn các bạn, các em trong phòng thí nghiệm Sinh học phân tử, mọi người đã giúp đỡ, động viên và cho tôi những lời khuyên rất hữu ích trong nghiên cứu khoa học

Cuồi cùng, tôi xin cảm ơn anh Phong, anh đã hỗ trợ cho tôi rất nhiều trong cuộc sống Nhờ anh mà tôi yên tâm làm nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Trần Quốc Vũ

-1-

MỞ ĐẦU

Kể từ khi công trình nghiên cứu về phương pháp tạo tế bào lai (hybridoma) do hai nhà khoa học Cesar Milstein và Georges Kohler được công bố, kháng thể đơn dòng đang được phát triển một cách nhanh chóng, và dần trở nên quan trọng trong cuộc chiến chống lại bệnh tật Chúng được sử dụng như là công cụ chẩn đoán cũng như điều trị cho nhiều bệnh ung thư

Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là căn bệnh ung thư phổ biến ở phụ nữ trên thế giới, hằng năm có khoảng 250.000 người tử vong vì căn bệnh này Ở Việt Nam mỗi năm có khoảng 5.174 ca mắc và 2.472 ca tử vong vì UTCTC [32] Do đó, việc nghiên cứu, phát triển các phương pháp chẩn đoán sớm, hiệu quả để giảm thiểu tỉ lệ tử vong

do UTCTC là rất cần thiết

Nhằm mục đích phát triển một phương pháp chẩn đoán UTCTC hiệu quả, dễ thực hiện, dễ tiếp cận, chi phí thấp đối với bệnh nhân và có thể triển khai rộng rãi, chúng tôi thực hiện đề tài “Tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của Human papillomavirus type 16” Ngoài ra, kết quả của luận văn này cũng sẽ góp phần hoàn thiện quy trình sản xuất kháng thể đơn dòng tại Việt Nam với nhiều ứng dụng đa dạng

Luận văn được thực hiện với mục tiêu chính là tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của HPV type 16, đây là protein của HPV type nguy cơ cao có thể sử dụng như một chỉ thị phân tử quan trọng cho việc chẩn đoán và theo dõi diễn tiến của UTCTC Nội dung của của luận văn này tập trung vào các điểm sau:

- Tạo các dòng tế bào lai sản xuất KTĐD kháng protein E7 của HPV-16 từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp được tinh sạch

-2-

- Sản xuất và thu nhận KTĐD kháng protein E7 của HPV-16 bằng phương

pháp nuôi cấy in vitro các dòng tế bào lai

- Kiểm tra các đặc tính của KTĐD thu nhận được bằng phương pháp Western blot, miễn dịch huỳnh quang, ELISA

-i-MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 HUMAN PAPILLOMAVIRUS VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG 3

1.1.1 Sơ lược về tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam 3

1.1.2 UTCTC do Human papillomavirus 4

1.1.3 Chu trình xâm nhiễm của HPV 5

1.2 PROTEIN E7 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE NGUY CƠ CAO 6

1.2.1 Cấu trúc protein E7 6

1.2.2 Vai trò của protein E7trong phát sinh ung thư 7

1.3 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG 10

1.3.1 Cấu trúc của kháng thể 10

-ii-1.3.2 Sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể 11

1.3.3 Kháng thể đơn dòng và một số ứng dụng 13

1.4 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG BẰNG KỸ THUẬT TẠO TẾ BÀO LAI (HYBRIDOMA) 14

1.4.1 Các bước chính trong sản xuất KTĐD 15

1.4.2 Một số công trình trong và ngoài nước liên quan đến việc tạo KT ĐD kháng protein E7 của Human papillomavirus 24

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU 26

2.1.1 Tế bào 26

2.1.2 Kháng nguyên 26

2.1.3 Chuột dùng gây đáp ứng miễn dịch 26

2.1.4 Hóa chất – Môi trường: 27

2.2 PHƯƠNG PHÁP 31

2.2.1 Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột 31

2.2.2 Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) 32

2.2.3 Phương pháp nhân dòng tế bào lai sản xuất KTĐD in vitro và thu nhận KTĐD 35

2.2.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của KTĐD 36

2.2.5 Phương pháp ELISA 36

-iii-2.2.6 Phương pháp chuyển gene vào tế bào CHO-K1 37

2.2.7 Xác định ái lực của các KTĐD bằng phương pháp ELISA 37

2.2.8 Các phương pháp kiểm tra đặc tính của KTĐD 38

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 3.1 TẠO CÁC DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV-16 41

3.1.1 Kết quả gây đáp ứng miễn dịch chuột BALB/c 41

3.1.2 Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sản xuất KTĐD 42

3.1.3 Kết quả sàng lọc các dòng tế bào lai tạo kháng thể kháng protein E7 HPV-16 42

3.2 THU NHẬN KTĐD TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO 44

3.2.1 Xác định isotype của KTĐD 44

3.2.2 Kết quả thu nhận KTĐD 45

3.3 CÁC ĐẶC TÍNH CỦA KTĐD 46

3.3.1 Xác định hằng số ái lực của KTĐD 46

3.3.2 Tính đặc hiệu của KTĐD với protein E7 HPV-16 tái tổ hợp 49

3.3.3 Tính đặc hiệu của KTĐD với protein E7 HPV-16 biểu hiện tự nhiên trong tế bào CaSki 53

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN 58

-iv-

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 PHỤ LỤC 62

E coli : Escherichia coli

EDTA : Ethylene diamine tetra-acetic acid

-vi-

SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel

electrophoresis RPMI : Roswell Park Memorial Institute

TRITC : Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate

TEMED : N,N,N’,N’-tetramethylethylene diamine

-vii-DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1: Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch ở chuột……….19

Bảng 1.2 So sánh phương pháp sản xuất KTĐD in vitro và in vivo…….23

Bảng 2.1 Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch chuột BALB/c 31

-vii-DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang Bảng 1.1: Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch ở chuột……….19

