ĐD kháng protein E7 của Human papillomavirus
Ngoài nước
Theo Jeon và cộng sự (2007), nhóm nghiên cứu tạo KTĐD kháng protein E7 HPV-16 trên chuột từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp. Kết quả cho thấy KTĐD 130-9-7 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV-16 biểu hiện trong tế bào nuôi cấy được chuyển gene HPV-16 và các mẫu phết tế bào cổ tử cung của bệnh nhân nhiễm HPV-16. Nhóm nghiên cứu đã chứng minh KTĐD này ứng dụng trong phương pháp nhuộm miễn dịch (immunostaining) cho phép phân biệt các trường hợp nhiễm HPV type nguy cơ cao với trường hợp loạn sản mức độ nhẹ ở biểu mô cổ tử cung [22].
Ngoài ra, còn có các công trình của các nhóm nghiên cứu tạo KTĐD kháng protein E7 của HPV nguy cơ cao khác như:
Selvey và cộng sự (1992) đã sản xuất được KTĐD 7E10 kháng protein E7 HPV-18 và được ứng dụng trong thử nghiệm ELISA để phát hiện protein E7 của HPV type 18 trong những mẫu bệnh phẩm UTCTC [27].
Fiedler và cộng sự (2005) đã tạo kháng thể đa dòng kháng protein E7 của HPV- 18 và -45 trên dê từ nguồn kháng nguyên là protein tái tổ hợp. Kháng thể đa dòng tạo được phản ứng đặc hiệu với protein E7 trong tế bào chuyển gene, tế bào HeLa biểu hiện tự nhiên protein E7 và các mẫu sinh thiết của bệnh nhân UTCTC. Đồng thời, các kháng thể đa dòng cho phép định lượng protein E7 trong tế bào ung thư [13].
-25-
Trong nước
Phòng thí nghiệm Sinh Học Phân Tử, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh đã tạo thành công 2 KTĐD 4H5 và 1D5 kháng protein E7 HPV-16 từ nguồn protein tái tổ hợp (2010) [33].
-26-
2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Tế bào
- Tế bào CaSki do ATCC (American Type Culture Collection) cung cấp, đây là dòng tế bảo ung thư có chứa bộ gene của HPV-16 (khoảng 600 bản sao/tế bào).
- Tế bào u tủy P3X63Ag8.653 (ATCC) không sản sinh các chuỗi immunoglobin và mất khả năng tổng hợp enzyme HGPRT (Hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase).
- Tế bào ung thư C33A (ATCC), là dòng tế bào ung thư cổ tử cung nhưng không có bản sao của bộ gene HPV-16.
- Tế bào CHO-K1 thu nhận từ phòng thí nghiệm Tế Bào Gốc trường Đại học Khoa học tự nhiên.
Tất cả các dòng tế bào trên hiện đang được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử - bộ môn Di truyền – khoa Sinh học – trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh.
2.1.2. Kháng nguyên
Kháng nguyên sử dụng là protein E7 HPV-16 tái tổ hợp được biểu hiện và tinh sạch từ chủng vi khuẩn E.coli BL21 (DE3) tại phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc bộ môn Di truyền - khoa Sinh học - Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Protein E7 HPV-16 đã được xác nhận chính là E7 HPV-16 trong các thí nghiệm trước đây của phòng (kết quả không trình bày).
2.1.3. Chuột dùng gây đáp ứng miễn dịch
Chuột BALB/c (Charles River Laboratories France): chuột cái 6-8 tuần tuổi, được nuôi trong điều kiện vô trùng.
-27-
2.1.4. Hóa chất – Môi trường: 2.1.4.1. Hóa chất 2.1.4.1. Hóa chất
Dùng để gây đáp ứng miễn dịch trên động vật và thu nhận huyết thanh
- Tá chất Freund complete adjuvant, Freund incomplete adjuvant (Sigma).
- Dung dịch PBS (-) 1X, KH2PO4 (1,47 mM), Na2HPO4.2H2O (10 mM), KCl (2,7 mM), NaCl (137 mM), dung dịch PBS – BSA 1% (PBS 1X + bovine serum albumin (BSA) (Sigma) 1%), dung dịch PBS – Tween 0,05 % (PBS 1X + Tween 20 (Merck) 0,05% )
Dùng trong ELISA kiểm tra đáp ứng miễn dịch của động vật
- Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu alkaline phosphatase (Southern Biotech).
