Các phương pháp kiểm tra đặc tính của KTĐD

 Phương pháp lai miễn dịch huỳnh quang (immunofluorescence)

- Phủ 2,5 x 105 tế bào / ml trên coverslip và ủ ở 37C qua đêm.

(n-1) 2(n[Ab2]-[Ab1]) Kaff =

-39-

- Rửa coverslip 3 lần với dung dịch PBS. Block coverslip bằng 2 ml PBS – BSA 1 % trong 30 phút ở 4C.

- Rửa coverslip 3 lần với dung dịch PBS. Cố định tế bào trên coverslip bằng 1,5 ml PFA 3% - 10 phút ở nhiệt độ phòng.

- Làm thấm màng tế bào bằng 1,5 ml dung dịch PBS- Triton X100 0,5% trong 15 phút ở nhiệt độ phòng.

- Rửa coverslip 3 lần với dung dịch PBS- Tween 0,05%. Pha loãng kháng thể sơ cấp trong dung dịch PBS- saponin 0,05% . Ủ với 200 μl kháng thể sơ cấp qua đêm ở 4C.

- Rửa coverslip 3 lần với dung dịch PBS- Tween 0,05%. Ủ coverslip với 200 μl kháng thể thứ cấp trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Kháng thể thứ cấp sử dụng là kháng thể kháng IgG của chuột và cộng hợp với chất phát huỳnh quang đỏ là TRITC (1 µg/ml).

- Sau khi rửa coverslip với nước cất 2 lần, tiến hành nhuộm bổ sung với chất nhuộm nhân phát huỳnh quang xanh là Hoechst 33342 (1 μl/ml)

- Cố định coverslip lên phiến kính và quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang cùng tiêu điểm. Độ phóng đại 20X.

 Phương pháp Western blot

Protein sử dụng trong phương pháp lai Western blot từ hai nguồn là protein E7 HPV-16 tái tổ hợp và protein tổng số từ tế bào CaSki và C33A nuôi cấy in vitro.

- Thu nhận protein tổng số từ tế bào CaSki và C33A: ly tâm 2000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC để thu nhận 4 x 106 tế bào.

- Rửa cặn tế bào trong dung dịch PBS 2 lần. Ly tâm 2.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC.

- Huyền phù cặn tế bào trong 250 μl dung dịch ly giải tế bào lạnh. Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC và thu dịch nổi.

-40-

- Định lượng protein tổng số bằng phương pháp Bradford.

- Sau điện di SDS-PAGE, phần gel phân tách được ngâm trong dung dịch chuyển màng trong 30 phút. Màng lai cắt góc và giấy thấm được ngâm trong nước cất 5 phút, trong dung dịch chuyển màng ít nhất 15 phút.

- Tiến hành chuyển thẩm ở 110 V - 1 giờ. Cho màng lai vào dung dịch khóa màng, ủ 4C qua đêm.

- Tiếp tục ủ màng ở 4C qua đêm với kháng thể sơ cấp là KTĐD kháng protein E7 HPV-16 ở nồng độ 10 μg/ml hoặc KTĐD kháng protein E7 HPV-16 của hãng Santa Cruz biotechnology ở nồng độ 0,5 μg/ml.

- Sau đó, rửa màng 6 lần bằng dung dịch TBST 0,1%, mỗi lần 15 phút.

- Ủ màng với kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột có đánh dấu HRP ở nhiệt độ phòng trong 90 phút. Sau đó, rửa màng 6 lần bằng dung dịch TBST 0,1%, mỗi lần rửa 15 phút.

- Màng lai được ủ với 400 µl dung dịch phát hiện, hình ảnh được chụp lại bằng hệ thống chụp ảnh ChemiDoc (Biorad).

-41-

3.1. TẠO CÁC DÒNG TẾ BÀO LAI SẢN XUẤT KTĐD KHÁNG PROTEIN E7 HPV-16