Bảng 1.2 So sánh phương pháp sản xuất KTĐD in vitro và in vivo…….23

Bảng 2.1 Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch chuột BALB/c 31

-viii-

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ

Trang Hình 1.1 Tỉ lệ mắc mới của UTCT (trên 100.000 dân) ở phụ nữ trong tất cả các độ tuổi

theo từng quốc gia 3

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gene của HPV type 16 4

Hình 1.3 Chu trình xâm nhiễm của HPV 5

Hình 1.4 Cấu trúc protein E7 của HPV 7

Hình 1.5 DNA virus HPV gắn chèn vào DNA tế bào chủ 8

Hình 1.6 Vai trò của protein E7 9

Hình 1.7 Cấu trúc cơ bản của kháng thể .11

Hình 1.8 Động học của quá trình hình thành đáp ứng miễn dịch .20

Hình 2.1 Thang phân tử protein (Fermentas) 28

Hình 3.1 Kết quả ELISA kiểm tra đáp ứng miễn dịch của 2 chuột trước và sau khi gây đáp ứng miễn dịch với protein E7 HPV-16 .41

Hình 3.2 Biểu đồ thể hiện kết quả sàng lọc các dòng hydridoma .43

Hình 3.3 Kết quả xác định isotype của các KTĐD .45

Hình 3.4 Kết quả điện di SDS-PAGE KTĐD 2C1 và 6B10 .46

Hình 3.5 Đồ thị xác định hằng số ái lực của KTĐD 2C1 (A) và KT ĐD 6B10 (B) .48

Hình 3.6: Kết quả Western blot trên KTĐD với các protein E7 HPV-6, E7 HPV-11, E7 HPV-16, E7 HPV-18 tái tổ hợp 49

-ix-

Hình 3.7 Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào K1/EGFP-E7-16, K1/EGFP-C2 với KTĐD quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng

CHO-541 nm và 488 nm 52 Hình 3.8 Kết quả Western blot của các KTĐD 2C1 với dịch ly giải tế bào CaSki, C33A và protein E7 HPV-16 tái tổ hợp 54 Hình 3.9 Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CaSki, C33A với KTĐD quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng 541 nm và 488 nm .56

-3-

1.1 HUMAN PAPILLOMAVIRUS VÀ UNG THƯ CỔ TỬ CUNG

1.1.1 Sơ lược về tình hình ung thư cổ tử cung trên thế giới và Việt Nam

Ung thư cổ tử cung (UTCTC) là căn bệnh ung thư phổ biến đứng hàng thứ hai trong số các bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ trên toàn thế giới Theo ước tính, có khoảng 500.000 ca UTCTC mới được phát hiện và 250.000 người chết vì căn bệnh này mỗi năm Khoảng 80% các trường hợp mắc UTCTC là ở các nước đang phát triển [32]

Việt Nam có khoàng 30,77 triệu phụ nữ ở độ tuổi có nguy cơ bị UTCTC Ước tính hàng năm phát hiện 5.174 ca mắc và 2.472 ca chết vì UTCTC Ở Việt Nam, trong

số các bệnh ung thư thường gặp ở phụ nữ thì UTCTC đứng hàng thứ 5 và là loại ung thư thường gặp nhất ở phụ nữ trong độ tuổi từ 15 – 44 tuổi [32]

Hình 1.1 Tỉ lệ mắc mới của UTCTC (trên 100.000 dân) ở phụ nữ trong tất cả các độ tuổi theo từng quốc gia [32]

-4-

1.1.2 UTCTC do Human papillomavirus

Việc bị nhiễm Human papillomavirus (HPV) có liên quan đến 99% các trường hợp UTCTC Trong đó, HPV type 16 (HPV-16) là phổ biến nhất khi hiện diện trong 50% các ca ung thư, kế đó là HPV-18 [11]

HPV-16 là thành viên của họ Papovaviridae, đó là những virus có kích thước nhỏ (đường kính khoảng 55 nm), không có màng bao và có lớp vỏ capsid 20 mặt Bộ gene của HPV-16 là một phân tử DNA vòng, mạch đôi có kích thước khoảng 7.900 bp,

mã hóa cho 8 khung đọc mở ORF (open reading frame) Các protein của HPV được dịch mã từ những phân tử mRNA polycistronic có khung đọc mở trùng lấp Có 3 vùng chính trên bộ gene của HPV-16: vùng điều hòa (LCR), kiểm soát sự phiên mã của các khung đọc mở (open reading frame – ORF); vùng sớm, gồm các ORF (E1, E2, E4, E5, E6 và E7); vùng muộn, mã hóa cho 2 protein cấu trúc của vỏ capsid (L1, L2) [6][7]

Hình 1.2 Cấu trúc bộ gene của HPV type 16 [11]

-5-

Dựa vào khả năng gây ung thư, HPV-16 được xếp vào nhóm nguy cơ cao risk); cùng với HPV-18, HPV-16 gây ra các tổn thương biểu mô tế bào vảy và có thể dẫn tới ung thư xâm lấn Trong khi đó, các type được xếp vào nhóm nguy cơ thấp (phổ biến là HPV-6 và -11) thường liên quan các mụn nhọt sinh dục hoặc các tổn thương

(high-biểu mô tế bào vảy mức độ nhẹ, nhưng hiếm khi gây ra ung thư xâm lấn [7]

1.1.3 Chu trình xâm nhiễm của HPV

Chu trình xâm nhiễm của virus liên quan chặt chẽ đến trạng thái biệt hóa của tế bào chủ,

Hình 1.3 Chu trình xâm nhiễm của HPV [11]

Các virus xâm nhiễm vào các tế bào nền qua các tổn thương ở biểu mô Khi các

tế bào nền bắt đầu chu trình phân chia tế bào thì hai protein sớm E1và E2 được biểu hiện tạo thành một phức hợp gắn vào vị trí khởi đầu sao chép (ori) của DNA virus và huy động các polymerase của tế bào chủ để thực hiện quá trình sao chép DNA Lúc

-6-

này bộ gene của virus sẽ sao chép đồng thời với sự sao chép DNA tế bào chủ.và tồn tại

ở trang thái epsisome, với khoảng 50 bản sao/tế bào Mặt khác, ở giai đoạn này gene E2 tham gia vào cơ chế điều hòa âm sự biểu hiện của các gene gây ung thư (oncogene) như E6 và E7 [5], [16]

