Để tạo được một loại KTĐD đúng với nhu cầu, chúng ta cần phải quan tâm đến nhiều yếu tố, kể từ quá trình gây đáp ứng miễn dịch, nuôi cấy, sàng lọc tế bào lai cho đến bước sản xuất và tinh sạch kháng thể.
1.4.1.1. Gây đáp ứng miễn dịch
Lựa chọn nguồn kháng nguyên
Bước đầu tiên trong việc tạo một kháng thể bất kỳ là phải chọn được kháng nguyên thích hợp, việc lựa chọn và chất lượng cùa kháng nguyên quyết định sự tạo thành công một kháng thể. Trước khi phát triển bất kỳ một kháng thể nào, cần xác định rõ mục tiêu sử dụng kháng thể đó. Việc lựa chọn kháng nguyên phù hợp sẽ làm tăng khả năng sản xuất ra kháng thể với các đặc tính mong muốn. Cụ thể, các kháng thể sử dụng trong kỹ thuật Western blot phải có khả năng phát hiện các protein đã biến tính thành dạng thẳng. Tuy nhiên, trong một số trưởng hợp như trong kỹ thuật flow cytometry, ELISA,.., kháng thể phải nhận diện được với protein ở dạng cấu hình tự nhiên. Đặc biệt, khả năng phát hiện protein với cấu hình tự nhiên rất quan trọng khi sử dụng kháng thể trong các liệu pháp điều trị [18].
-16-
Ngoài ra, cần phải đặc biệt chú ý đến độ tinh sạch của kháng nguyên. Điều này để tránh trường hợp các thành phần tạp nhiễm có tính sinh miễn dịch mạnh hơn kháng nguyên mục tiêu làm giảm hiệu quả của quá trình gây đáp ứng miễn dịch [2].
Lượng kháng nguyên sử dụng
Liều lượng kháng nguyên tiêm vào cơ thể động vật ảnh hưởng đến khả năng tạo kháng thể. Khi đưa liều quá ít sẽ không đủ kích thích đáp ứng miễn dịch còn quá nhiều có thể dẫn đến trạng thái tê liệt miễn dịch. Khi đưa lượng nhỏ kháng nguyên vào cơ thể động vật sẽ kích thích mạnh tế bào lympho T tạo trí nhớ miễn dịch và dẫn đến đáp ứng miễn dịch tế bào nhiều hơn là đáp ứng miễn dịch thể. Nhưng nếu kháng nguyên được tiêm nhắc lại thì đáp ứng miễn dịch dịch thể sẽ tăng lên, tạo một đáp ứng với nồng độ kháng thể cao và bền vững [21].
Đường tiêm kháng nguyên vào cơ thể
Nhiều phương pháp tiêm kháng nguyên vào cơ thể động vật được sử dụng như: tiêm dưới da, vào khoang bụng, bắp thịt, hay tĩnh mạch. Đường tiêm kháng nguyên vào cơ thể ảnh hưởng đến cường độ và dạng đáp ứng miễn dịch hình thành. Kháng nguyên tiêm dưới da sẽ kích thích một đáp ứng miễn dịch mạnh nhất vì kháng nguyên được bắt giữ bởi các tế bào Langerhan và được trình diện hiệu quả trong các hạch lympho. Do đó, phương pháp tiêm kháng nguyên này được sử dụng chủ yếu trong trường hợp cần thu nhận kháng thể hoặc các tế bào T đặc hiệu với kháng nguyên [21].
Tá chất
Việc sừ dụng các tá chất đi kèm với kháng nguyên sẽ làm tăng đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên. Tá chất có vai trò kéo dài thời gian hiện diện của kháng nguyên đối với hệ thống miễn dịch, huy động các tế bào miễn dịch đến chỗ kháng nguyên, đồng thời kích thích sự tăng sinh của các tế bào lympho. Ngày nay, có rất nhiều loại tá chất được sử dụng, nhưng phổ biến nhất là hệ tá chất Freund. Tá chất
-17-
Freund gồm Complete Freund’s Adjuvant (CFA) và incomplete Freund’s Aduvant (IFA). CFA có thành phần là vi khuẩn Mycobaterium bị bất hoạt bởi nhiệt tạo đáp ứng viêm và hoạt hóa tế bào T tiết các lymphokine cần thiết cho sự tăng sinh và biệt hóa của tế bào B. Nhìn chung IFA giống CFA nhưng không có Mycobaterium. Việc sử dụng CFA có thể gây ra những hiệu ứng phụ không mong muốn; do đó, một số loại tá chất mới đã được phát triển có ít độc tính hơn như Ribi hoặc Timax. Gần đây, các CpG oligonucleotide từ vi khuẩn cũng được dùng để tăng cường đáp ứng miễn dịch [18].
