3.3.2.1. Kết quả Western blot
Nhằm mục đích kiểm tra tính đặc hiệu của 2 KTĐD 2C1 và 6B10 với protein E7 HPV-16 tái tổ hợp, đồng thời kiểm tra khả năng phản ứng chéo của chúng với protein E7 của các type khác, chúng tôi sử dụng phương pháp Western blot, ủ KTĐD 2C1 và 6B10 với protein E7 HPV-16 cùng với các protein E7 của các type 6, 11, 18; so sánh với KTĐD kháng protein E7 HPV-16 thương mại (Santa Cruz).
Hình 3.6. Kết quả Western blot trên KTĐD với các protein E7 HPV-6, E7 HPV-11, E7 HPV-16, E7 HPV-18 tái tổ hợp. (A) Điện di SDS-PAGE các protein tái tổ hợp. Giếng M: thang protein; Giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV-16, E7 HPV-16, E7 HPV-11, E7 HPV-18. (B) KTĐD 2C1. Giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV-16, E7 HPV-6, E7 HPV-11, E7 HPV-18.(C) KTĐD kháng E7 HPV-16 thương mại (Santa Cruz). Giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV-18, E7 HPV-11, E7 HPV-6, E7 HPV-16. (D) KTĐD 6B10. Giếng 1, 2, 3, 4: protein tái tổ hợp E7 HPV-16, E7 HPV-6, E7 HPV-11, E7 HPV-18.
~25 kDa
-50- Kết quả trong hình 3.6 cho thấy:
- Trên điện di SDS-PAGE, tại giếng 1(hình 3.6A), protein E7 HPV-16 tái tổ hợp xuất hiện một vạch tại vị trí tương ứng với kích thước khoảng 20 kDa
- Ở các giếng 1 (hình 3.6B) và giếng 4 (hình 3.6C), tương ứng vị trí của protein E7 HPV-16 đều xuất hiện tín hiệu lai với KTĐD 2C1 và KTĐD thương mại; trong khi đó, các giếng có protein E7 HPV-6,-11,-18 đều không xuất hiện tín hiệu lai với cả 3 KTĐD sử dụng (hình 3.6B, 3.6C, 3.6D), chứng tỏ 2 KTĐD 2C1 và KTĐD thương mại tương tác với protein E7 HPV-16. Tuy nhiên, ở giếng 1 (hình 3.6D), dù có sự hiện diện của protein E7 HPV-16 nhưng lại không thấy xuất hiện tín hiệu lai với KTĐD 6B10. Điều này có thể giải thích như sau: có thể ái lực của KTĐD 6B10 yếu nên lượng kháng thể sử dụng không thể phát hiện được protein E7 HPV-16; ngoài ra, trong phương pháp Western blot, các epitope cấu hình không gian của kháng nguyên bị phá vỡ do bị biến tính trong quá trình điện di SDS-PAGE, cho nên có thể KTĐD 6B10 không nhận diện được những epitope dạng thẳng của E7 HPV-16.
Kết quả Western blot như trên cho phép chúng tôi kết luận rằng:
- KTĐD 2C1 phản ứng đặc hiệu với protein E7 HPV-16 tái tổ hợp, không cho phản ứng chéo với protein E7 của các type 6, 11, 18. Đồng thời, vì các epitope cấu hình không gian của kháng nguyên bị phá vỡ do sự biến tính do đó chứng tỏ rằng KTĐD tương tác với các epitope dạng thẳng của protein E7 HPV-16.
- KTĐD 6B10 không cho thấy khả năng phát hiện được protein E7 HPV-16 đã biến tính và cùng với kết quả kiểm tra ái lực ở phần 3.4, chúng tôi nhận thấy KTĐD 6B10 không phù hợp với việc dùng để phát hiện protein E7 HPV-16.
Do đó, chúng tôi chọn KTĐD 2C1 để tiếp tục làm các thử nghiệm kiểm tra đặc tính tiếp theo.