Ở những tế bảo nền không bị nhiễm virus, sau quá trình phân bào, các tế bào mới sẽ rời lớp nền di chuyển lên phía trên và bước vào giai đoạn biệt hóa để cuối cùng trở thành tế bào vảy Trong khi đó, các tế bào bị nhiễm HPV type nguy cơ cao như HPV-16 và -18 sẽ đi vào pha S của chu trình phân bào, làm tăng cường quá trình sao

chép bộ gene của virus thành hàng ngàn bản sao/tế bào Ngoài ra, các gene sớm và

gene muộn của virus cũng được tăng cường biểu hiện trong giai đoạn này Hai protein muộn L1 và L2 được biểu hiện tạo nên lớp vỏ capsid của virus Protein E4 tương tác với các protein trong bộ xương tế bào giúp lắp ghép các phần tử virus mới tạo các hạt virion Các hạt virion được phóng thích ra ngoài bằng cách nảy chồi để tiếp tục một

chu trình xâm nhiễm tiếp theo [5], [29]

1.2 PROTEIN E7 HUMAN PAPILLOMAVIRUS TYPE NGUY CƠ CAO 1.2.1 Cấu trúc protein E7

Protein E7 là một oncoprotein có kích thước khoảng 98 amino acid (aa), gồm ba vùng bảo tồn là CR1, CR2, và CR3, trong đó vùng CR1 và CR2 có sự tương đồng cao với vùng CR1 và CR2 trên protein E1A của Adenovirus và kháng nguyên T của virus SV40 Vùng bảo tồn CR1 nằm ở đầu N của protein E7 có chức năng làm chuyển dạng

tế bào và hoạt hóa sự phân hủy protein ức chế khối u pRb (retinoblastoma protein)

Motif LXCXE trong vùng bảo tồn CR2 là vị trí gắn của protein E7 với họ protein pRb Protein E7 của HPV type nguy cơ thấp và type nguy cơ cao đều có khả năng gắn với protein pRb nhưng E7 của type nguy cơ cao có ái lực gắn mạnh hơn Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy chỉ có tương tác giữa protein E7 type nguy cơ cao với pRb mới kích hoạt con đường phân hủy pRb thông qua ubiquitin proteasome Trong vùng CR2

-7-

còn có vị trí phosphoryl hóa của enzyme casein kinase II (CKII).Vùng bảo tồn CR3 nằm ở đầu carboxyl của protein E7 mang hai motif bảo tồn CXXC cách nhau 29-30 aa Vùng này có cấu trúc ngón tay kẽm cần thiết cho quá trình dimer hóa và ổn định cấu trúc của protein E7 trong tế bào Nhiều protein khác trong tế bào có khả năng tương tác với protein E7 thông qua vùng bảo tồn này [5][19]

Hình 1.4 Cấu trúc protein E7 của HPV [5]

1.2.2 Vai trò của protein E7trong phát sinh ung thư

Trong giai đoạn bộ gene của virus tồn tại ở trạng thái episome, protein E7 được biểu hiện ở mức độ rất thấp do bị kiểm soát chặt chẽ bởi nhân tố điều hòa phiên mã là protein E2 Tuy nhiên, khi virus HPV type nguy cơ cao sát nhập bộ gene của mình vào

bộ gene của tế bào chủ thì protein E7 được biểu hiện vượt mức Sự tăng biểu hiện của protein E7 được giải thích là khi virus sát nhập bộ gene vào tế bào chủ thì gene E1 và E2 bị mất đoạn dẫn đến bất hoạt nên không còn khả năng kiểm soát sự phiên mã của gene E7 Do đó, các type nguy cơ cao và nguy cơ thấp có sự khác nhau về mức độ biểu hiện của protein E6 và E7 trong tế bào [15]

Vùng có chức năng dimer hóa

Vùng gắn protein pRB và phân hủy bởi Ubiquitin proteasome

Vị trí phosphoryl hóa Vùng cần thiết cho hoạt

động chuyển dạng tế bào và

phân hủy pRB

-8-

Hình 1.5 DNA virus HPV gắn chèn vào DNA tế bào chủ [17]

Tế bào bình thường khi bước vào pha S của chu trình phân bào thì phức hợp cyclin D1/cyclin-dependent kinase (CDK)4 và cyclin E/CDK2 phosphoryl hóa protein

ức chế khối u là pRb Ở trạng thái phosphoryl hóa, protein pRb giải phóng nhân tố hoạt hóa phiên mã E2F Nhân tố E2F được giải phóng sẽ hoạt hóa phiên mã các gene cần thiết cho tế bào bước vào pha S và tiến hành phân bào Khi protein pRb gắn với nhân

tố E2F thì hoạt động phân bào không diễn ra [24]

-9-

Hình 1.6 Vai trò của protein E7 [7]

Cơ chế kiểm soát sự phân bào bị phá vỡ trong những tế bào nhiễm HPV type nguy cơ cao Lúc này, protein E7 của virus được biểu hiện vượt mức và gắn vào pRb đang ở trạng thái hoạt động Tương tác này không cho protein pRb gắn với nhân tố E2F Kết quả là những tế bào nhiễm virus sẽ không kiểm soát được sự phân bào và trở nên bất tử Ngoài ra, một số nghiên cứu cho thấy protein E7 còn có vai trò tăng cường quá trình phân hủy protein pRb thông qua con đường ubiquitin-proteasome [10], [24]

Như vậy, protein E7 biểu hiện sớm trong quá trình xâm nhiễm của virus HPV nguy cơ cao và biểu hiện vượt mức khi virus gắn xen bộ gene của mình vào bộ gene của tế bào chủ Sự tăng biểu hiện của protein E7 là điểm khác biệt quan trọng giúp phân biệt trường hợp nhiễm type nguy cơ cao với nhiễm type nguy cơ thấp [17] Mặt