- Cơ chất của enzyme alkaline phosphatase, với thành phần như sau:
+ Dung dịch pha cơ chất pH 9,8: Diethanolamine (Merck) 48,5 ml, MgCl2
4M 62,5 μl, ddH2O 500 ml.
+ Cơ chất (Phosphatase substrate) (Sigma): cho một viên cơ chất vào 5 ml dung dịch pha cơ chất. Lắc đến tan. Bảo quản ở -20C, tránh sáng.
Dùng cho dung hợp tạo tế bào hydridoma:
PEG 1500 (Sigma), dung dịch NH4Cl 0,17 M (Merck), HAT 50X (Sigma), HT 50X (Sigma), Trypan blue (Sigma).
Hóa chất dùng trong tinh sạch kháng thể đơn dòng
Bộ kit xác định isotype Isotrip (BD), cột Sepharose gắn protein G (GE Health Care), cột Sepharose gắn protein A (GE Health Care), dung dịch gắn cột (Tris-HCl 0,1 M; pH 7,5; NaCl 0,15 M), dung dịch dung giải (glycine 0,1 M; pH 2,8), dung dịch trung hòa (Tris-HCl 1 M; pH 9,0)
-28-
Thang protein
Hình 2.1. Thang phân tử protein (Fermentas)
Dùng cho điện di protein
- Gel phân tách (separating gel): acrylamide 12 %: 3,3 ml dH2O; 4 ml acrylamide 30 %; 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8); 0,1 ml SDS 10 %; 0,1 ml APS 10 %; 30 µl TEMED.
- Gel gom (stacking gel): 2,8 ml dH2O; 0,66 ml acrylamide 30 %; 0,5 ml Tris- HCl 1M (pH 6,8); 0,04 ml SDS 10 %; 0,04 ml APS 10 %; 16 µl TEMED.
- Dung dịch nạp mẫu 5X (giữ ở 4oC): SDS 10 % (w/v); DTT 10 mM; Tris-HCl 0,2 M (pH 6,8); glycerol 20 % (v/v); bromophenol blue 0,05 %.
- Dung dịch điện di 5X (giữ ở nhiệt độ phòng): 15,1 g Tris-base; 94 g glycine; 5 g SDS; thêm dH2O cho đủ 1 l.
- Dung dịch nhuộm gel (giữ ở nhiệt độ phòng): 0,625 g coomassie brilliant blue; 112,5 ml ethanol tuyệt đối; 25 ml glacial acetic acid; thêm dH2O cho đủ 250 ml.
- Dung dịch giải nhuộm (giữ ở nhiệt độ phòng): 100 ml glacial acetic acid, 100 ml ethanol tuyệt đối, 800 ml dH2O.
-29-
Hóa chất dùng cho Western blot
- Dung dịch điện chuyển 1X (giữ ở 4oC): 3,03 g Tris-base; 14,41 g glycine; 200 ml methanol; thêm dH2O cho đủ 1 l.
- Dung dịch TBS 1X: 0,605 g Tris-base; 4,39 g NaCl; thêm dH2O đủ 500 ml. - Dung dịch TBST (dung dịch rửa): TBS + Tween 20 (1%).
- Dung dịch khóa màng (membrane blocking): TBST + sữa gầy (5%).
- Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu horseradish peroxidase (Santa Cruz biotechnology).
- KTĐD thương mại kháng protein E7 HPV-16 (Santa Cruz biotechnology). - Dung dịch cơ chất của peroxidase: SuperSignal west femto maximum sensitivity substrate (Pierce - Thermo Scientific).
- Dung dịch ly giải tế bào (bảo quản ở -20oC): HaltTM Protease Inhibitor Cocktail 100X (Pierce - Thermo Scientific).
- Dung dịch IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) 100 mM (giữ ở -20oC) (Fermentas).
Hóa chất chuyển gene vào tế bào CHO-K1 và lai miễn dịch huỳnh quang
Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Poly-L-Lysine (Sigma), PBS – PFA 3% (PBS bổ sung paraformaldehyde nồng độ cuối 3%), PBS – Triton X100 0,2% (PBS bổ sung Triton X100 nồng độ cuối 0,2%).
Hóa chất dùng cho lai miễn dịch huỳnh quang
- Blocking PBS-BSA (Sigma) 1%. - Chất cố định tế bào: PFA (Sigma) 3%.
