Chương 1 Axit amin, Protein

a Đối tượng nghiên cứu: 2 cách phân chia Hóa sinh là khoa học nghiên cứu cơ sở phân tử của sự sống: thành phần cấu tạo hóa học Tĩnh hóa sinh, quá trình chuyển hóa các chất trong tế bào

BÀI MỞ ĐẦU Đối tượng, phương pháp, lịch sử nghiên cứu của Hóa sinh

a) Đối tượng nghiên cứu: 2 cách phân chia

Hóa sinh là khoa học nghiên cứu cơ sở phân tử của sự sống: thành phần cấu tạo hóa học (Tĩnh hóa sinh), quá trình chuyển hóa các chất trong tế bào và cơ thể sống (Động hóa sinh), cơ sở hóa học của các quá trình hoạt động sống (Hóa sinh chức năng)

Tùy theo đối tượng sinh vật được nghiên cứu có thể phân chia thành: Hóa sinh động vật, Hóa sinh thực vật, Hóa sinh vi sinh vật,…

b) Phương pháp nghiên cứu Hóa sinh:

- Phương pháp truyền thống: hóa học, hóa lí

- Phương pháp vật lý hiện đại: nhiễu xạ rơnghen, cộng hưởng từ điện tử, cộng hưởng

từ hạt nhân, đồng vị phóng xạ đánh dấu các chất,…

c) Lịch sử nghiên cứu hóa sinh:

Các nghiên cứu hóa sinh đã bắt đầu từ cuối thế kỷ 18 Tuy nhiên, mãi đến cuối thế kỉ

19 đầu thế kỉ 20 Hóa sinh mới trở thành một ngành khoa học độc lập dựa trên những thành tựu nghiên cứu của Hóa hữu cơ, Sinh lí học, Y học và các nghành khoa học khác

- Nửa cuối thế kỉ 19: Đã có những nghiên cứu và dẫn liệu về cấu trúc axit amin, xacarit, lipit, bản chất của liên kết peptit; bắt đầu có những nghiên cứu về axit nucleic; quá trình chuyển hóa các chất trong cơ thể sống, đặc biệt là quá trình lên men: Năm 1879 Bucne (Buchner E.) đặt thí nghiệm lên men vô bào

- Nửa đầu thế kỉ 20: Đã đạt được nhiều thành tựu về Hóa sinh dinh dưỡng, phát hiện một số bệnh liên quan dinh dưỡng không đủ chất Phát hiện các vitamin, hoocmon và xác định vai trò của chúng trong cơ thể Xác định được bản chất hóa học của enzyme là protein, các phản ứng của quá trình lên men và oxi hóa sinh học

- Đến năm 1950, về cơ bản đã xác định được tính chất các chất chủ yếu cấu tạo nên

cơ thể sống và các con đường chuyển hóa chúng trong cơ thể

- Từ sau 1950 đến nay đã đạt được những thành tựu đáng kể trong nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, axit nucleic, liên quan giữa cấu trúc và chức năng, xây dựng lí

thuyết về các chất xúc tác sinh học; đề ra được cơ chế quá trình tổng hợp protein, axit nucleic và cơ chế điều hòa các quá trình sinh tổng hợp này

- Trong 20 năm gần đây đã tổng hợp được một số protein có hoạt tính sinh học bằng phương pháp hóa học, công nghệ sinh học Ví dụ: insulin là một protein có hoạt tính hormone (làm giảm đường trong máu, được sử dụng điều trị bệnh đái tháo đường)

- Từ năm 1961 - 1966 có hàng loạt các công trình nghiên cứu cấu trúc phân tử axit nucleic và vai trò của chúng trong quá trình tổng hợp protein Năm 1961 đã đề ra được

mô hình điều hòa hoạt động gen

- Từ năm 1970 đã bắt đầu nghiên cứu tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học và lần đầu tiên Khorana đã tổng hợp được polinucleotit 2 sợi, tương ứng với gen tổng hợp ARNvc alanin của nấm men

Phương hướng nhiệm vụ nghiên cứu Hóa sinh

Những phương hướng nghiên cứu chủ yếu của Hóa sinh học ngày nay là tiếp tục tìm hiểu quá trình sinh tổng hợp axit nucleic và protein, sự liên quan giữa biến đổi di truyền với các quá trình bệnh lí; đặc tính các quá trình trao đổi trung gian, cơ chế điều hòa của tế bào, cơ chế tác dụng của hormone nhằm tiến đến chủ động điều khiển mọi hoạt động và quá trình sống theo hướng có lợi nhất, nhằm bảo vệ môi sinh, bảo vệ con người; mô hình hóa các quá trình sống, thực hiện các quá trình sống ở quy mô công nghiệp, tạo ra ngày càng nhiều các chế phẩm sinh học, các sản phẩm có giá trị để dùng trong y học, nông nghiệp, công nghiệp Hóa sinh góp phần giải quyết các vấn đề quan trọng của trồng trọt, chăn nuôi và y học

