nhiên trong tế bào CaSki
Sau khi đã kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD 2C1 trên protein E7 HPV-16 tái tổ hợp và biểu hiện trong tế bào CHO-K1 chuyển gene, chúng tôi tiếp tục thực hiện các thí nghiệm với phương pháp Western blot, lai miễn dịch huỳnh quang trên dòng tế bào CaSki nhằm kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD với protein E7 biểu hiện trong dòng tế bào này. Chúng tôi chọn tế bào CaSki cho các thí nghiệm này vì đây là dòng tế bào UTCTC được ghi nhận có chứa khoảng 600 bản sao DNA của virus HPV-16 trong bộ gene và biểu hiện tự nhiên protein E7 HPV-16 với kích thước vào khoảng 20 kDa [1], [26]. Bên cạnh đó, dòng tế bào UTCTC C33A không mang DNA của HPV-16 được chọn làm chứng âm để kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD [20].
3.3.3.1. Kết quả Western blot
Protein tổng số từ dịch ly giải tế bào CaSki và tế bào C33A được định lượng bằng phương pháp Bradford. 50 µg protein tổng số từ mỗi mẫu được điện di và chuyển
-54-
thẩm lên màng lai. Chúng tôi cũng sử dụng 5 µg protein E7 HPV-16 tái tổ hợp để làm chứng dương cho thí nghiệm. Sau đó, màng lai được ủ với KTĐD 2C1.
Kết quả trên hình 3.8 cho thấy:
Ở càc giếng có protein tổng số của tế bào CaSki (giếng 1) và protein E7 HPV- 16 tái tổ hợp (giếng 2) đều xuất hiện tín hiệu lai ở vị trí có kích thước khoảng 20 kDa tương ứng với kích thước dự đoán của protein E7. Trong khi đó, tín hiệu lai không xuất hiện ở giếng có protein tổng số từ tế bào C33A tương tác với cùng KTĐD (giếng 3). Như vây, chúng tôi có thể khẳng định tín hiệu lai xuất hiện ở vị trí 20 kDa là tín hiệu đặc hiệu cho protein E7 HPV-16 biểu hiện trong tế bào CaSki.
3.3.3.2. Kết quả lai miễn dịch huỳnh quang
Thực hiện phương pháp lai miễn dịch sử dụng kính hiển vi huỳnh quang cho phép chúng tôi kiểm tra tính đặc hiệu của KTĐD với protein E7 HPV-16 biểu hiện trong tế bào CaSki. Chúng tôi tiếp tục sử dụng dòng tế bào ung thư C33A làm chứng âm cho thí nghiệm. Kháng thể thứ cấp là kháng thể thỏ đặc hiệu cho IgG của chuột và
Hình 3.8. Kết quả Western blot của các KTĐD 2C1 với dịch ly giải tế bào CaSki, C33A và protein E7 HPV-16 tái tổ hợp. Giếng M: thang phân tử lượng protein; giếng 1: 50 µg dịch ly giải tế bào CaSki ; giếng 2: 5 µg protein E7 HPV-16 tái tổ hợp; giếng 3:50 µg dịch ly giải tế bào C33A.
-55-
được cộng hợp với chất phát huỳnh quang là TRITC. Các tế bào được nhuộm bổ sung với chất nhuộm DNA phát huỳnh quang màu xanh là Hoechst. Tương tác giữa KTĐD với kháng nguyên được nhận biết thông qua tín hiệu huỳnh quang màu đỏ/cam khi quan sát ở bước sóng kích thích của TRITC (541 nm).
Kết quả hình 3.9 cho thấy
- Tế bào C33A tương tác với KTĐD kháng E7 HPV-16 2C1 và KTĐD thương mại (Santa Cruz) (Hình 3.9B2, 3.9D2) đều không cho thấy có tín hiệu huỳnh quang đỏ/cam của TRITC.
- Tế bào CaSki tương tác với KTĐD 2C1 (Hình 3.9A2) cho tín hiệu huỳnh quang đỏ/cam của TRITC, tín hiệu này vừa có phần trùng lắp vừa có phần không trùng lắp với tín hiệu huỳnh quang màu xanh của Hoechst (Hình 3.9A3) và chúng tôi cũng thu nhận được kết quả tương tự với KTĐD kháng E7 HPV-16 thương mại (Santa Cruz). Kết quả này cho phép chúng tôi khẳng định KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV-16 biểu hiện trong nhân và trong vùng tế bào chất của tế bào CaSki. Điều này cũng phù hợp với kết quả mà Dreier và cộng sự (2011) đã công bố, nhóm nghiên cứu này khi sử dụng phương pháp miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đa dòng thỏ kháng E7 HPV-16 đã ghi nhận ở hầu hết tế bào CaSki, protein E7 được phát hiện thấy cả trong nhân và trong tế bào chất [9].