-30-
- Chất thấm màng PBS saponin (Sigma) 0,05%.
- Kháng thể kháng protein E7 HPV-16 (Santa Cruz biotechnology).
- Kháng thể thứ cấp là kháng thể thỏ kháng IgG chuột cộng hợp với chất phát huỳnh quang TRITC.
- Chất nhuộm nhân Hoechst 33342 (BioChem).
2.1.4.2. Môi trường
- Môi trường RPMI 1640 - GlutaMax (Gibco) nuôi cấy tế bào CaSki và tế bào C33A bổ sung huyết thanh (FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10 %, Penicilin - Streptomycin (Gibco) 1%, HEPES (Gibco) 1%.
- Môi trường RPMI 1640 - GlutaMax (Gibco) nuôi cấy tế bào u tủy P3X63Ag8.653 bổ sung huyết thanh (FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10%, Penicilin - Streptomycin (Gibco) 1%, HEPES (Gibco) 1%.
- Môi trường chọn lọc : môi trường HAT dùng chọn lọc tế bào lai là môi trường RPMI 1640 - GlutaMax (Gibco) bổ sung các thành phần dung dịch HAT 1X (Hypoxanthine 1 x 10-4 M; Aminopterin 4 x 10-7 M; Thymidine 1,6 x 10-5 M; (Sigma), huyết thanh (FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10%, Penicilin-Streptomycin (Gibco) 1%, HEPES (Gibco) 1%, NCTC 109 (Sigma) 10%, amino acid không thiết yếu (Sigma) 1%.
- Môi trường HT gồm các thành phần môi trường sau: RPMI 1640 - GlutaMax (Gibco) bổ sung các thành phần dung dịch HT 1X (Hypoxanthine 1 x 10-4 M;
Thymidine 1,6 x 10-5 M; (Sigma), huyết thanh (FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10 %, Penicilin-Streptomycin (Gibco) 1%, HEPES (Gibco) 1%, NCTC 109 (Sigma) 10%, amino acid không thiết yếu (Sigma) 1%.
-31-
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột
Protein E7 HPV16 dung hợp với đuôi 6xHis sau khi tinh sạch được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch cho 2 chuột cái BALB/c 8 tuần tuổi. Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch cho chuột được thực hiện như bảng 2.1
Bảng 2.1. Biểu thời gian gây đáp ứng miễn dịch chuột BALB/c Ngày
thứ
Mũi tiêm Lượng kháng nguyên (μg/150 μl/chuột)
Tá chất sử dụng
Vị trí tiêm
0 Mẫn cảm 40 μg CFA Dưới da
14 Tăng cường 1 20 μg IFA Dưới da
28 Tăng cường 2 20 μg IFA Dưới da
36 Thu nhận huyết thanh kiểm tra đáp ứng
42 Giai đoạn nghỉ trước khi tiêm mũi tăng cường cuối cùng 52 Tiêm mũi tăng
cường trước dung hợp
10 μg Không sử
dụng tá chất
Tĩnh mạch
55 Thu nhận tế bào lách
Khả năng đáp ứng miễn dịch của chuột được đánh giá bằng phương pháp ELISA, sử dụng protein tái tổ hợp E7 HPV-16 làm kháng nguyên phủ giếng.
-32-
2.2.2. Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma)
Chuẩn bị dòng tế bào u tủy(myeloma)(một tuần trước khi dung hợp)
- Bắt đầu giải đông và nuôi cấy tế bào P3X63Ag8.653 trên môi trường RPMI 1640 - GlutaMax, cấy chuyền 2 ngày/lần. Đến ngày dung hợp với tế bào lách chuột, tổng số tế bào u tủy cần có khoảng 1 x 108 tế bào.
- Một ngày trước khi dung hợp, chia tế bào u tủy vào môi trường mới. Tế bào u tủy khi đem dung hợp phải có tỉ lệ tế bào sống hơn 95% để đảm bảo các tế bào đang ở giai đoạn tăng trưởng pha log. Tỷ lệ tế bào sống được xác định bằng thử nghiệm Trypan blue.
Xác định tỉ lệ tế bào sống bằng phương pháp trypan blue
- Huyền phù tế bào trong 1 ml môi trường nuôi, dịch huyền phù được giữ trong 1 eppendorf vô trùng.