Đối tượng gây đáp ứng miễn dịch
Kỹ thuật tạo tế bào lai đã được thực hiện thành công với tế bào lympho thu nhận từ chuột nhắt, chuột rat, hamster, và thỏ; Trong đó, kết quả đáp ứng miễn dich tốt nhất khi thực hiện trên chuột nhắt [2], [18]. Ngoài ra, chuột nhắt còn được sử dụng phổ biến vì: dễ thao tác thí nghiệm; cho đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên lạ, nhiều dòng chuột đồng huyết, dòng tế bào u tủy của chuột và các kháng thể đặc hiệu cho các immuglobulin của chuột đã được thương mại hóa; lượng kháng nguyên cần cho đáp ứng miễn dịch thấp; tinh sạch KTĐD tạo từ chuột dễ hơn những động vật khác.
Dòng chuột được sử dụng tạo KTĐD là chuột BALB/c vì dòng chuột này có khả năng hình thành u tương bào (plasmacytoma) tốt khi tiêm kháng nguyên với dầu khoáng, đây là một đặc tính quan trọng trong quá trình hình thành kháng thể. Tế bào lympho B của chuột BALB/c dễ dàng được hoạt hóa. Hơn nữa, nhiều dòng tế bào u tủy có nguồn gốc từ dòng chuột này cho hiệu quả dung hợp tốt như X63-Ag8.653, Sp2/O, NSO/1, P3-X63 [16], [25].
Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch
Sau mỗi lần tiếp xúc với kháng nguyên in vivo, lượng tế bào lympho B được hoạt hóa ngày càng tăng, lượng kháng thể IgG sẽ được tạo ra nhiều hơn so với IgM trong giai đoạn đáp ứng thứ phát với kháng nguyên; và việc lặp lại sự tiếp xúc với
-18-
kháng nguyên sẽ làm tăng cường đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Do đó, nếu tạo được đáp ứng in vivo mạnh sẽ làm gia tăng cơ hội thu nhận được dòng tế bào lai biểu hiện kháng thể với chức năng và ái lực mong muốn [18]. Một ví dụ về biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch ở chuột được trình bày trong bảng 1.1. Quá trình này được xây dựng trên cơ sở động học của quá trình hình thành đáp ứng miễn dịch của chuột (hình 1.8).
Ban đầu, kháng nguyên được nhũ tương hóa với CFA rồi đem tiêm cho chuột (mũi mẫn cảm). CFA sẽ gây ra đáp ứng viêm, do đó huy động các tế bào lympho đến chỗ kháng nguyên. Trong khoảng 14 ngày, đáp ứng nguyên phát tạo ra chủ yếu là kháng thể IgM có ái lực thấp.
Khi tiêm mũi tăng cường lần một (ngày thứ 14), đáp ứng thứ phát với kháng nguyên sẽ tạo ra kháng thể nhanh với số lượng lớn. Ngoài ra, đáp ứng thứ phát còn được đặc trưng bởi quá trình chuyển lớp kháng thể từ IgM có ái lực thấp với kháng nguyên sang IgG ái lực cao. Trong quá trình này, một số tế bào lympho B được hoạt hóa bởi kháng nguyên sẽ biệt hóa tạo thành tế bào lympho B nhớ, nhờ đó khi có sự kích thích lặp lại của kháng nguyên trong các mũi tăng cường tiếp theo thì kháng thể được tạo ra nhanh chóng. Một điều cần chú ý là, trong các mũi tăng cường, IFA được dùng thay thế cho CFA bởi vì CFA có thể làm hình thành các u hạt khi được tiêm lặp lại vào cơ thể chuột. [18], [23].