-56-
Hình 3.9. Kết quả miễn dịch huỳnh quang trên tế bào CaSki, C33A với KTĐD quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang (20X) ở bước sóng 541 nm và 488 nm. A1, B1: tế bào CaSki, C33A nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. A2, B2: tín hiệu với KTĐD kháng E7 HPV-16 dòng 2C1 ở bước sóng 541 nm. A3, B3: hình kết hợp. C1, D1: tế bào CaSki, C33A nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst. C2, D2: tín hiệu với KTĐD kháng E7 HPV-16 thương mại (Santa Cruz) ở bước sóng 541 nm. C4, D4: hình kết hợp.
-57-
Tóm lại, với các kết quả kiểm tra đặc tính của KTĐD (mục 3.3.2, mục 3.3.3) cho thấy: KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV-16 tái tổ hợp thu nhận từ vi khuẩn E.coli , biểu hiện trong tế bào CHO-K1 chuyển gene và ở dạng tự nhiên trong tế bào UTCTC CaSki. Do đó, KTĐD 2C1 có tiềm năng ứng dụng trong các phương pháp phát hiện protein E7 HPV-16 hiện diện ở các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân UTCTC.
-58-
KẾT LUẬN
1. Chúng tôi đã thu nhận thành công hai dòng tế bào lai 2C1 và 6B10 sản xuất KTĐD kháng protein E7 HPV-16 từ nguồn protein tái tổ hợp.
2. Chúng tôi đã thu nhận 3,18 mg KTĐD 2C1 và 1,20 mg KTĐD. 3. Các đặc điểm của KTĐD 2C1 và 6B10:
- Isotype của KTĐD 2C1 và KTĐD 6B10 lần lượt là IgG1và IgG3.
- Ái lực (Kaff ) tương tác với protein E7 HPV-16 tái tổ hợp của KTĐD 2C1 và 6B10 lần lượt là: 1,12 ± 0,21 x 109 M-1, 0,99 ± 0,25 x 107 M-1.
- KTĐD 2C1 tương tác đặc hiệu với E7 HPV-16 biểu hiện trong tế bào CHO-K1 chuyển gene, đồng thời cũng tương tác đặc hiệu với protein E7 HPV-16 biểu hiện tự nhiên trong tế bào UTCTC CaSki.
ĐỀ NGHỊ
- Nghiên cứu phương pháp bảo quản KTĐD.
- Tối ưu hóa nồng độ KTĐD 2C1 cho các phương pháp thử nghiệm.
- Sử dụng KTĐD 2C1 để xây dựng quy trình ELISA, hóa mô miễn dịch nhằm phát hiện protein E7 HPV-16 trong các mẫu bệnh phẩm.
loãng huyết thanh
Chuột 1 Chuột 2 trước khi gây đáp
ứng miễn dịch OD trung bình STD OD trung bình STD OD trung bình STD 1/50 3.207 0.055 3.130 0.176 0.249 0.002 1/100 3.235 0.059 3.046 0.170 0.159 0.003 1/200 3.226 0.067 3.105 0.146 0.104 0.004 1/400 3.141 0.189 2.951 0.153 0.070 0.003 1/800 3.210 0.037 2.932 0.128 0.053 0.001 1/1600 3.097 0.073 2.542 0.132 0.044 0.001 1/3200 2.772 0.049 2.087 0.126 0.045 0.002 1/6400 2.262 0.088 1.423 0.084 0.038 0.003 1/12800 1.654 0.021 1.000 0.034 0.032 0.002 1/25600 1.123 0.049 0.661 0.016 0.019 0.004 1/51200 0.788 0.081 0.370 0.030 0.019 0.003
Giá tri OD 405
nm 0.085 0.07 0.099 0.085 0.082 0.12 0.091 0.131 0.083 0.104
Vị trí giếng 2A2 2C1 2D11 2F2 3E5 3E6 3A4 3B9 3B11 3D1
Giá tri OD 405
nm 0.109 1.71 0.086 0.125 0.137 0.086 0.085 0.151 0.085 0.086
Vị trí giếng 4E5 4A10 4D10 4H10 4C11 4C2 4H5 4D10 4G2 5B11
Giá tri OD 405
nm 0.118 0.098 0.119 0.109 0.115 0.083 0.069 0.092 0.118 0.13
Vị trí giếng 5D2 5D2 5D3 5H6 5B8 5B9 5C3 5C5 5D8 5E6
Giá tri OD 405
nm 0.1 0.1 0.093 0.128 0.091 0.08 0.093 0.077 0.079 0.084
Vị trí giếng 5E11 5F6 5H7 5H9 5A7 5B5 5C1 5C2 5D7 5F9
Giá tri OD 405
nm 0.096 0.092 0.119 0.102 0.074 0.094 0.081 0.123 0.088 0.081