Thực trạng và tình hình nghiên cứu Hóa sinh ở Việt nam

Ở nước ta, trong 45 năm qua Hóa sinh đã có những đóng góp nhất định vào các lĩnh vực y học, nông, lâm, ngư nghiệp, công nghiệp thực phẩm và cũng đã có được một số đóng góp cho sự phát triển Hóa sinh học của thế giới

Các kết quả nghiên cứu hóa sinh ở nước ta trong thời gian qua tập trung vào một số vấn đề sau:

a) Về hóa sinh thực vật: đã có những nghiên cứu điều tra hóa sinh một số cây quan

trọng như lúa, đỗ tương, lạc và các loại cây họ đậu khác nhằm phục vụ việc nâng cao năng suất, chất lượng dinh dưỡng của hạt, nâng cao hiệu quả sử dụng chúng Mặt khác, cũng đã có các nghiên cứu nhằm nâng cao tính chống chịu của những cây trồng quan trọng

b) Về Hóa sinh động vật: Các nghiên cứu tập trung phục vụ lai tạo giống bò, tìm hiểu

cơ chế một số bệnh ở lợn, gà và phương pháp phòng trừ; các chế phẩm làm tăng khối lượng thịt lợn, gà và các chế phẩm làm tăng tính miễn dịch của động vật

Đặc biệt, các nghiên cứu theo hướng tách, tinh sạch enzyme, tạo ra các chế phẩm có

độ sạch khác nhau, nghiên cứu tính chất, cấu trúc, liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của enzyme, khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme trong thực tế, ví dụ: bromelin (proteaza của dứa), pepsin, tripsin hoặc chế phẩm pancreatin, glutamilaz vi sinh vật… chủ yếu ứng dụng trong công nghệ thực phẩm, trong y học

Ngoài enzyme, có các nghiên cứu cơ bản một số protein có hoạt tính sinh học như protein ức chế tripsin

c) Xác định các chỉ tiêu hóa sinh của người Việt nam, những biến đổi của các chỉ tiêu

này ở các trạng thái sinh lí, bệnh lí khác nhau hoặc dưới tác dụng của các yếu tố môi trường (chất độc hóa học, bức xạ siêu cao tần v.v.)

+ Áp dụng, cải tiến, xây dựng các phương pháp kĩ thuật hóa sinh hiện đại, đơn giản,

nhanh, phục vụ cho công tác xét nghiệm hóa sinh để phòng và chữa trị bệnh kịp thời cũng như nghiên cứu cơ bản

Những đặc điểm chính của tế bào, cơ thể sống, sự tương tác giữa cơ thể sống và môi trường

a) Đặc điểm chung về thành phần hóa học của cơ thể sống: 3 đặc điểm

+ Hàm lượng nước khá lớn: ở người 58-65%, nhiều loài cá hơn 80%, sứa đến 98% + Thành phần nguyên tố: Trong cơ thể sống hiện nay tìm thấy 27 trong số gần 100

nguyên tố đã biết

Các nguyên tố có trong thành phần các hợp chất hữu cơ của tế bào và cơ thể sống là

C, H, O, N, P, S Hàm lượng C là 43-48%, H: 7%, N: 8-12% Một số nguyên tố ở dạng ion: Na+, K+, Mg+, Ca+, Cl-, các nguyên tố khác (Mn, Fe, Co, Cu, Zn, B, Al, Mo, I, Si, Sn,

Cr, F, Se, Vd) chỉ với lượng nhỏ, gọi là các nguyên tố vi lượng

Như vậy ta thấy có sự sai khác rõ rệt về thành phần nguyên tố giữa thế giới sống và không sống như sau:

- Bốn nguyên tố chủ yếu trong tế bào và cơ thể sống là C, N, O, H trong khi đó bốn nguyên tố chủ yếu của vỏ trái đất là O, Si, Al, Fe

- Các nguyên tố C và N của cơ thể sống thường ở dạng khử, trong các hợp chất hữu

cơ phức tạp; còn ở môi trường ngoài hệ thống sống chúng thường tồn tại ở dạng các hợp chất đơn giản như CO2, N2, cacbonat, nitrat, v.v