-19-
Bảng 1.1. Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch chuột [18]
Ngày thứ Thao tác Tá chất Vị trí tiêm
0 Mẫn cảm CFA Dưới da
14 Tăng cường 1 IFA Dưới da
28 Tăng cường 2 IFA Dưới da
36 Thu nhận huyết thanh và kiểm tra đáp ứng 42 Giai đoạn nghỉ trước khi tiêm
mũi tăng cường cuối cùng hoặc tiêm mũi tăng cường 3
IFA Dưới da
52 Tiêm mũi tăng cường trước dung hợp
Không sử dụng
tá chất Tĩnh mạch
55 Thu nhận tế bào lách
Từ 8 đến 10 ngày sau khi gây đáp ứng miễn dịch tăng cường lần thứ hai, huyết thanh của động vật được thu nhận để xác định hiệu giá. Hiệu giá của huyết thanh là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng lớn nhất mà ở đó có thể nhận biết được tương tác của kháng thể với kháng nguyên. Nhiều phương pháp sàng lọc khác nhau như ELISA, Western blot, flow cytometry, kết tủa miễn dịch (immunoprecipitation) được sử dụng tùy thuộc vào đặc tính của kháng nguyên và KTĐD cần thu nhận. Nếu huyết thanh có hiệu giá lớn hơn 1:1000 thì được xem là đáp ứng tốt và có thể tiến hành dung hợp; còn trong trường hợp hiệu giá huyết thanh thấp hơn giá trị này thì cần tiếp tục tiến hành gây đáp ứng miễn dịch tăng cường cho chuột.
-20-
Hình 1.8. Động học của quá trình hình thành đáp ứng miễn dịch [11].
Trước khi tiến hành dung hợp 3-4 ngày, chuột được tiêm một mũi tăng cường cuối cùng vào tĩnh mạch nhằm thu nhận lượng tối đa các tế bào B đặc hiệu với kháng nguyên [18].
1.4.1.2. Dung hợp tế bào lách và tế bào u tủy
Dòng tế bào u tủy
Dung hợp giữa các tế bào có nguồn gốc càng giống nhau thì tế bào lai tạo ra ổn định về mặt di truyền [16]. Do đó, các dòng tế bào u tủy sử dụng được thu nhận từ dòng chuột BALB/c mang khối u của tế bào lympho. Để có thể ứng dụng trong sản xuất KTĐD, dòng tế bào u tủy này phải có những đặc điểm sau: không sản sinh chuỗi nặng và chuỗi nhẹ của phân tử kháng thể [16]; tế bào u tủy đang trong giai đoạn tăng trưởng pha log và có tỉ lệ tế bào sống trong môi trường nuôi cấy hơn 95% [2], mang đột biến mất chức năng gene hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase
-21-
(HGPRT−) nên không thể tổng hợp base purine theo con đường Salvage. Đặc tính này tạo thuận lợi cho quá trình chọn lọc tế bào lai [18].
Phương pháp dung hợp
Tế bào lách chuột được dung hợp với tế bào u tủy thành công đầu tiên với phương pháp sử dụng virus Sendai bị bất hoạt bởi tia UV. Hiện tại, polyethylene glycol (PEG) là tác nhân dung hợp tế bào được sử dụng phổ biến vì đạt hiệu quả dung hợp cao và có thể dung hợp cả những tế bào khác loài. PEG có khả năng thúc đẩy quá trình tái sắp xếp các thành phần của màng tế bào giúp cho tế bào tiến lại gần nhau và dung hợp hai màng sinh chất thành một màng liên tục. Kết quả là hai tế bào gần nhau hợp nhất thành một tế bào có kiểu nhân dị hợp (heterokaryon) với số lượng NST gấp đôi [31].
Bên cạnh đó việc sử dụng các tế bào nuôi (feeder cell) nuôi cấy cùng với tế bào lai làm tăng hiệu suất của quá trình dung hợp. Tế bào nuôi có thể là tế bào ở màng bụng, chủ yếu là đại thực bào cung cấp các nhân tố tăng trưởng cho các tế bào lai [18].
Môi trường chọn lọc HAT (Hypoxanthine Aminopterin Thymidine)
Hỗn hợp tế bào sau khi dung hợp được nuôi cấy trong môi trường chọn lọc HAT. Trong môi trường HAT, aminopterin ức chế quá trình tổng hợp base purine theo con đường tổng hợp mới (de novo), các tế bào muốn tăng trưởng trên môi trường này phải tổng hợp base purine theo con đường Salvage. Tế bào u tủy mang đột biến gene HGPRT− nên không tổng hợp được enzyme cần thiết để thực hiện con đường Salvage sẽ chết. Tế bào lai và tế bào lách sử dụng hypoxanthine và thimidine trong môi trường chọn lọc để tổng hợp base purine theo con đường Salvage. Tuy nhiên, tế bào lách là tế bào tận cùng của quá trình biệt hóa nên không thể tiếp tục tăng trưởng trong điều kiện nuôi cấy in vitro. Như vậy, chỉ có tế bào lai mới có khả năng sống và tăng trưởng trong môi trường chọn lọc [6].