Vị trí giếng 5G9 5G10 6C1 6C5 6D4 6D11 6E3 6E4 6E5 6B10
Giá tri OD 405
nm 0.087 0.071 0.08 0.075 0.084 0.088 0.151 0.094 0.099 1.586
Vị trí giếng 6C11 6D5 6E10 6F5 6F1 6F6 6E12 7B8 7C1 7E4
Giá tri OD 405 nm 0.093 0.113 0.097 0.097 0.106 0.101 0.092 0.092 0.096 0.098 Vị trí giếng 7G6 7H12 7B6 7B9 7F3 7G7 7H5 7C2 7G7 7H5 Giá tri OD 405 nm 0.109 0.078 0.078 0.095 0.085 0.074 0.069 0.118 0.096 0.123 Vị trí giếng 8B9 8B11 8C2 8D5 9F3 8H6 9E6 9F8 9F11 9F7 Giá tri OD 405 nm 0.121 0.118 0.14 0.135 0.16 0.104 0.142 0.165 0.115 0.157
Vị trí giếng 9F11 9H11 9H12 10A6 10A10 10A7 10B1 10C1 10C5 10D1
Giá tri OD 405
nm 0.135 0.095 0.123 0.108 0.095 0.097 0.086 0.098 0.125 0.135
Vị trí giếng 10E3 10H9
Giá tri OD 405
phủ giếng µg/ml 10.0000 3.3333 1.1111 0.3704 0.1235 0.0412 0.0137 0.0046 0.0015 0.0005 0.0002 0.0001 5 1 3.550 3.348 3.218 3.103 2.189 1.179 0.545 0.301 0.110 0.092 0.110 0.068 2 3.027 3.207 2.914 3.004 2.338 1.204 0.502 0.275 0.118 0.087 0.095 0.067 3 3.260 2.922 3.070 2.502 1.624 0.986 0.369 0.193 0.194 0.090 0.107 0.066 trung bình- blank 3.234 3.114 3.022 2.825 2.005 1.078 0.427 0.211 0.096 0.045 0.059 0.022 2,5 1 3.157 2.975 3.172 2.652 2.222 1.249 0.548 0.265 0.119 0.092 0.091 0.067 2 3.118 3.146 2.922 2.703 2.113 1.264 0.617 0.297 0.110 0.087 0.077 0.066 3 3.102 2.749 2.882 2.709 1.946 0.946 0.419 0.242 0.206 0.119 0.115 0.067 trung bình- blank 3.074 2.905 2.940 2.636 2.042 1.101 0.476 0.216 0.093 0.048 0.043 0.015 1,25 1 2.800 2.985 2.790 2.773 1.401 1.295 0.590 0.311 0.132 0.097 0.092 0.064 2 2.854 2.811 2.829 2.774 2.169 1.333 0.682 0.372 0.143 0.098 0.086 0.067 3 2.975 2.935 2.671 2.358 1.778 0.962 0.473 0.226 0.213 0.104 0.102 0.068 trung bình- blank 2.828 2.862 2.715 2.586 1.734 1.148 0.533 0.254 0.114 0.051 0.045 0.018 0,625 1 2.727 2.675 2.554 2.382 1.818 1.241 0.635 0.316 0.127 0.091 0.081 0.084 2 2.884 2.745 2.717 2.448 2.192 1.508 0.759 0.432 0.165 0.122 0.110 0.068 3 2.434 2.381 2.368 2.075 1.632 1.000 0.460 0.206 0.188 0.097 0.113 0.069 trung bình- blank 2.625 2.544 2.490 2.245 1.824 1.193 0.561 0.261 0.103 0.047 0.045 0.017
30.0000 10.0000 3.3333 1.1111 0.3704 0.1235 0.0412 0.0137 0.0046 0.0015 0.0005 0.0002 5 1 1.209 0.919 0.404 0.201 0.118 0.093 0.082 0.092 0.088 0.097 0.088 0.088 2 1.145 0.968 0.383 0.160 0.102 0.077 0.065 0.070 0.068 0.069 0.073 0.074 3 1.186 1.064 0.419 0.152 0.109 0.086 0.122 0.102 0.083 0.077 0.095 0.146 trung bình- blank 1.077 0.881 0.299 0.068 0.007 -0.017 -0.013 -0.015 -0.023 -0.022 -0.017 0.000 2,5 1 0.938 0.683 0.281 0.135 0.084 0.073 0.061 0.069 0.076 0.068 0.074 0.074 2 0.831 0.765 0.282 0.121 0.114 0.083 0.063 0.070 0.069 0.069 0.079 0.070 3 0.935 0.635 0.254 0.107 0.090 0.066 0.074 0.132 0.069 0.067 0.067 0.107 trung bình- blank 0.818 0.611 0.189 0.037 0.012 -0.010 -0.018 0.007 -0.012 -0.016 -0.010 0.000 1,25 1 0.648 0.504 0.198 0.099 0.074 0.071 0.062 0.068 0.070 0.067 0.069 0.072 2 0.566 0.466 0.179 0.096 0.075 0.071 0.059 0.071 0.070 0.079 0.069 0.074 3 0.672 0.627 0.179 0.088 0.074 0.081 0.069 0.069 0.088 0.066 0.078 0.073 trung bình- blank 0.556 0.459 0.112 0.021 0.001 0.001 -0.010 -0.004 0.003 -0.002 -0.001 0.000 0,625 1 0.415 0.318 0.135 0.082 0.069 0.067 0.063 0.071 0.072 0.068 0.072 0.069 2 0.447 0.124 0.047 0.071 0.068 0.068 0.064 0.075 0.071 0.070 0.074 0.066 3 0.469 0.275 0.105 0.068 0.069 0.063 0.070 0.065 0.066 0.078 0.067 0.049 trung bình- blank 0.382 0.178 0.034 0.012 0.007 0.005 0.004 0.009 0.008 0.011 0.010 0.000