- Hòa 15 µl dịch tế bào trong 15 µl trypan blue, cho vào buồng đếm. Đếm số tế bào sống/ chết (tế bào chết bắt màu xanh).
Dung hợp tế bào u tủy P3X63Ag8 với tế bào B từ lách chuột theo quy trình của Kohler và Misltein (1975)
Thu nhận tế bào B:
- Chuẩn bị 3 đĩa petri, mỗi đĩa có sẵn 3ml môi trường RPMI 1640 - GlutaMax không có huyết thanh.
- Thu lách chuột đặt vào đĩa Petri 1, loại bỏ mỡ bám vào lách.
- Chuyển lách sang đĩa petri 2, tiếp tục rửa lách, loại bỏ phần mỡ còn sót lại. - Sau đó, chuyển lách sang đĩa petri 3, dùng ống tiêm hút môi trường trong đĩa rồi bơm vào lách nhiều lần để phóng thích tế bào lách ra môi trường.
- Dùng đầu ống kim tiêm xé lách, nghiền lách để thu nhận hoàn toàn tế bào lách.
- Hút môi trường có tế bào lách từ đĩa petri cho vào ống falcon 50 ml. Bổ sung thêm môi trường RPMI 1640 không có huyết thanh.
-33-
- Để yên ở 4C – 5 phút. Thu tế bào lách bằng cách lọc qua màng lọc 70 m (loại bỏ cặn, mỡ từ lách).
- Ly tâm dịch lọc 1.500g – 10 phút, ở nhiệt độ phòng. Thu cặn, bỏ dịch nổi. - Hòa cặn trong dung dịch NH4Cl 0,17 M lạnh, ủ 4C, 5 phút để ly giải hồng cầu.
- Thêm 50 ml PBS, ly tâm 1.500g – 10 phút. Thu cặn, bỏ dịch nổi.
- Hòa cặn trong 25 ml môi trường RPMI 1640 - GlutaMax. Đếm số tế bào thu được, pha loãng bằng môi trường RPMI 1640 - GlutaMax đến mật độ tế bào mong muốn.
Dung hợp tạo hybridoma:
- Để phủ tế bào hybridoma ở mật độ 5 x 104 tế bào/giếng trên đĩa 96 giếng, cho 20 đĩa thì lượng tế bào u tủy và tế bào lách cần là: 5 x 104 tế bào/giếng x 100 x 20 = 100 x 106 tế bào. Tỉ lệ tế bào u tủy và tế bào lách là 1:5. Tế bào u tủy và tế bào lách được trộn chung với nhau trong ống falcon 50 ml. Ly tâm 1.500g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, bỏ dịch nổi và huyền phù cặn tế bào.
- Lắc ống falcon trong bể ổn nhiệt ở 37oC, vừa lắc vừa cho 1 ml PEG 1500 đã ủ ấm (ở 37oC) bằng cách nhỏ từng giọt trong 1 phút. Tiếp tục lắc falcon trong bercher nước (37oC) trong 1 phút 30 giây. Sau đó, thêm 20 ml RPMI 1640 không có huyết thanh bằng cách nhỏ từng giọt trong 5 phút.
- Ly tâm 1.000g trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dịch nổi. Hòa cặn tế bào nhẹ nhàng trong môi trường RPMI 1640 - GlutaMax 20% FBS. Ly tâm 1.000g trong 10 phút.
- Huyền phù cặn tế bào trong môi trường RPMI 1640 - GlutaMax có bổ sung HAT. Cho 100 µl dịch tế bào vào đĩa 96 giếng. Ủ trong tủ ấm 37oC, 5% CO2.
-34-
- Sau 7 ngày, bổ sung vào mỗi giếng trong đĩa 96 giếng 100 µl môi trường RPMI 1640 - GlutaMax bổ sung HAT. Chọn lọc các dòng tế bào hybridoma phát triển được trên môi trường và có khả năng tạo KTĐD bằng phương pháp ELISA.
Phân lập dòng hybridoma sản xuất kháng thể mục tiêu bằng pha loãng tới hạn
- Đếm và xác định tỉ lệ tế bảo sống bằng cách nhuộm tế bào với trypan blue. - Cho vào ống falcon dịch huyền phù tế bào (10.000 tế bào), bổ sung thêm môi trường nuôi cấy cho đủ 10ml, mật độ tế bào trong ống falcon lúc này là 1.000 tế bào/ml (falcon A).