+ Các hợp chất hữu cơ trong cơ thể sống thường có cấu tạo rất phức tạp, khối lượng

phân tử lớn và rất đa dạng Ví dụ: vi khuẩn E Coli nhỏ bé nhưng chứa gần 5000 kiểu hợp chất hữu cơ khác nhau, trong đó có 3000 protein khác nhau Ở người có đến 100000 loại protein khác nhau nhưng chưa tìm thấy một protein nào của người hoàn toàn giống với một trong 3000 protein của E Coli, mặc dầu các protein có chức năng tương tự nhau

Trong thế giới sống có khoảng 1,5 triệu loài (species), khoảng 1010 - 1012 loại phân tử protein khác nhau và khoảng 1010

kiểu phân tử axit nucleic

b) Đặc điểm các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống

Hầu hết các phản ứng đều do enzyme xúc tác, vì vậy chúng có một số đặc điểm chung như sau: 3 đặc điểm

- Có thể xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường với tốc độ nhanh gấp hàng trăm, hàng nghìn lần khi xẩy ra ngoài cơ thể sống

- Nhiều phản ứng khác nhau có thể tiến hành đồng thời trong một phạm vi môi trường nhất định, liên hệ chặt chẽ với nhau theo một trình tự xác định

- Các phản ứng, các quá trình chuyển hóa được điều hòa nghiêm ngặt theo những cơ chế tinh vi phức tạp, các sản phẩm phản ứng, sản phẩm trao đổi trung gian cũng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tự điều hòa này

c) Sự liên kết chặt chẽ giữa cơ thể sống và môi trường

Thành phần cơ bản của các tế bào và cơ thể sống nằm trong một hệ thống liên hệ và tương tác chặt chẽ với thiên nhiên môi trường xung quanh

Ví dụ chu trình cacbon, chu trình nitơ:

+ Khí CO2 trong khí quyển được thực vật hấp thụ  động vật  CO2 vào khí quyển Lượng CO2 do 1 tỉ người trên hành tinh thải ra là 2,9 ×1011 kg/năm, tương đương lượng CO2 thoát ra khi đốt 115 triệu tấn than Vi khuẩn hô hấp còn mạnh hơn người vài trăm lần

+ N2 của khí quyển đưa vào cơ thể sống nhờ các vi sinh vật cố định nitơ, chuyển N2thành dạng nitrit, nitrat, acid amin thực vật Kết quả của quá trình đồng hóa, dị hóa ở cơ thể sinh vật, tác dụng của vi sinh vật lại tạo thành N2 đi vào khí quyển

d) Sơ lược về Hóa sinh dinh dưỡng và tình trạng thiếu dinh dưỡng hiện nay

Để đảm bảo cho tế bào và cơ thể sống tồn tại, cần có một chế độ dinh dưỡng đủ năng lượng, đủ chất, có tỉ lệ cân đối giữa các thành phần dinh dưỡng trong khẩu phần

Mỗi chất dinh dưỡng có thể được sử dụng cho nhiều quá trình khác nhau trong cơ thể Tuy nhiên vai trò chủ yếu của mỗi chất lại khác nhau: 1 g lipit cung cấp 9 kcal trong khi 1 g protein hoặc xacarit chỉ cung cấp 4 kcal

- protein cần cho quá trình tăng trưởng

- lipit và xacarit cung cấp năng lượng

- vitamin có thể nói một cách khái quát là có vai trò bồi bổ sức khỏe

Theo nhiều tài liệu, tương quan giữa protein : lipit : xacarit trong khẩu phần nên là 1:1:5 hoặc 1:1:4 là cân đối dinh dưỡng và năng lượng

Nếu ăn không đủ năng lượng và không đủ các chất dinh dưỡng cần thiết trong một thời gian tương đối dài sẽ bị “thiếu dinh dưỡng”

Theo tổ chức y tế thế giới có 4 loại bệnh thiếu dinh dưỡng quan trọng nhất hiện nay là:

- thiếu dinh dưỡng protein năng lượng

- bệnh khô mắt do thiếu vitamin A

- thiếu máu dinh dưỡng do thiếu sắt

- bệnh biếu cổ địa phương và bệnh kém trí tuệ do thiếu iot

Đặc biệt, tình trạng thiếu dinh dưỡng phổ biến ở các nước đang phát triển là vấn đề rất nghiêm trọng đang được quan tâm giải quyết bằng giải pháp của các nghành: y tế, nông nghiệp và giáo dục

CHƯƠNG I – HÓA SINH AXIT AMIN VÀ PROTEIN 1.1 AXIT AMIN

1.1.1 Cấu tạo hóa học axit amin

Protein là một hợp chất đại phân tử được tạo thành từ rất nhiều các đơn phân là các axit amin Axit amin được cấu tạo bởi ba thành phần: một là nhóm amin (-NH2), hai là nhóm cacboxyl (-COOH) và cuối cùng là nguyên tử cacbon trung tâm đính với 1 nguyên

tử hyđro và nhóm biến đổi R quyết định tính chất của axit amin

- Axit amin thực chất là một axit hữu cơ, trong đó một nguyên tử hiđro của gốc cacbonalpha được thay thế bởi nhóm -NH2 (C - α)