-59-
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
[1]. Adler K., Erickson T., Bobrow M. (1997), High sensitivity detection of HPV-16 in SiHa and CaSki cells utilizing FISH enhanced by TSA,
Histochemtry Cell Biololgy, 108(4-5):321-4.
[2]. Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D. D., Seidman J. G., Smith J. A., Struhl K. (2001), Current Protocol in Molecular Biology, Wiley & Son.
[3]. Baron S. (1996), Medical Microbiology 4th edition, University of Texas Medical Branch at Galveston, Texas
[4]. Beatty JD, Beatty BG, Vlahos WG. (1987), Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay, Journal of Immunological Method, 100: 173-179.
[5]. Boulet G., Horvath C., Broeck D. V., Sahebali S., Bogers J. (2007), Human papilloma virus : E6 and E7 oncogenes, The International Journal of Biochemistry and Cell Biology, 39: 2006–2011.
[6]. Boulet G., Horvath1 C. A. J., Berghmans S., Bogers J. (2008), Human Papillomavirus in Cervical Cancer Screening: Important Role as Biomarke, Cancer Epidemiol Biomarkers and Prevention, 17(4):810-817.
[7]. Burd E. M. (2003), Human Papillomavirus and Cervical Cancer,
Clinical Microbiology Reviews, Jan. 2003, p. 1–17.
[8]. Canadas M. P., Darwich L., Sirera G., Cirigliano V., Bofill M., Clotet B., Videla S. (2009), New molecular method for the detection of human papilloma 16 integration, Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 1-7.
[9]. Dreier K., Scheidenc R., Lenera B., Ehehalt D., Pirchera H., Holznerd E. M., Rosteka U., Kaisera A., Fiedlere M., Resslera Sigrun.,b, Lechnera S., Widschwendterd A., Evenc J., Capesiusc C., Jansen-Dürra Pidder., Zwerschkea W. (2011), Subcellular localization of the human papillomavirus 16 E7
-60-
oncoprotein in CaSki cells and its detection in cervical adenocarcinoma and adenocarcinoma in situ, Virology, 409(1-6): 54–68.
[10]. Dehn D., Rorkko K. C., Shroyer K. R. (2007), Human Papilloma virus Testing and Molecular Markers of Cervical Dysplasia and Carcinoma, Cancer Cytopathology, 111(1):1-14.
[11]. Doorbar J. (2006), Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer , Clinical Science 110, 525–541.
[12]. Fiedler M, Müller-Holzner E., Viertler H., Widschwendter A., Laich A., Pfister G., Spoden G. A,,Jansen-Dürr A., Zwerschke W. (2004), High level HPV-16 E7 oncoprotein expression correlates with reduced pRb-levels in cervical biopsies, The FASEB Journal, 1-25.
[13]. Fiedler M., Ressler S., et al. (2005), Expression of the high-risk human papillomavirus type18 and 45 E7 oncoproteins incervical carcinoma biopsies, Journalof General Virology, 86:3235-3241.