-22-
1.4.1.3. Sàng lọc dòng tế bào lai
Việc dung hợp tế bào cũng sẽ tạo ra các tế bào lai không sản xuất kháng thể hoặc tạo ra kháng thể không mong muốn; trong khi các tế bào lai sản xuất kháng thể mục tiêu với các đặc tính mong muốn chỉ chiếm chưa tới 5% tổng số giếng có sự xuất hiện của tế bào lai. Vì vậy, sàng lọc dòng tế bào lai là một công đoạn quan trọng để tìm ra các dòng tế bào sản xuất ra kháng thể có ái lực cao và đặc hiệu với kháng nguyên mục tiêu. Nhiều phương pháp sàng lọc giúp phát hiện những giếng có xuất hiện các dòng tế bào lai này như: ELISA, Western blot, flow cytometry,...tùy theo mục tiêu lựa chọn kháng thể mà sử dụng phương pháp phù hợp. Một số kháng thể được sàng lọc bằng ELISA đôi khi không dùng được trong phương pháp khác [6], [18].
1.4.1.4. Phân lập tạo dòng đơn tế bào lai
Sau khi sàng lọc, khi thấy dòng tế bào lai nào cho tín hiệu dương tính thì cần phân lập ngay để thu nhận được một tế bào lai mà chỉ tiết ra một loại kháng thể duy nhất đặc hiệu cho kháng nguyên [2].
Phương pháp pha loãng tới hạn thường dùng để phân lập dòng tế bào lai vì đơn giản, dễ thực hiện. Theo phương pháp này, người ta tiến hành pha loãng tế bào và cho vào đĩa nuôi cấy tế bào ở 3 mật độ là 100 tế bào/giếng, 10 tế bào/giếng và 1 tế bào/giếng. Khi tế bào phát triển khoảng 70 – 80% giếng thì thu nhận dòng tế bào. Những dòng tế bào nào từ giếng có mật độ ban đầu là 1 tế bào/giếng cho kết dương tính khi kiểm tra sẽ được ưu tiên lựa chọn. Tuy nhiên, phương pháp này có một số hạn chế như tốn nhiều thời gian và hóa chất cho việc nuôi cấy tế bào [18].
1.4.1.5. Sản xuất KTĐD từ dòng tế bào lai đã phân lập
Có hai phương pháp chủ yếu sản xuất KTĐD được sử dụng với những ưu, nhược điểm được trình bày trong bảng 2.2.
-23-
Phương pháp in vitro là phương pháp dựa vào khả năng sản xuất KTĐD của tế bào lai trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp này sử dụng các hệ thống nuôi cấy tế bào như các bình nuôi cấy và bioreactor cho phép tế bào phát triển và đạt mật độ cao. Môi trường nuôi cấy phải có nồng độ huyết thanh thấp (2-5%) vì các thành phần protein trong huyết thanh làm ảnh hưởng đến hiệu quả tinh sạch KTĐD và khả năng sản xuất kháng thể của tế bào lai [18].
Phương pháp in vivo thực hiện bằng cách cấy ghép tế bào lai vào màng bụng của chuột sống và thu nhận dịch báng có chứa kháng thể từ khối u . Phương pháp này bị hạn chế bởi những quy định về việc sử dụng động vật cho mục đích thí nghiệm.
Bảng 1.2 So sánh phương pháp sản xuất KTĐD in vitro và in vivo [18] Các yếu tố Phương pháp in vitro Phương pháp in vivo
Nồng độ kháng thể <0,01 mg/ml 1–10 mg/ml
Chi phí đầu tư Cao với quy mô sản xuất nhỏ Thấp Chất lượng của KTĐD Nhiễm các immunoglobulin
(Ig), protein huyết thanh trong huyết thanh nuôi cấy tế bào lai.
Nhiễm các Ig, protein huyết thanh, cytokine trong dịch báng của chuột
1.4.1.6. Thu nhận KTĐD
KTĐD từ dịch nổi của môi trường nuôi cấy hoặc dịch báng của chuột được tinh sạch bằng sắc kí ái lực, kết tủa với ammonium sulfate, sắc kí trao đổi ion. Trong đó phương pháp sắc ký ái lực với protein A và protein G cho độ tinh sạch cao (95%). Các kháng thể tinh sạch bằng protein A và protein G có thể dùng cho nhiều phương pháp
-24-
thử nghiệm khác nhau, thậm chí lâm sàng và cận lâm sàng. Protein A và G là thành phần cấu tạo của vách tế bào vi khuẩn Staphylococcus aureus, Streptococcus có ái lực đặc hiệu với vùng Fc của phân tử IgG [18].