- Pha loãng 10 lần mật độ tế bào từ falcon A để có mật độ tế bào lần lượt là 100 tế bào/ml (falcon B) và 10 tế bào/ml (falcon C).
- Cho vào hàng đầu tiên của đĩa 96 giếng (hàng A) 100 µl dịch huyền phù từ falcon A (100 tế bào/giếng). Cho vào hàng tiếp theo (hàng B) 100 µl dịch huyền phù (10 tế bào/giếng). Cuối cùng cho 100 µl dịch huyền phù tế bào từ falcon C cho vào các hàng tiếp theo (hàng C-H) (1 tế bào/giếng).
- Ủ ở 37oC, 5% CO2.
- Sau 6 ngày, bổ sung thêm 100 µl môi trường mới vào mỗi giếng.
- Khi tế bào phủ khoảng 50% giếng, lấy 50 µl môi trường đi kiểm tra sự hiện diện kháng thể.
- Cấy chuyền tế bào từ 6 giếng cho tín hiệu dương tính sang đĩa 24 giếng và ủ ở 37oC, 5% CO2.
- Nhân dòng các dòng tế bào đơn đã chọn. Sau đó, bảo quản các dòng tế bào đơn trong nitơ lỏng.
-35-
Bảo quản tế bào hybridoma
- Sau khi phân lập, dòng tế bào hybridoma sản xuất KTĐD ổn định từ đĩa 96 giếng sẽ được lần lượt chuyển sang nuôi cấy trong đĩa 48, 24, 12, 6 giếng và bình Roux 25 cm2.
- Ly tâm 1.200 g trong 10 phút thu nhận 5x106 tế bào. Huyền phù nhẹ tế bào trong 1 ml huyết thanh bào thai bê (FBS) có bổ sung 10% DMSO.
- Chuyển 1 ml dịch huyền phù vào ống bảo quản. Bảo quản tế bào ở -80oC, sau đó bảo quản trong nitơ lỏng.
2.2.3. Phương pháp nhân dòng tế bào lai sản xuất KTĐD in vitro và thu nhận KTĐD nhận KTĐD
Phương pháp sản xuất KTĐD in vitro
- Dòng hybridoma được nuôi cấy trong bình Roux 25 cm2 chứa môi trường RPMI 1640 - GlutaMax có nồng độ huyết thanh 10%.
- Sau 1-2 tuần, tế bào được nuôi cấy ở những thể tích lớn dần trong bình Roux 75 cm2, 175 cm2.
- Khi tế bào phát triển đến giai đoạn bão hòa và bắt đầu chết thì tiến hành ly tâm môi trường nuôi cấy và thu dịch nổi.
Phương pháp thu nhận KTĐD từ dịch nổi
- Cho 1 lít môi trường nuôi cấy các dòng hybridoma qua cột protein G- sepharose hay protein A-sepharose 1 ml (GE Health Care) đã được cân bằng.
- Rửa cột bằng dung dịch PBS. Dung giải kháng thể bằng 10 ml glycine 0,2 M (pH 2,8).
- Thu nhận 10 phân đoạn, mỗi phân đoạn 1 ml, vào eppendorf có chứa sẵn 20 μl dung dịch trung hòa.
-36-
- Kháng thể sau khi tinh sạch được thẩm tách và bảo quản trong PBS. Đo OD280 để xác định hàm lượng kháng thể thu nhận được.
- Lượng kháng thể được tính theo công thức:
Nồng độ KTĐD = OD280 x 0,74
2.2.4. Phương pháp điện di SDS-PAGE kiểm tra độ tinh sạch của KTĐD
- Hòa 5 μg kháng thể đã tinh sạch vào dung dịch nạp mẫu 5X.
- Mẫu được đun ở 100C - 10 phút, làm lạnh nhanh trong đá đang tan. - Chuẩn bị gel polyacrylamide có nồng độ acrylamide là 12,5%. - Nạp mẫu (20 µl/giếng) với 5 µl thang điện di protein.
- Điện di ở 100 V trong thời gian 2 giờ. - Nhuộm 30 phút, giải nhuộm.
2.2.5. Phương pháp ELISA
Phương pháp ELISA được dùng cho hai mục tiêu: (1) kiểm tra đáp ứng miễn