[14]. Galani E., Christodoulou C. (2009), Human papilloma viruses and cancer in the post-vaccine era, Clinical Microbiology and Infection, 15:977-981. [15]. Ganguly N., Parihar S. P. (2009), Human papillomavirus E6 and E7
oncoproteins as risk factors for tumorigenesis, Journal of Biosciences, 34(1): 113-123.
[16]. Groth S. F., Scheidegegger D. (1980), Production of monoclonal antibodies: strategy and tatics, Journal of Immunological Methods, 35: 1-21. [17]. Hausen H. Z. (2002), Papillomaviruses and cancer: from basic studies to
clinical application, Nature Reviews Cancer, 2: 342-350.
[18]. Howard G. C., Kaser M. R. (2007), Making and using antibodies, CRC Press.
[19]. Huh K.W., DeMasi Joseph., Ogawa H. ‡§, Nakatani Y., Howley P. M., Munger K. (2005), Association of the human papillomavirus type 16 E7
-61-
oncoprotein with the 600-kDa retinoblastoma protein-associated factor, p600,
Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 102, 11492–11497. [20]. Hwang S. G., Lee D., Kim J., Seo T., and Choe J. (2002) Human
Papillomavirus Type 16 E7 Binds to E2F1 and Activates E2F1-driven Transcription in a Retinoblastoma Protein-independent Manner, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, 2923–2930.
[21]. Janeway, Travers, Walport, Shlomchik (2005), Immuno Biology 6th edition, Garland Science, USA.
[22]. Jeon1 J. H., Shin D, Yup Cho S., Song K., Park N., Kang H., Kim Y. D., Kim I. (2007), Immunocytochemical detection of HPV16 E7 in cervical smear,
Experimental and molecular medicine, 39(5):621-628.
[23]. Kuby (2003), Immunology 5th edition, W.H. Freeman and Company. [24]. Longworth M. S., Laimins L. A. (2004), Pathogenesis of Human
Papillomaviruses in Differentiating Epithelia, Microbiology and Molecular Biology reviews, 68(2), 362-372.
[25]. Pellgrini A., Guinazú N, Aoki M. P., Calero I. C., Carrera-Silva E. A., Girones N., Fresno M., Gea S. (2007), Spleen B cells from BALB/c are more prone to activation than spleen B cells from C57BL/6 mice during a secondary immune response to cruzipain, International Immunology, 19(12): 1385-1402. [26]. Seedorf K., Oltersdorf T., Krammer G., Rowekamp W. (1987),
Identification of early proteins of the human papilloma viruses type 16 (HPV 16) and type 18 (HPV 18) in cervical carcinoma cells, The EMBO Journal, 6 (1): 139-144.
[27]. Selvey L. A., Dunn L. A., Murray B., Tindle R. W., Frazer I. H. (1992), An ELISA capture assay for the E7 transforming proteins of HPV16 and HPV18, Journal of Virological Methods , 37(2): 119-127.
-62-
[28]. Stanley M. A., Pett M. R., Coleman N. (2007), HPV: from infection to cancer, Biochemical Society Transactions, 35(6): 1456-1460.
[29]. Swan D. C., Rejeevan M., Tortolero-Luna G., Follen M., Tucker R. A., Unger E. R. (2005), Gynecologic Oncology, 96 : 695-700.
[30]. Wlazlo A. P., Giles-Davis V., Clements A, Struble G., Marmorstein R. (2001), Generation and Characterization of Monoclonal Antibodies Against the E6 and E7 Oncoproteins of HPV, Hybridoma, 20(4):257-263
[31]. Wojcieszyn J. W., Schlegel R. A., Lumley-Sapanski K., Jacobson K. A. (1983). Studies on the mechanism of cell fusion using fluorescent probes polyethylene glycol-mediated membrane and cytoplasmic, Journal of Cell Biology, 96: 151-159.
[32]. WHO (2010), Human Papillomavirus and Related Cancers, Summary Report Update. September 15, 2010.
TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[33]. Trần Lê Sơn, Nguyễn Vũ Trung Kiên, Ngô Thái Bích Vân, Bùi Hoàng Bảo Ngọc, Đặng Trần Ngọc Linh, Phạm Xuân Dũng, Nguyễn Chấn Hùng, Jean- Luc Teillaud, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2010).Tạo kháng thể đơn dòng kháng protein E7 của virus gây u nhú (Human papillomavirus) type 18. Tạp chí Công nghệ sinh học, 1793 – 1800.
TÀI LIỆU INTERNET