- Axit amin là những dẫn xuất của axit hữu cơ, trong đó có một nguyên tử hydro (đôi khi 2 nguyên tử H) của gốc alkil được thay thế bởi nhóm (-NH2)

- Các axit amin trong thành phần protein đều là các axit amin, có công thức cấu tạo chung như sau:

R – gốc hyđrocarbon (mạch thẳng, mạch vòng), gốc R có thể chứa các nhóm chức như: -COOH, -NH2, -OH, -SH,

- Tuỳ theo nhóm –NH2 đính vào vị trí nào của nguyên tử C trong gốc R so với gốc –COOH mà ta có α, β, γ… amino axit Cũng tùy theo vị trí đính của nhóm –NH2 bên phải hay bên trái ta có axit amin đồng phân L hay D, thường gặp là L

- Nếu trong phân tử có 1 nhóm –NH2 gọi là monoamin, 1 nhóm –COOH là monocacboxyl Nếu trong phân tử có 2 nhóm –NH2 gọi là diamin, 2 nhóm –COOH là dicacboxyl

- Các axit amin chỉ khác nhau bởi mạch bên R

- Protein rất đa dạng nhưng hầu hết chúng được cấu tạo từ 20 L –α-axit amin

Công thức cấu tạo của 20 axit amin trong thành phần protein được giới thiệu trong bảng 1.1 Riêng Prolin nhóm –NH2 gắn với C – α một liên kết N-H được thay thế bằng liên kết N-C tạo thành dạng mạch vòng, do vậy, sự có mặt của prolin trong mạch phân tử thường có xu hướng làm gập mạch

1.1.2 Phân loại axit amin

Dựa vào cấu tạo và tính chất của gốc R có thể chia axit amin thành 4 nhóm sau đây:

- axit amin chứa gốc R không phân cực hay kị nước

- axit amin chứa gốc R phân cực không tích điện

- axit amin chứa gốc R tích điện âm

- axit amin chứa gốc R tích điện dương

Bảng 1.1 – Công thức cấu tạo của các axit amin thường gặp trong protein

Ngoài 20 axit amin đã nêu trong bảng 1.1, trong một số protein có thể còn chứa một

số loại axit amin ít gặp khác như hydroxypolin trong collagen, cacboxylglutamic trong protrombin, Người ta thấy rằng, có một số axit amin có thể không hiện diện trong thành phần cấu tạo của protein nhưng có mặt trong cơ thể sống và đóng vai trò quan trọng trong

sự chuyển hóa các chất, vai trò của nhiều axit amin loại này được tìm thấy ở các loài động vật có vú như Ornithin, Citrullin, β-Alanin,

1.1.3 Tính chất của axit amin

a) Tính tan

Do sự có mặt của các nhóm mang điện tích nên các axit amin dễ tan trong các dung môi phân cực như nước, rượu Khả năng tan của mỗi loại axit amin là khác nhau Axit amin không tan trong các dung môi không phân cực như benzen, ete, NH3 lỏng là dung môi tốt nhất cho các axit amin

Các axit amin có mặt trong thành phần cấu tạo protein đều có khả năng kết tinh, tinh thể bền ở nhiệt độ 20÷250

C

b) Tính hoạt quang

Trừ glyxin, còn lại tất cả các axit amin đều có chứa nguyên tử carbon bất đối nên chúng đều là những chất hoạt quang Chúng có thể tồn tại dưới 2 dạng đồng phân quang học là D và L Phần lớn axit amin trong cơ thể sống đều nằm ở dạng L, nên dạng L là dạng mà cơ thể dễ dàng hấp thụ, cơ thể không hấp thụ nhiều axit amin dạng D, riêng D-methionine và D-phenylalanine thì cơ thể người có thể hấp thụ được

Các dạng đồng phân D và L của một axit amin có cấu trúc đối xứng qua gương phẳng E Fisher mô tả 2 dạng đồng phân quang học này như sau:

L – Aminoacid D – Aminoacid

Theo kiểu diễn đạt này liên kết nết đậm là các liên kết trên mặt phẳng nằm ngang hướng về phía người đọc, còn các liên kết nét nhỏ là những liên kết nằm phía trên (nhóm -COOH) và phía dưới (gốc R) của mặt phẳng này Để thuận tiện hơn, Fisher cũng đề xuất một cách diễn đạt khác gọi là công thức hình chiếu, trong đó cả 4 hóa trị của nguyên tử carbon bất đối đều được biểu diễn bằng các gạch nối nét nhỏ như nhau, vị trí của các nguyên tử và nhóm nguyên tử được giữ nguyên như trên Ví dụ L-alanine được biểu diễn như sau:

L- alanine

Hoạt tính quang học của mỗi chất liên quan với cấu trúc bất đối của nó, hay nói cách khác, vị trí của các nguyên tử trong phân tử của chất đó Kết quả là mỗi dạng đồng phân quang học có khả năng xoay mặt phẳng của tia sáng phân cực một góc nhất định sang trái (-) hoặc sang phải (+)

c) Tính chất lƣỡng tính

Axit amin và protein có tính chất lưỡng tính, có nghĩa là vừa có tính axit vừa có tính bazơ Theo thuyết Brensted, một chất có tính chất axit có khả năng cho proton, phản ứng với bazơ tạo thành muối Tính chất bazơ thể hiện ở khả năng nhận proton, kết hợp với axit tạo thành muối

Như vậy, axit amin chứa hai nhóm chức -COOH và –NH2 nên chúng có tính điện li lưỡng tính Tùy thuộc vào sự thay đổi pH môi trường mà chúng có thể tồn tại ở 3 dạng ion khác nhau Ví dụ: trong phân tử của một axit amin có chứa một nhóm -COOH và một nhóm -NH2 thì quá trình điện li có thể biểu diễn như sau:

Như vậy, khi đặt axit amin trong điện trường tùy thuộc pH môi trường, nó có thể di chuyển về Katot hoặc Anot Ở một pH nào đó, axit amin không di chuyển trong điện trường, chứng tỏ tổng số điện tích trong phân tử của nó bằng không, pH này được gọi là

pH đẳng điện của axit amin, kí hiệu là pHi

Các axit amin chứa một nhóm amin, một nhóm carboxyl, mạch bên không phân cực (Ala, Val, Leu, Ile) có giá trị pHi = 6, axit amin có 2 nhóm carboxyl (Asp, Glu) thì pHi ở vùng axit, ngược lại các axit amin kiềm, pHi ở vùng kiềm (Bảng 1.2)

Bảng 1.2 - Giá trị pHi của một số axit amin

Asp (D) Glu (E) Cys (C) Ser (S) Val (V) Gly (G) Leu (L) Ala (A) Ile (I) Lys (K) Arg (R)

2.77 3.22 5.07 5.68 5.96 5.97 4.98 6.02 6.02 9.74 10.76

Tương tự như axit amin, protein cũng là chất điện li lưỡng tính, vì trong phân tử protein còn có nhiều nhóm phân cực mạch bên (gốc R) của axit amin Ví dụ nhóm cacboxyl thứ 2 của Asp, Glu, nhóm amin của Lys, guanidin của Arg, imidazol của His, hidroxyl của Ser, Thr, Tyr, Trạng thái tích điện của các nhóm này cũng tùy thuộc vào

pH môi trường Ở một pH nào đó mà tổng số điện tích dương và điện tích âm của phân tử protein bằng không, phân tử protein không di chuyển trong điện trường, gọi là pHi của protein (bảng 1.3)

Bảng 1.3 - Giá trị pHi của một số protein

số điện tích âm lớn hơn số điện tích dương, protein là đa Anion, tích điện âm

Ở trong môi trường có pH = pHi, protein dễ dàng kết tụ với nhau cho nên có thể sử dụng tính chất này để xác định pHi của protein cũng như để kết tủa protein Mặt khác, do

sự sai khác về pHi, giữa các protein khác nhau, có thể điều chỉnh pH môi trường để tách riêng các protein ra khỏi hỗn hợp của chúng

d) Một số tính chất hóa học của axit amin

Các axit amin chứa 2 nhóm chức là –NH2 và -COOH nên chúng có một số tính chất đặc chưng của các nhóm này, đồng thời cũng có những tính chất riêng do gốc -R của một

số axit amin có những nhóm chức chuyên biệt riêng tạo nên

- Phản ứng khử nhóm carboxyl: Khi tác dụng với Ba(OH)2 với sự có mặt của enzyme decarboxylase thu được amin tương ứng:

Phản ứng có thể viết

dưới dạng tổng quát:

Các amin tạo thành sau phản ứng có số nguyên tử carbon nhỏ hơn số nguyên tử carbon của axit amin ban đầu là 1 Một số amin như cardaverin được tạo thành từ lysinne, histamine được tạo thành từ histidine là những chất độc (Histamine có nguồn gốc từ quá trình decarboxy hóa của axít amin histidine, phản ứng được xúc tác bởi enzyme L-histidine decarboxylase Nó là một amin có tính hút nước và tính gây giãn mạch, ở đàn ông có mức histamine cao có thể sẽ bị chứng xuất tinh sớm)