-10-

khác, sự tăng biểu hiện của protein E7 tương ứng với giai đoạn tế bào nhiễm virus bắt đầu chuyển dạng và tăng sinh vô hạn trong khi đó ở các trường hợp tổn thương lành tính thì không có sự tăng biểu hiện protein E7 Một số nghiên cứu trên thế giới đã chứng minh protein E7 của các type nguy cơ cao như HPV-16, -18 và -45 biểu hiện mạnh trong các mẫu sinh thiết của bệnh nhân UTCTC ở giai đoạn ung thư xâm lấn [9]

Do đó, sự biểu hiện vượt mức của protein E7 type nguy cơ cao, đặc biệt là của HPV-16 hứa hẹn là một chỉ thị phân tử đặc hiệu cho UTCTC

1.3 KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG

1.3.1 Cấu trúc của kháng thể

Kháng thể (Ig) là một loại protein có trong huyết thanh của động vật, có khả năng tương tác đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó Các kháng thể hiện diện trên màng tế bào B và do tương bào tiết ra Những kháng thể trên màng tế bào chịu trách nhiệm cho tính chuyên biệt kháng nguyên của tế bào B Trong khi đó, các kháng thể do tương bào sản xuất tuần hoàn trong máu, chúng đóng vai trò như là một yếu tố tham gia vào quá trình miễn dịch dịch thể Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau gồm một hay nhiều đơn vị hợp thành Mỗi đơn vị chứa 4 chuỗi polypetide, gồm 2 chuỗi nhẹ (L) và 2 chuỗi nặng (H) liên kết nhau bởi cầu nối disulfide (S-S) tạo

thành 1 phân tử có dạng chữ Y [21], [23]

Chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử khoảng 25 kDa Mỗi phân tử Ig có hai chuỗi nhẹ lambda (λ) hoặc hai chuỗi nhẹ kappa (κ) Ở đầu amin (-NH2) trên mỗi chuỗi nhẹ có vùng trình tự amino acid thay đổi gọi là vùng biến đổi (VL) và ở phía đầu cacboxyl (-COOH) có vùng trình tự amino acid không biến đổi gọi là vùng cố định (CL)[21]

-11-

Hình 1.7 Cấu trúc cơ bản của kháng thể [34]

Chuỗi nặng của Ig có trọng lượng phân tử khoảng 50 kDa Có 5 loại chuỗi nặng

là γ, μ, α, δ và ε tương ứng với 5 lớp kháng thể là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE Mỗi chuỗi nặng sẽ có 4 vùng trình tự amino acid gồm 1 vùng biến đổi (VH) ở đầu amin, 3 vùng cố định (CH1, CH2, CH3) ở đầu cacboxyl Vùng nằm giữa CH1 và CH2 của chuỗi

nặng tạo thành khớp nối [21]

1.3.2 Sự tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể

Epitope

Epitope còn được gọi là quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) Đây

là cấu trúc nằm trên phân tử kháng nguyên và các phân tử kháng thể có thể nhận diện được Một phân tử kháng nguyên có thể mang nhiều epitope Các epitope được chia thành các loại sau [21], [23] :

 Epitope dạng thẳng: gồm 6-8 amino acid liên tục hoặc có thể là một đoạn của chuỗi polypetide Epitope thẳng không mất đi khi kháng nguyên bị biến tính

đi khi kháng nguyên bị biến tính

 Neoepitope: là epitope chỉ thể hiện khi kháng nguyên bị phân hủy Kháng thể nhận diện loại epitope này có thể không nhận diện kháng nguyên tự nhiên

Paratope

Paratope là vị trí liên kết với kháng nguyên, được tạo thành do sự kết hợp vùng biến đổi của chuỗi nặng (VH) và chuỗi nhẹ (VL) nằm kề nhau Sự đa dạng về trình tự amino acid của vùng VL và VHchỉ tập trung ở những vùng được gọi là vùng siêu biến đổi CDRs (Complementarity determing regions) Mỗi chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có ba vùng CDR (CDR1, CDR2, CDR3) nằm kề nhau và quyết định tính chuyên biệt cao

của tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể [21], [23]

Lực tương tác giữa kháng nguyên – kháng thể

Tương tác giữa kháng thể với kháng nguyên là tương tác giữa epitope và paratope Tương tác này thuộc loại tương tác không cộng hóa trị thuận nghịch, được hình thành bởi những lực liên kết sau:

 Liên kết tĩnh điện là liên kết giữa các amino acid mang điện tích trái dấu trong chuỗi bên của kháng thể và kháng nguyên

 Liên kết hydrogen là liên kết hình thành giữa nguyên tử H với những nguyên tử giàu điện tích âm như N và O

 Liên kết van der Walls là liên kết giữa các lưỡng cực trong các nguyên tử do sự phân bố bất đối xứng các đám mây electron

-13-

 Liên kết kỵ nước là tương tác hình thành khi hai bề mặt kỵ nước tiến lại gần nhau và loại đi phân tử nước

Mức độ tham gia của các lực này vào lực tương tác tổng hợp của kháng nguyên

và kháng thể tùy thuộc từng loại kháng nguyên và kháng thể Điểm khác biệt quan trọng giữa tương tác kháng thể-kháng nguyên với các tương tác protein-protein khác là trong vùng paratope của kháng thể có nhiều gốc amino acid thơm Những amino acid

này đóng vai trò chính trong các tương tác nói trên [21]

1.3.3 Kháng thể đơn dòng và một số ứng dụng

Trong đáp ứng miễn dịch, nhiều dòng tế bào B được hoạt hóa và tổng hợp nhiều kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau của cùng một kháng nguyên cho trước Tập hợp các kháng thể này được gọi là kháng thể đa dòng Trong khi đó, kháng thể đơn dòng (KTĐD) là kháng thể chỉ nhận diện một epitope duy nhất trên một kháng nguyên

Do đó, tất cả các KTĐD cùng một dòng thì giống hệt nhau và được sản xuất bởi cùng một dòng tương bào của tế bào B [23]

