2.1.4.1. Hóa chất
Dùng để gây đáp ứng miễn dịch trên động vật và thu nhận huyết thanh
- Tá chất Freund complete adjuvant, Freund incomplete adjuvant (Sigma).
- Dung dịch PBS (-) 1X, KH2PO4 (1,47 mM), Na2HPO4.2H2O (10 mM), KCl (2,7 mM), NaCl (137 mM), dung dịch PBS – BSA 1% (PBS 1X + bovine serum albumin (BSA) (Sigma) 1%), dung dịch PBS – Tween 0,05 % (PBS 1X + Tween 20 (Merck) 0,05% )
Dùng trong ELISA kiểm tra đáp ứng miễn dịch của động vật
- Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu alkaline phosphatase (Southern Biotech).
- Cơ chất của enzyme alkaline phosphatase, với thành phần như sau:
+ Dung dịch pha cơ chất pH 9,8: Diethanolamine (Merck) 48,5 ml, MgCl2
4M 62,5 μl, ddH2O 500 ml.
+ Cơ chất (Phosphatase substrate) (Sigma): cho một viên cơ chất vào 5 ml dung dịch pha cơ chất. Lắc đến tan. Bảo quản ở -20C, tránh sáng.
Dùng cho dung hợp tạo tế bào hydridoma:
PEG 1500 (Sigma), dung dịch NH4Cl 0,17 M (Merck), HAT 50X (Sigma), HT 50X (Sigma), Trypan blue (Sigma).
Hóa chất dùng trong tinh sạch kháng thể đơn dòng
Bộ kit xác định isotype Isotrip (BD), cột Sepharose gắn protein G (GE Health Care), cột Sepharose gắn protein A (GE Health Care), dung dịch gắn cột (Tris-HCl 0,1 M; pH 7,5; NaCl 0,15 M), dung dịch dung giải (glycine 0,1 M; pH 2,8), dung dịch trung hòa (Tris-HCl 1 M; pH 9,0)
-28-
Thang protein
Hình 2.1. Thang phân tử protein (Fermentas)
Dùng cho điện di protein
- Gel phân tách (separating gel): acrylamide 12 %: 3,3 ml dH2O; 4 ml acrylamide 30 %; 2,5 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8); 0,1 ml SDS 10 %; 0,1 ml APS 10 %; 30 µl TEMED.
- Gel gom (stacking gel): 2,8 ml dH2O; 0,66 ml acrylamide 30 %; 0,5 ml Tris- HCl 1M (pH 6,8); 0,04 ml SDS 10 %; 0,04 ml APS 10 %; 16 µl TEMED.
- Dung dịch nạp mẫu 5X (giữ ở 4oC): SDS 10 % (w/v); DTT 10 mM; Tris-HCl 0,2 M (pH 6,8); glycerol 20 % (v/v); bromophenol blue 0,05 %.
- Dung dịch điện di 5X (giữ ở nhiệt độ phòng): 15,1 g Tris-base; 94 g glycine; 5 g SDS; thêm dH2O cho đủ 1 l.
- Dung dịch nhuộm gel (giữ ở nhiệt độ phòng): 0,625 g coomassie brilliant blue; 112,5 ml ethanol tuyệt đối; 25 ml glacial acetic acid; thêm dH2O cho đủ 250 ml.
- Dung dịch giải nhuộm (giữ ở nhiệt độ phòng): 100 ml glacial acetic acid, 100 ml ethanol tuyệt đối, 800 ml dH2O.
-29-
Hóa chất dùng cho Western blot
- Dung dịch điện chuyển 1X (giữ ở 4oC): 3,03 g Tris-base; 14,41 g glycine; 200 ml methanol; thêm dH2O cho đủ 1 l.
- Dung dịch TBS 1X: 0,605 g Tris-base; 4,39 g NaCl; thêm dH2O đủ 500 ml. - Dung dịch TBST (dung dịch rửa): TBS + Tween 20 (1%).
- Dung dịch khóa màng (membrane blocking): TBST + sữa gầy (5%).
- Kháng thể đa dòng kháng IgG chuột đánh dấu horseradish peroxidase (Santa Cruz biotechnology).
- KTĐD thương mại kháng protein E7 HPV-16 (Santa Cruz biotechnology). - Dung dịch cơ chất của peroxidase: SuperSignal west femto maximum sensitivity substrate (Pierce - Thermo Scientific). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Dung dịch ly giải tế bào (bảo quản ở -20oC): HaltTM Protease Inhibitor Cocktail 100X (Pierce - Thermo Scientific).
- Dung dịch IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside) 100 mM (giữ ở -20oC) (Fermentas).
Hóa chất chuyển gene vào tế bào CHO-K1 và lai miễn dịch huỳnh quang
Lipofectamine 2000 (Invitrogen), Poly-L-Lysine (Sigma), PBS – PFA 3% (PBS bổ sung paraformaldehyde nồng độ cuối 3%), PBS – Triton X100 0,2% (PBS bổ sung Triton X100 nồng độ cuối 0,2%).
Hóa chất dùng cho lai miễn dịch huỳnh quang
- Blocking PBS-BSA (Sigma) 1%. - Chất cố định tế bào: PFA (Sigma) 3%.
-30-
- Chất thấm màng PBS saponin (Sigma) 0,05%.
- Kháng thể kháng protein E7 HPV-16 (Santa Cruz biotechnology).
- Kháng thể thứ cấp là kháng thể thỏ kháng IgG chuột cộng hợp với chất phát huỳnh quang TRITC.
- Chất nhuộm nhân Hoechst 33342 (BioChem).
2.1.4.2. Môi trường
- Môi trường RPMI 1640 - GlutaMax (Gibco) nuôi cấy tế bào CaSki và tế bào C33A bổ sung huyết thanh (FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10 %, Penicilin - Streptomycin (Gibco) 1%, HEPES (Gibco) 1%.
- Môi trường RPMI 1640 - GlutaMax (Gibco) nuôi cấy tế bào u tủy P3X63Ag8.653 bổ sung huyết thanh (FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10%, Penicilin - Streptomycin (Gibco) 1%, HEPES (Gibco) 1%.
- Môi trường chọn lọc : môi trường HAT dùng chọn lọc tế bào lai là môi trường RPMI 1640 - GlutaMax (Gibco) bổ sung các thành phần dung dịch HAT 1X (Hypoxanthine 1 x 10-4 M; Aminopterin 4 x 10-7 M; Thymidine 1,6 x 10-5 M; (Sigma), huyết thanh (FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10%, Penicilin-Streptomycin (Gibco) 1%, HEPES (Gibco) 1%, NCTC 109 (Sigma) 10%, amino acid không thiết yếu (Sigma) 1%.
- Môi trường HT gồm các thành phần môi trường sau: RPMI 1640 - GlutaMax (Gibco) bổ sung các thành phần dung dịch HT 1X (Hypoxanthine 1 x 10-4 M;
Thymidine 1,6 x 10-5 M; (Sigma), huyết thanh (FBS – fetal bovine serum, Gibco) 10 %, Penicilin-Streptomycin (Gibco) 1%, HEPES (Gibco) 1%, NCTC 109 (Sigma) 10%, amino acid không thiết yếu (Sigma) 1%.
-31-