-51-
3.3.2.2. Kết quả lai miễn dịch huỳnh quang
Với mục đích kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 với protein E7 biểu hiện trong tế bào động vật hữu nhũ, chúng tôi tiến hành thực hiện phương pháp lai miễn dịch huỳnh quang trên các tế bào CHO-K1 chuyển gene mã hóa cho protein E7 HPV- 16. Chúng tôi chuyển vector pEGFP-C2 và pEGFP-E7-16 vào dòng tế bào CHO-K1 vì đây là dòng thông dụng cho chuyển gene và không mang bản sao DNA của HPV. Dòng tế bào CHO-K1 được chuyển vector pEGFP-E7 (CHO-K1/EGFP-E7-16) biểu hiện protein E7 HPV-16 ở dạng dung hợp với protein phát huỳnh quang GFP (Green Fluorescent Protein). Chứng âm cho thí nghiệm là dòng tế bào CHO-K1 được chuyển vector pEGFP-C2 (CHO-K1/EGFP-C2) chỉ biểu hiện protein GFP và không biểu hiện protein E7. Sau đó, các dòng tế bào CHO-K1/EGFP-C2 và CHO-K1/EGFP-E7-16 được lai với KTĐD 2C1 và kháng thể thương mại (Santa Cruz). Kháng thể thứ cấp là kháng thể nhận diện các KTĐD và được đánh dấu bằng TRITC phát huỳnh quang đỏ/cam ở bước sóng kích thích là 541 nm. Protein GFP phát huỳnh quang màu xanh lục ở bước sóng kích thích là 488 nm
Kết quả hình 3.7 cho thấy :
- Ở bước sóng kích thích là 488 nm, tế bào CHO-K1/EGFP-C2 (hình 3.7B2, 3.7D2) và CHO-K1/EGFP-E7-16 (hình 3.7A2 và 3.7C2) đều phát huỳnh quang xanh. Điều này chứng tỏ việc chuyển gene đã thành công, protein GFP và protein E7 HPV- 16 dung hợp với GFP đều được biểu hiện.
-52-
Hình 3.7. Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CHO-K1/EGFP-E7-16, CHO-K1/EGFP-C2 với KTĐD quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng 541 nm và 488 nm. A1, B1: tế bào CHO-K1/EGFP-E7-16 và CHO- K1/EGFP-C2 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. A2, B2: tín hiệu huỳnh quang GFP ở bước sóng 488 nm. A3, B3: tín hiệu lai với KTĐD kháng E7 HPV-16 ở bước sóng 541 nm. A4, B4: hình kết hợp. C1, D1: tế bào CHO-K1/EGFP-E7-16 và CHO-K1/EGFP- C2 nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. C2, D2: tín hiệu huỳnh quang GFP ở bước sóng 488 nm. C3, D3: tín hiệu lai với KTĐD kháng E7 HPV-16 thương mại (Santa Cruz) ở bước sóng 541 nm. C4, D4: hình kết hợp.
-53-
- Ở bước sóng kích thích là 541 nm, chỉ có tế bào CHO-K1 có vector mang gene mã hóa cho protein E7 HPV-16 và tương tác với KTĐD 2C1 (hình 3.7A3) hoặc kháng thể thương mại (hình 3.7C3) mới phát huỳnh quang màu đỏ/cam. Đồng thời, tín hiệu huỳnh quang đỏ/cam không xuất hiện khi lai KTĐD 2C1 và kháng thể thương mại với tế bào CHO-K1/EGFP-C2 (hình 3.7A2 và 3.7C2). Điều này chứng tỏ KTĐD 2C1 của chúng tôi tương tác với protein E7 HPV-16 biểu hiện trong tế bào CHO-K1/pEGFP- E7-16 và không tương tác với protein nội bào khác.
Như vậy, kết quả thí nghiệm cho phép khẳng định KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV-16 được biểu hiện bởi hệ thống biểu hiện của tế bào động vật hữu nhũ.