KTĐD có nhiều ưu điểm như: có tính đặc hiệu cao, cho tỉ lệ phản ứng chéo với các protein khác thấp do chỉ nhận diện một epitope duy nhất của kháng nguyên; được sản xuất vô hạn và ổn định; KTĐD có tính đồng nhất cao vì có cùng một ái lực với kháng nguyên mục tiêu Tuy nhiên, việc sản xuất KTĐD phức tạp và đòi hỏi sự đầu tư

về chi phí nhiều hơn so với sản xuất kháng thể đa dòng

Ngày nay, KTĐD được ứng dụng rộng rãi trong sinh học và y học Chúng được

sử dụng như là một công cụ để chẩn đoán, đồng thời cũng được dùng trong điều trị lâm sàng [23]

-14-

Chẩn đoán

Một số loại ung thư thường biểu hiện các kháng nguyên đặc trưng của chúng, các kháng nguyên đó được xem như là các dấu ấn (marker) để chẩn đoán và theo dõi tình trạng bệnh Sử dụng phương pháp flow cytometry với các KTĐD đặc hiệu cho các marker chẩn đoán các bệnh bạch cầu như: bệnh lympho không Hodgkin (biểu hiện kháng nguyên CD20), bệnh lympho nang (CD10)

Ngoài ra, KTĐD cũng được dùng trong các phương pháp phát hiện và theo dõi

sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh Bằng phương pháp ELISPOT, sử dụng các kháng thể kháng interferon-γ (một loại cytokine do tế bào T tiết ra khi tham gia đáp ứng miễn dịch), người ta có thể theo dõi đáp ứng miễn dịch của tế bào T đối với sự nhiễm virus sởi Ngoài ra, KTĐD được dùng xác định các thuốc cấm sử dụng trong máu [23]

Điều trị

KTĐD là một trong những dược phẩm được phát triển nhanh nhất và đem lại nhiều lợi nhuận Hiện nay có hơn 200 KTĐD đang trong giai đoạn nghiên cứu lâm sàng Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc điều trị các bệnh như ung thư, bệnh nhiễm, bệnh tự miễn Môt số KTĐD thương mại tiêu biểu như: Herceptin (điều trị bệnh ung thư vú ), Erbitux(điều trị ung thư ruột), Rituxan, Zevalin, Bexxar (điều trị bệnh lympho không Hodgkin)

Vì những khả năng ứng dụng to lớn kể trên mà ngày nay KTĐD đang là một lĩnh vực nghiên cứu đầy tiềm năng, cả về mặt khoa học lẫn thương mại

1.4 SẢN XUẤT KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG BẰNG KỸ THUẬT TẠO TẾ BÀO LAI (HYBRIDOMA)

Vào năm 1975, hai nhà khoa học Cesar Milstein và Georges Kohler đã đề xuất

kỹ thuật tạo KTĐD bằng tế bào lai (hybridoma) Mỗi tế bào lympho B chỉ tạo một kháng thể chuyên biệt Tuy nhiên, những tế bào lympho B bình thường không có khả năng tăng sinh vô hạn, do đó cần phải làm cho các tế bào lympho B có khả năng phân

-15-

chia liên tục Điều này có thể làm được bằng cách dung hợp giữa tế bào lympho B sản xuất kháng thể với tế bào u tủy (myeloma) Tế bào u tủy là tế bào có khả năng phân

chia vô hạn trong điều kiện nuôi cấy in vitro nhưng không tạo được kháng thể Việc kết

hợp hai loại tế bào này với nhau sẽ tạo ra được tế bào lai vừa có đặc tính phân chia vô hạn của tế bào u tủy và sản xuất kháng thể chuyên biệt mong muốn của tế bào lympho

B Tế bào lai sau đó sẽ được phân lập và tạo dòng, chính dòng tế bào này sẽ sản xuất ra KTĐD [18]

1.4.1 Các bước chính trong sản xuất KTĐD

Để tạo được một loại KTĐD đúng với nhu cầu, chúng ta cần phải quan tâm đến nhiều yếu tố, kể từ quá trình gây đáp ứng miễn dịch, nuôi cấy, sàng lọc tế bào lai cho đến bước sản xuất và tinh sạch kháng thể

1.4.1.1 Gây đáp ứng miễn dịch

Lựa chọn nguồn kháng nguyên

Bước đầu tiên trong việc tạo một kháng thể bất kỳ là phải chọn được kháng nguyên thích hợp, việc lựa chọn và chất lượng cùa kháng nguyên quyết định sự tạo thành công một kháng thể Trước khi phát triển bất kỳ một kháng thể nào, cần xác định

rõ mục tiêu sử dụng kháng thể đó Việc lựa chọn kháng nguyên phù hợp sẽ làm tăng khả năng sản xuất ra kháng thể với các đặc tính mong muốn Cụ thể, các kháng thể sử dụng trong kỹ thuật Western blot phải có khả năng phát hiện các protein đã biến tính thành dạng thẳng Tuy nhiên, trong một số trưởng hợp như trong kỹ thuật flow cytometry, ELISA, , kháng thể phải nhận diện được với protein ở dạng cấu hình tự nhiên Đặc biệt, khả năng phát hiện protein với cấu hình tự nhiên rất quan trọng khi sử dụng kháng thể trong các liệu pháp điều trị [18]

-16-

Ngoài ra, cần phải đặc biệt chú ý đến độ tinh sạch của kháng nguyên Điều này

để tránh trường hợp các thành phần tạp nhiễm có tính sinh miễn dịch mạnh hơn kháng nguyên mục tiêu làm giảm hiệu quả của quá trình gây đáp ứng miễn dịch [2]

Đường tiêm kháng nguyên vào cơ thể

Nhiều phương pháp tiêm kháng nguyên vào cơ thể động vật được sử dụng như: tiêm dưới da, vào khoang bụng, bắp thịt, hay tĩnh mạch Đường tiêm kháng nguyên vào

cơ thể ảnh hưởng đến cường độ và dạng đáp ứng miễn dịch hình thành Kháng nguyên tiêm dưới da sẽ kích thích một đáp ứng miễn dịch mạnh nhất vì kháng nguyên được bắt giữ bởi các tế bào Langerhan và được trình diện hiệu quả trong các hạch lympho Do

đó, phương pháp tiêm kháng nguyên này được sử dụng chủ yếu trong trường hợp cần thu nhận kháng thể hoặc các tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên [21]