Axit amin tạo phức với các ion kim loại: Muối axit amin với Pb, Hg, Ag là những chất không tan trong nước Đây là một tính chất mà người ta sử dụng để tách axit amin ra khỏi hỗn hợp

Dưới tác dụng của các tác nhân khử mạnh, ví dụ như borhydrate natri, aminoacid bị khử thành rượu amin tương ứng:

Hoặc kết hợp với amoniac để tạo ra amide:

Hai phản ứng này cũng thường được sử dụng để xác định trật tự aminoacid trong chuỗi polipeptit từ đầu tận cùng chứa nhóm -COOH tự do (C-tận cùng)

- Các phản ứng của nhóm α - amine:

+ Phản ứng với HNO2 tạo nên oxyacid tương ứng, nitơ tự do và nước:

+ Phản ứng với aldehyde, ví dụ formandehyde, để tạo ra các hợp chất linh động có tên chung là hợp chất Schiff:

Hai phản ứng này thường được dùng để định lượng aminoacid tự do

Phản ứng này rất nhạy và được dùng để định lượng aminoacid bằng phương pháp sắc

kí và điện di trên giấy

Proline và oxyproline tạo ra với ninhydrin các sản phẩm màu vàng

+ Phản ứng Sanger:

Phản ứng này được Sanger (1953) dùng để xác định trật tự aminoacid của chuỗi polypeptide từ đầu N-tận cùng, tức đầu tận cùng chứa nhóm NH2 tự do

Tương tự, phản ứng với 1- dimethylaminophtalin--sunfonylchloride (gọi tắt là dansyl-chloride):

1.1.4 Sự tạo thành liên kết peptit

Liên kết peptit được tạo thành do sự kết hợp giữa nhóm α-carboxyl của axit amin này với nhóm α-amin của axit amin kia và đồng thời, một phân tử nước bị loại ra Khi 2 axit amin kết hợp với nhau sẽ tạo thành một di-peptit Nếu di-peptit này kết hợp thêm với một axit amin nữa sẽ tạo ra tri-peptit Quá trình phản ứng tiếp tục tiếp diễn sẽ tạo thành

tetrapeptide, , polypeptit Như vậy nếu có n phân tử axit amin kết hợp với nhau thì sẽ tạo thành được (n-1) phân tử nước Từ 2 axit amin có thể tạo thành 2 loại dipeptit, từ 3 axit amin có thể tạo thành 6 loại tripeptit và từ n axit amin có thể tạo thành n! peptit (Pn = n! = 1.2.3 n)

Hình 1.1 – Đặc điểm của liên kết peptide

Sự hình thành mạch polypeptit diễn ra trong cơ thể sống là một quá trình phức tạp có

sự tham gia của nhiều enzyme - đó là quá trình tổng hợp protein

Để gọi tên các peptit nhỏ theo các gốc axit amin, người ta thường bắt đầu bằng tên axit amin có nhóm –NH2 tự do và kết thúc bằng tên của axit amin có chứa nhóm -COOH

tự do Các axit amin có nhóm -COOH tham gia tạo thành liên kết peptit thì tên gọi sẽ có tận cùng bằng -YL

Ví dụ: Alanine-Serine-Valine-Glycine  gọi là: Alanyl-Seryl-Valyl-Glycine

Qua cách gọi tên, ta nhận biết ngay trong chuổi peptit trên đầu Alanyl- có nhóm –

NH2 tự do và đầu Glycine có nhóm -COOH tự do Để biểu thị thành phần và trình tự sắp xếp của các axit amin trong chuỗi polypeptit người ta còn dùng kí hiệu 3 chữ cái hoặc kí hiêu 1 chữ cái của các axit amin viết liền nhau theo quy luật xác định, bắt đầu từ đầu có nhóm –NH2 đến đầu có nhóm -COOH

Ngoài ra, còn tồn tại một số tên riêng như: Glutathion là Tripeptit Cysteinyl-Glycine hay Glucagon là một polypeptit gồm 29 axit amin

Glutamyl-Phản ứng màu đặc trƣng của liên kết peptit: Glutamyl-Phản ứng Biure là phản ứng đặc

trưng của liên kết peptide Tất cả các chất có chứa từ hai liên kết peptit trở lên đều cho phản ứng này Trong môi trường kiềm mạnh có gia nhiệt, các chất có chứa từ hai liên kết peptide trở lên tác dụng với CuSO4 tạo ra phức chất có màu tím hoặc tím đỏ Phức chất này có cực đại hấp thụ ở bước sóng 540µm Phản ứng này được sử dụng để định tính và định lượng protein Độ nhạy của phản ứng tăng lên nhiều lần khi có thuốc thử Folin-

