Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma)

 Chuẩn bị dòng tế bào u tủy(myeloma)(một tuần trước khi dung hợp)

- Bắt đầu giải đông và nuôi cấy tế bào P3X63Ag8.653 trên môi trường RPMI 1640 - GlutaMax, cấy chuyền 2 ngày/lần. Đến ngày dung hợp với tế bào lách chuột, tổng số tế bào u tủy cần có khoảng 1 x 108 tế bào.

- Một ngày trước khi dung hợp, chia tế bào u tủy vào môi trường mới. Tế bào u tủy khi đem dung hợp phải có tỉ lệ tế bào sống hơn 95% để đảm bảo các tế bào đang ở giai đoạn tăng trưởng pha log. Tỷ lệ tế bào sống được xác định bằng thử nghiệm Trypan blue.

 Xác định tỉ lệ tế bào sống bằng phương pháp trypan blue

- Huyền phù tế bào trong 1 ml môi trường nuôi, dịch huyền phù được giữ trong 1 eppendorf vô trùng.

- Hòa 15 µl dịch tế bào trong 15 µl trypan blue, cho vào buồng đếm. Đếm số tế bào sống/ chết (tế bào chết bắt màu xanh).

 Dung hợp tế bào u tủy P3X63Ag8 với tế bào B từ lách chuột theo quy trình của Kohler và Misltein (1975)

 Thu nhận tế bào B:

- Chuẩn bị 3 đĩa petri, mỗi đĩa có sẵn 3ml môi trường RPMI 1640 - GlutaMax không có huyết thanh.

- Thu lách chuột đặt vào đĩa Petri 1, loại bỏ mỡ bám vào lách.

- Chuyển lách sang đĩa petri 2, tiếp tục rửa lách, loại bỏ phần mỡ còn sót lại. - Sau đó, chuyển lách sang đĩa petri 3, dùng ống tiêm hút môi trường trong đĩa rồi bơm vào lách nhiều lần để phóng thích tế bào lách ra môi trường.

- Dùng đầu ống kim tiêm xé lách, nghiền lách để thu nhận hoàn toàn tế bào lách.

- Hút môi trường có tế bào lách từ đĩa petri cho vào ống falcon 50 ml. Bổ sung thêm môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh.

-33-

- Để yên ở 4C – 5 phút. Thu tế bào lách bằng cách lọc qua màng lọc 70 m (loại bỏ cặn, mỡ từ lách).

- Ly tâm dịch lọc 1.500g – 10 phút, ở nhiệt độ phòng. Thu cặn, bỏ dịch nổi. - Hòa cặn trong dung dịch NH4Cl 0,17 M lạnh, ủ 4C, 5 phút để ly giải hồng cầu.

- Thêm 50 ml PBS, ly tâm 1.500g – 10 phút. Thu cặn, bỏ dịch nổi.

- Hòa cặn trong 25 ml môi trường RPMI 1640 - GlutaMax. Đếm số tế bào thu được, pha loãng bằng môi trường RPMI 1640 - GlutaMax đến mật độ tế bào mong muốn.

 Dung hợp tạo hybridoma:

- Để phủ tế bào hybridoma ở mật độ 5 x 104 tế bào/giếng trên đĩa 96 giếng, cho 20 đĩa thì lượng tế bào u tủy và tế bào lách cần là: 5 x 104 tế bào/giếng x 100 x 20 = 100 x 106 tế bào. Tỉ lệ tế bào u tủy và tế bào lách là 1:5. Tế bào u tủy và tế bào lách được trộn chung với nhau trong ống falcon 50 ml. Ly tâm 1.500g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và huyền phù cặn tế bào.

- Lắc ống falcon trong bể ổn nhiệt ở 37oC, vừa lắc vừa cho 1 ml PEG 1500 đã ủ ấm (ở 37oC) bằng cách nhỏ từng giọt trong 1 phút. Tiếp tục lắc falcon trong bercher nước (37oC) trong 1 phút 30 giây. Sau đó, thêm 20 ml RPMI 1640 không có huyết thanh bằng cách nhỏ từng giọt trong 5 phút.

- Ly tâm 1.000g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi. Hòa cặn tế bào nhẹ nhàng trong môi trường RPMI 1640 - GlutaMax 20% FBS. Ly tâm 1.000g trong 10 phút.

- Huyền phù cặn tế bào trong môi trường RPMI 1640 - GlutaMax có bổ sung HAT. Cho 100 µl dịch tế bào vào đĩa 96 giếng. Ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.

-34-

- Sau 7 ngày, bổ sung vào mỗi giếng trong đĩa 96 giếng 100 µl môi trường RPMI 1640 - GlutaMax bổ sung HAT. Chọn lọc các dòng tế bào hybridoma phát triển được trên môi trường và có khả năng tạo KTĐD bằng phương pháp ELISA.

 Phân lập dòng hybridoma sản xuất kháng thể mục tiêu bằng pha loãng tới hạn

- Đếm và xác định tỉ lệ tế bảo sống bằng cách nhuộm tế bào với trypan blue. - Cho vào ống falcon dịch huyền phù tế bào (10.000 tế bào), bổ sung thêm môi trường nuôi cấy cho đủ 10ml, mật độ tế bào trong ống falcon lúc này là 1.000 tế bào/ml (falcon A).

- Pha loãng 10 lần mật độ tế bào từ falcon A để có mật độ tế bào lần lượt là 100 tế bào/ml (falcon B) và 10 tế bào/ml (falcon C).

- Cho vào hàng đầu tiên của đĩa 96 giếng (hàng A) 100 µl dịch huyền phù từ falcon A (100 tế bào/giếng). Cho vào hàng tiếp theo (hàng B) 100 µl dịch huyền phù (10 tế bào/giếng). Cuối cùng cho 100 µl dịch huyền phù tế bào từ falcon C cho vào các hàng tiếp theo (hàng C-H) (1 tế bào/giếng).

- Ủ ở 37oC, 5% CO2.

- Sau 6 ngày, bổ sung thêm 100 µl môi trường mới vào mỗi giếng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

- Khi tế bào phủ khoảng 50% giếng, lấy 50 µl môi trường đi kiểm tra sự hiện diện kháng thể.

- Cấy chuyền tế bào từ 6 giếng cho tín hiệu dương tính sang đĩa 24 giếng và ủ ở 37oC, 5% CO2.

- Nhân dòng các dòng tế bào đơn đã chọn. Sau đó, bảo quản các dòng tế bào đơn trong nitơ lỏng.

-35-

 Bảo quản tế bào hybridoma

- Sau khi phân lập, dòng tế bào hybridoma sản xuất KTĐD ổn định từ đĩa 96 giếng sẽ được lần lượt chuyển sang nuôi cấy trong đĩa 48, 24, 12, 6 giếng và bình Roux 25 cm2.

- Ly tâm 1.200 g trong 10 phút thu nhận 5x106 tế bào. Huyền phù nhẹ tế bào trong 1 ml huyết thanh bào thai bê (FBS) có bổ sung 10% DMSO.

- Chuyển 1 ml dịch huyền phù vào ống bảo quản. Bảo quản tế bào ở -80oC, sau đó bảo quản trong nitơ lỏng.