Tá chất

Việc sừ dụng các tá chất đi kèm với kháng nguyên sẽ làm tăng đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên Tá chất có vai trò kéo dài thời gian hiện diện của kháng nguyên đối với hệ thống miễn dịch, huy động các tế bào miễn dịch đến chỗ kháng nguyên, đồng thời kích thích sự tăng sinh của các tế bào lympho Ngày nay, có rất nhiều loại tá chất được sử dụng, nhưng phổ biến nhất là hệ tá chất Freund Tá chất

-17-

Freund gồm Complete Freund’s Adjuvant (CFA) và incomplete Freund’s Aduvant

(IFA) CFA có thành phần là vi khuẩn Mycobaterium bị bất hoạt bởi nhiệt tạo đáp ứng

viêm và hoạt hóa tế bào T tiết các lymphokine cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa

của tế bào B Nhìn chung IFA giống CFA nhưng không có Mycobaterium Việc sử

dụng CFA có thể gây ra những hiệu ứng phụ không mong muốn; do đó, một số loại tá chất mới đã được phát triển có ít độc tính hơn như Ribi hoặc Timax Gần đây, các CpG oligonucleotide từ vi khuẩn cũng được dùng để tăng cường đáp ứng miễn dịch [18]

Đối tượng gây đáp ứng miễn dịch

Kỹ thuật tạo tế bào lai đã được thực hiện thành công với tế bào lympho thu nhận

từ chuột nhắt, chuột rat, hamster, và thỏ; Trong đó, kết quả đáp ứng miễn dich tốt nhất khi thực hiện trên chuột nhắt [2], [18] Ngoài ra, chuột nhắt còn được sử dụng phổ biến vì: dễ thao tác thí nghiệm; cho đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên lạ, nhiều dòng chuột đồng huyết, dòng tế bào u tủy của chuột và các kháng thể đặc hiệu cho các immuglobulin của chuột đã được thương mại hóa; lượng kháng nguyên cần cho đáp ứng miễn dịch thấp; tinh sạch KTĐD tạo từ chuột dễ hơn những động vật khác

Dòng chuột được sử dụng tạo KTĐD là chuột BALB/c vì dòng chuột này có khả năng hình thành u tương bào (plasmacytoma) tốt khi tiêm kháng nguyên với dầu khoáng, đây là một đặc tính quan trọng trong quá trình hình thành kháng thể Tế bào lympho B của chuột BALB/c dễ dàng được hoạt hóa Hơn nữa, nhiều dòng tế bào u tủy

có nguồn gốc từ dòng chuột này cho hiệu quả dung hợp tốt như X63-Ag8.653, Sp2/O, NSO/1, P3-X63 [16], [25]

Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch

Sau mỗi lần tiếp xúc với kháng nguyên in vivo, lượng tế bào lympho B được

hoạt hóa ngày càng tăng, lượng kháng thể IgG sẽ được tạo ra nhiều hơn so với IgM trong giai đoạn đáp ứng thứ phát với kháng nguyên; và việc lặp lại sự tiếp xúc với

-18-

kháng nguyên sẽ làm tăng cường đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Do đó, nếu tạo được đáp

ứng in vivo mạnh sẽ làm gia tăng cơ hội thu nhận được dòng tế bào lai biểu hiện kháng

thể với chức năng và ái lực mong muốn [18] Một ví dụ về biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch ở chuột được trình bày trong bảng 1.1 Quá trình này được xây dựng trên cơ

sở động học của quá trình hình thành đáp ứng miễn dịch của chuột (hình 1.8)

Ban đầu, kháng nguyên được nhũ tương hóa với CFA rồi đem tiêm cho chuột (mũi mẫn cảm) CFA sẽ gây ra đáp ứng viêm, do đó huy động các tế bào lympho đến chỗ kháng nguyên Trong khoảng 14 ngày, đáp ứng nguyên phát tạo ra chủ yếu là kháng thể IgM có ái lực thấp

Khi tiêm mũi tăng cường lần một (ngày thứ 14), đáp ứng thứ phát với kháng nguyên sẽ tạo ra kháng thể nhanh với số lượng lớn Ngoài ra, đáp ứng thứ phát còn được đặc trưng bởi quá trình chuyển lớp kháng thể từ IgM có ái lực thấp với kháng nguyên sang IgG ái lực cao Trong quá trình này, một số tế bào lympho B được hoạt hóa bởi kháng nguyên sẽ biệt hóa tạo thành tế bào lympho B nhớ, nhờ đó khi có sự kích thích lặp lại của kháng nguyên trong các mũi tăng cường tiếp theo thì kháng thể được tạo ra nhanh chóng Một điều cần chú ý là, trong các mũi tăng cường, IFA được dùng thay thế cho CFA bởi vì CFA có thể làm hình thành các u hạt khi được tiêm lặp lại vào cơ thể chuột [18], [23]

-19-

Bảng 1.1 Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch chuột [18]

36 Thu nhận huyết thanh và kiểm tra đáp ứng

42 Giai đoạn nghỉ trước khi tiêm

mũi tăng cường cuối cùng hoặc tiêm mũi tăng cường 3

-20-

Hình 1.8 Động học của quá trình hình thành đáp ứng miễn dịch [11]

Trước khi tiến hành dung hợp 3-4 ngày, chuột được tiêm một mũi tăng cường cuối cùng vào tĩnh mạch nhằm thu nhận lượng tối đa các tế bào B đặc hiệu với kháng nguyên [18]

1.4.1.2 Dung hợp tế bào lách và tế bào u tủy

Dòng tế bào u tủy

Dung hợp giữa các tế bào có nguồn gốc càng giống nhau thì tế bào lai tạo ra ổn định về mặt di truyền [16] Do đó, các dòng tế bào u tủy sử dụng được thu nhận từ dòng chuột BALB/c mang khối u của tế bào lympho Để có thể ứng dụng trong sản xuất KTĐD, dòng tế bào u tủy này phải có những đặc điểm sau: không sản sinh chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể [16]; tế bào u tủy đang trong giai đoạn tăng trưởng pha log và có tỉ lệ tế bào sống trong môi trường nuôi cấy hơn 95% [2], mang đột biến mất chức năng gene hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase

(PEG) là tác nhân dung hợp tế bào được sử dụng phổ biến vì đạt hiệu quả dung hợp

cao và có thể dung hợp cả những tế bào khác loài PEG có khả năng thúc đẩy quá trình tái sắp xếp các thành phần của màng tế bào giúp cho tế bào tiến lại gần nhau và dung hợp hai màng sinh chất thành một màng liên tục Kết quả là hai tế bào gần nhau hợp nhất thành một tế bào có kiểu nhân dị hợp (heterokaryon) với số lượng NST gấp đôi [31]

Bên cạnh đó việc sử dụng các tế bào nuôi (feeder cell) nuôi cấy cùng với tế bào lai làm tăng hiệu suất của quá trình dung hợp Tế bào nuôi có thể là tế bào ở màng bụng, chủ yếu là đại thực bào cung cấp các nhân tố tăng trưởng cho các tế bào lai [18]

Môi trường chọn lọc HAT (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine)

Hỗn hợp tế bào sau khi dung hợp được nuôi cấy trong môi trường chọn lọc HAT Trong môi trường HAT, aminopterin ức chế quá trình tổng hợp base purine theo con

đường tổng hợp mới (de novo), các tế bào muốn tăng trưởng trên môi trường này phải

tổng hợp base purine theo con đường Salvage Tế bào u tủy mang đột biến gene HGPRT− nên không tổng hợp được enzyme cần thiết để thực hiện con đường Salvage

sẽ chết Tế bào lai và tế bào lách sử dụng hypoxanthine và thimidine trong môi trường chọn lọc để tổng hợp base purine theo con đường Salvage Tuy nhiên, tế bào lách là tế bào tận cùng của quá trình biệt hóa nên không thể tiếp tục tăng trưởng trong điều kiện

nuôi cấy in vitro Như vậy, chỉ có tế bào lai mới có khả năng sống và tăng trưởng trong

môi trường chọn lọc [6]

-22-

1.4.1.3 Sàng lọc dòng tế bào lai

Việc dung hợp tế bào cũng sẽ tạo ra các tế bào lai không sản xuất kháng thể hoặc tạo ra kháng thể không mong muốn; trong khi các tế bào lai sản xuất kháng thể mục tiêu với các đặc tính mong muốn chỉ chiếm chưa tới 5% tổng số giếng có sự xuất hiện của tế bào lai Vì vậy, sàng lọc dòng tế bào lai là một công đoạn quan trọng để tìm

ra các dòng tế bào sản xuất ra kháng thể có ái lực cao và đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu Nhiều phương pháp sàng lọc giúp phát hiện những giếng có xuất hiện các dòng tế bào lai này như: ELISA, Western blot, flow cytometry, tùy theo mục tiêu lựa chọn kháng thể mà sử dụng phương pháp phù hợp Một số kháng thể được sàng lọc bằng ELISA đôi khi không dùng được trong phương pháp khác [6], [18]

1.4.1.4 Phân lập tạo dòng đơn tế bào lai

Sau khi sàng lọc, khi thấy dòng tế bào lai nào cho tín hiệu dương tính thì cần phân lập ngay để thu nhận được một tế bào lai mà chỉ tiết ra một loại kháng thể duy nhất đặc hiệu cho kháng nguyên [2]

Phương pháp pha loãng tới hạn thường dùng để phân lập dòng tế bào lai vì đơn giản, dễ thực hiện Theo phương pháp này, người ta tiến hành pha loãng tế bào và cho vào đĩa nuôi cấy tế bào ở 3 mật độ là 100 tế bào/giếng, 10 tế bào/giếng và 1 tế bào/giếng Khi tế bào phát triển khoảng 70 – 80% giếng thì thu nhận dòng tế bào Những dòng tế bào nào từ giếng có mật độ ban đầu là 1 tế bào/giếng cho kết dương tính khi kiểm tra sẽ được ưu tiên lựa chọn Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế như tốn nhiều thời gian và hóa chất cho việc nuôi cấy tế bào [18]

1.4.1.5 Sản xuất KTĐD từ dòng tế bào lai đã phân lập

Có hai phương pháp chủ yếu sản xuất KTĐD được sử dụng với những ưu, nhược điểm được trình bày trong bảng 2.2

-23-

Phương pháp in vitro là phương pháp dựa vào khả năng sản xuất KTĐD của tế

bào lai trong môi trường nuôi cấy Phương pháp này sử dụng các hệ thống nuôi cấy tế bào như các bình nuôi cấy và bioreactor cho phép tế bào phát triển và đạt mật độ cao Môi trường nuôi cấy phải có nồng độ huyết thanh thấp (2-5%) vì các thành phần protein trong huyết thanh làm ảnh hưởng đến hiệu quả tinh sạch KTĐD và khả năng sản xuất kháng thể của tế bào lai [18]

Phương pháp in vivo thực hiện bằng cách cấy ghép tế bào lai vào màng bụng

của chuột sống và thu nhận dịch báng có chứa kháng thể từ khối u Phương pháp này

bị hạn chế bởi những quy định về việc sử dụng động vật cho mục đích thí nghiệm

Bảng 1.2 So sánh phương pháp sản xuất KTĐD in vitro và in vivo [18]

Chi phí đầu tư Cao với quy mô sản xuất nhỏ Thấp

Chất lượng của KTĐD Nhiễm các immunoglobulin

(Ig), protein huyết thanh trong huyết thanh nuôi cấy tế bào lai

Nhiễm các Ig, protein huyết thanh, cytokine trong dịch báng của chuột

1.4.1.6 Thu nhận KTĐD

KTĐD từ dịch nổi của môi trường nuôi cấy hoặc dịch báng của chuột được tinh sạch bằng sắc kí ái lực, kết tủa với ammonium sulfate, sắc kí trao đổi ion Trong đó phương pháp sắc ký ái lực với protein A và protein G cho độ tinh sạch cao (95%) Các kháng thể tinh sạch bằng protein A và protein G có thể dùng cho nhiều phương pháp