Ciocalteau Phương pháp Lowry là phương pháp định lượng protein bằng cách sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteau Thuốc thử Folin- Ciocalteau có chứa axit phosphomolipdic

và axit phosphovonphramic, các chất này sẽ phản ứng với các gốc Tyr và Trp trong phân

tử protein, tạo phức có màu xanh, hấp thụ cực đại ở bước sóng 750 µm Trong phương pháp này, ở giai đoạn đầu thực hiện phản ứng Biure, sau đó mới cho thuốc thử vào Đây

là phương pháp có độ nhạy cao, được nhiều nhà nghiên cứu sử dụng (có thể phát hiện với nồng độ protein là 1µg/cm3)

1.1.5 Axit amin không thay thế: Thực vật và vi sinh vật có thể tổng hợp được axit

amin từ những hợp chất nitơ đơn giản nhất ở dạng nitrat Động vật không có khả năng này Trong cơ thể động vật, một số axit amin có thể được tạo ra trong quá trình chuyển hoá từ các axit amin hoặc từ hợp chất chứa nhóm amin đó là những axit amin thay thế (non-essential) Ngược lại, có những axit amin mà cơ thể không tự tổng hợp hoặc chuyển hoá được, chúng nhất thiết phải được đưa vào cơ thể bằng thức ăn, đó là những axit amin không thay thế (essential)

Khái niệm về axit amin không thay thế đã được William C.Rose và cộng sự (Đại học Tổng hợp Illinois - Mỹ) đề cập lần đầu tiên vào những năm 1916-1935 khi các ông dùng chuột để nghiên cứu về axit amin không thay thế và họ đã thành công trong việc nuôi gà bằng khẩu phần không chứa protein mà chỉ có hỗn hợp của 11 axit amin ở dạng tinh khiết hoá học Theo William C Rose, "Axit amin không thay thế là những axit amin không thể tổng hợp trong cơ thể gia súc với số lượng đầy đủ, đáp ứng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển bình thường của gia súc thuộc 1 loài"

Ở người có 12 axit amin không thay thế, trong đó: Người lớn có 10 axit amin không thay thế là: Isoleucine, Methionine, Leucine, Lysine, Phenylalanine, Threonine, Tryptophane, Valine, Glycine và Serine Ở trẻ em có thêm hai axit amin nữa là arginine

và histidine

Ngoài ra, Cystine và Tyrosine là 2 axit amin bán thay thế vì chúng có thể tổng hợp từ Methionine và Phenylalanine tương ứng

Một trong những tiêu chuẩn đánh giá chất lượng protein thực phẩm là đảm bảo đầy

đủ hàm lượng axit amin không thay thế và tỉ lệ cân đối giữa chúng trong protein

1.1.6 Phép phân tích định lƣợng axit amin

Các axit amin có thể định lượng bằng phương pháp phân tích hóa học, lý học, sinh học

a) Định lƣợng axit amin trong dịch thủy phân:

- Phương pháp ninhydrin: dùng thuốc thử ninhydrin đung nóng với axit amin → ninhydrin bị khử thành hợp chất có màu xanh tím, có độ hấp thụ mạnh ở λ=570 µm, riêng với prolin có màu vàng Phương pháp này dùng phát hiện và định lượng axit amin

- Phương pháp Kjeldahl: Vô cơ hóa axit amin bằng cách đun sôi trong H2SO4 đặc → dạng amonisunfat Dùng NaOH để kiềm hóa, NH3 được giải phóng Định lượng bằng axit chuẩn, suy ra nồng độ của axit amin

- Phương pháp Vanslyke: Dùng HNO3 để oxy hóa axit amin, sau đó đo lượng N2được giải phóng bằng máy đo khí đặc biệt

Axit amin + HNO3 → R-CHOH-COOH + H2O + N2 + H+

b) Phương pháp điện di, sắc kí phân tách hỗn hợp và xác định thành phần axit amin

- Phương pháp điện di: ứng dụng tính chất lưỡng tính của axit amin

+ Môi trường có pH = pH đẳng điện (pI), axit amin ở dạng lưỡng cực không di chuyển trong điện trường

+ Môi trường pH < pI, axit amin ở dạng Cation di chuyển về cực âm trong điện trường

+ Môi trường pH > pI, axit amin dạng anion di chuyển về cực dương trong điện trường

- Phương pháp sắc kí trên giấy hoặc bản mỏng: dựa vào tính chất di chuyển và phân

bố khác nhau của pha tĩnh và pha động của những hệ dung môi nhất định, phát hiện các vệt của axit amin bằng phản ứng ninhydrin