-24-

thử nghiệm khác nhau, thậm chí lâm sàng và cận lâm sàng Protein A và G là thành

phần cấu tạo của vách tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus có ái lực

đặc hiệu với vùng Fc của phân tử IgG [18]

1.4.2 Một số công trình trong và ngoài nước liên quan đến việc tạo KT

ĐD kháng protein E7 của Human papillomavirus

Ngoài nước

Theo Jeon và cộng sự (2007), nhóm nghiên cứu tạo KTĐD kháng protein E7 HPV-16 trên chuột từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp Kết quả cho thấy KTĐD 130-9-7 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV-16 biểu hiện trong tế bào nuôi cấy được chuyển gene HPV-16 và các mẫu phết tế bào cổ tử cung của bệnh nhân nhiễm HPV-16 Nhóm nghiên cứu đã chứng minh KTĐD này ứng dụng trong phương pháp nhuộm miễn dịch (immunostaining) cho phép phân biệt các trường hợp nhiễm HPV type nguy cơ cao với trường hợp loạn sản mức độ nhẹ ở biểu mô cổ tử cung [22]

Ngoài ra, còn có các công trình của các nhóm nghiên cứu tạo KTĐD kháng protein E7 của HPV nguy cơ cao khác như:

Selvey và cộng sự (1992) đã sản xuất được KTĐD 7E10 kháng protein E7 HPV-18 và được ứng dụng trong thử nghiệm ELISA để phát hiện protein E7 của HPV type 18 trong những mẫu bệnh phẩm UTCTC [27]

Fiedler và cộng sự (2005) đã tạo kháng thể đa dòng kháng protein E7 của

HPV-18 và -45 trên dê từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp Kháng thể đa dòng tạo được phản ứng đặc hiệu với protein E7 trong tế bào chuyển gene, tế bào HeLa biểu hiện tự nhiên protein E7 và các mẫu sinh thiết của bệnh nhân UTCTC Đồng thời, các kháng thể đa dòng cho phép định lượng protein E7 trong tế bào ung thư [13]

-25-

Trong nước

Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp

Hồ Chí Minh đã tạo thành công 2 KTĐD 4H5 và 1D5 kháng protein E7 HPV-16 từ nguồn protein tái tổ hợp (2010) [33]

- Tế bào u tủy P3X63Ag8.653 (ATCC) không sản sinh các chuỗi immunoglobin

và mất khả năng tổng hợp enzyme HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase)

- Tế bào ung thư C33A (ATCC), là dòng tế bào ung thư cổ tử cung nhưng không có bản sao của bộ gene HPV-16

- Tế bào CHO-K1 thu nhận từ phòng thí nghiệm Tế Bào Gốc trường Đại học Khoa học tự nhiên

Tất cả các dòng tế bào trên hiện đang được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - bộ môn Di truyền – khoa Sinh học – trường Đại học Khoa

học tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh

2.1.2 Kháng nguyên

Kháng nguyên sử dụng là protein E7 HPV-16 tái tổ hợp được biểu hiện và tinh

sạch từ chủng vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử

thuộc bộ môn Di truyền - khoa Sinh học - Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc

gia TP Hồ Chí Minh Protein E7 HPV-16 đã được xác nhận chính là E7 HPV-16 trong các thí nghiệm trước đây của phòng (kết quả không trình bày)

2.1.3 Chuột dùng gây đáp ứng miễn dịch

Chuột BALB/c (Charles River Laboratories France): chuột cái 6-8 tuần tuổi, được nuôi trong điều kiện vô trùng

-27-

2.1.4 Hóa chất – Môi trường:

2.1.4.1 Hóa chất

 Dùng để gây đáp ứng miễn dịch trên động vật và thu nhận huyết thanh

- Tá chất Freund complete adjuvant, Freund incomplete adjuvant (Sigma)

- Dung dịch PBS (-) 1X, KH2PO4 (1,47 mM), Na2HPO4.2H2O (10 mM), KCl (2,7 mM), NaCl (137 mM), dung dịch PBS – BSA 1% (PBS 1X + bovine serum albumin (BSA) (Sigma) 1%), dung dịch PBS – Tween 0,05 % (PBS 1X + Tween 20 (Merck) 0,05% )

 Dùng trong ELISA kiểm tra đáp ứng miễn dịch của động vật

- Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu alkaline phosphatase (Southern Biotech)

- Cơ chất của enzyme alkaline phosphatase, với thành phần như sau:

+ Dung dịch pha cơ chất pH 9,8: Diethanolamine (Merck) 48,5 ml, MgCl2

4M 62,5 μl, ddH2O 500 ml

+ Cơ chất (Phosphatase substrate) (Sigma): cho một viên cơ chất vào 5 ml dung dịch pha cơ chất Lắc đến tan Bảo quản ở -20C, tránh sáng

 Dùng cho dung hợp tạo tế bào hydridoma:

PEG 1500 (Sigma), dung dịch NH4Cl 0,17 M (Merck), HAT 50X (Sigma), HT 50X (Sigma), Trypan blue (Sigma)

 Hóa chất dùng trong tinh sạch kháng thể đơn dòng

Bộ kit xác định isotype Isotrip (BD), cột Sepharose gắn protein G (GE Health Care), cột Sepharose gắn protein A (GE Health Care), dung dịch gắn cột (Tris-HCl 0,1 M; pH 7,5; NaCl 0,15 M), dung dịch dung giải (glycine 0,1 M; pH 2,8), dung dịch

trung hòa (Tris-HCl 1 M; pH 9,0)

-28-

 Thang protein

Hình 2.1 Thang phân tử protein (Fermentas)

 Dùng cho điện di protein

- Gel phân tách (separating gel): acrylamide 12 %: 3,3 ml dH2O; 4 ml acrylamide 30 %; 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8); 0,1 ml SDS 10 %; 0,1 ml APS

- Dung dịch giải nhuộm (giữ ở nhiệt độ phòng): 100 ml glacial acetic acid,

100 ml ethanol tuyệt đối, 800 ml dH2O