- Phương pháp sắc kí trên cột với nhựa trao đổi ion

- Phương pháp sắc kí lỏng cao áp

c) Xác định axit amin bằng phương pháp đặc hiệu:

Một số axit amin có các phản ứng màu đặc hiệu như sau:

- Phản ứng Xantoprotein: đặc trưng cho các axit amin vòng thơm như Tyr, Phe Dưới tác dụng của HNO3 đặc, các axit amin vòng thơm bị nitrat hóa → dẫn xuất ni-tơ vàng Thêm dung dịch kiềm → muối amino của dinitrotyrozin có màu vàng da cam

- Phản ứng Adamkievich: để nhận biết được triptophan (Trp) Trp trong môi trường axit tác dụng với aldehit tạo thành phẩm vật ngưng tụ có màu đặc trưng (màu tím đỏ)

- Phản ứng Polia: Nhận biết các axit amin chứa lưu huỳnh như Systeine, Systin, Metionine có trong phân tử protein Dưới tác dụng của nhiệt độ cao các axit amin chứa S kết hợp với kiềm → Na2S Để nhận biết Na2S ta cho axetat chì vào → PbS↓ nâu đen lắng xuống

chất hữu cơ nào và chính những đặc tính này bảo đảm chức năng “cơ sở sự sống” của protein Trình tự sắp xếp của các acid amin trong mạch phân tử protein được mã hóa trong bộ máy di truyền của tế bào, protein được tổng hợp trong tế bào sống

Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sinh vật

1.2.1 Vai trò sinh học, giá trị dinh dƣỡng của protein

a) Vai trò sinh học của protein:

Protein là thành phần không thể thiếu được của tất cả các cơ thể sống Protein là nền tảng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sinh vật Các chức năng quan trọng của protein gồm 8 chức năng như sau:

Xúc tác: Các protein có chức năng xúc tác phản ứng sinh học gọi là enzyme Hầu hết

các phản ứng của cơ thể sống từ những phản ứng đơn giản nhất như phản ứng hydrat hóa, phản ứng khử nhóm cacboxyl đến những phản ứng phức tạp như sao chép mã di truyền, đều do enzyme xúc tác Ví dụ: Các Enzyme thủy phân trong dạ dày phân giải thức ăn, Enzyme Amylase trong nước bọt phân giải tinh bột chín, Enzyme Pepsin phân giải Protein, Enzyme Lipase phân giải Lipid

Vận tải: Một số protein có vai trò như những “xe” vận chuyển Chúng có khả năng

liên kết và vận chuyển các chất trong cơ thể Như hemoglobin, mioglobin (ở động vật có xương sống) có khả năng liên kết với O2 và đưa chúng đến khắp các mô và cơ quan trong

cơ thể hay vận chuyển ngược lại CO2 về phổi để thải ra ngoài

Protein đóng vai trò quan trọng trong việc vận chuyển các chất dinh dưỡng qua thành ruột vào máu và từ máu đi đến các tế bào trong cơ thể Protein vận chuyển nhiều thành phần khác nhau trong cơ thể, ví dụ: lipoprotein là chất mang các phân tử lipit, protein-metalothionin là chất vận chuyển ion đồng hoặc kẽm

Chuyển động: Nhiều protein trực tiếp tham gia vào quá trình chuyển động như co

cơ, chuyển vị trí của nhiễm sắc thể trong quá trình phân bào

Các cơ thể sống có thể vận động được là nhờ các protein làm chức năng chuyển động Hình thức vận động như sự di chuyển của tinh trùng, di động của động vật đơn bào (trùng roi), sự co cơ giúp chúng ta đi lại, nói cười, … đều do các protein đảm nhiệm Ví

dụ sự co cơ được thực hiện nhờ chuyển động trượt lên nhau của 2 loại sợi protein là miozin (sợi to) và actin (sợi mảnh)

Bảo vệ: Một số protein có chức năng bảo vệ Hệ thống các kháng thể như antibodies

hay immunoglubulin là những protein đặc biệt có khả năng nhận biết và “tiêu diệt hay trung hòa” những chất lạ xâm nhập vào cơ thể như protein lạ, độc tố, virus, vi khuẩn Một

số protein tham gia trong quá trình đông máu như thrombin hay fibrinogen có vai trò bảo

vệ cơ thể sống khỏi bị mất máu

Một số protein là độc tố rất mạnh (nọc rắn, risin, độc tố của một số loài nấm và vi khuẩn) cũng đóng vai trò bảo vệ

Điều hòa: Sự hoạt động thống nhất và đồng bộ của một cơ thể là do các protein điều

hòa đảm nhận Protein điều hòa có thể là một enzyme, một hormone, chất dẫn truyền các sung động thần kinh, Ví dụ như vai trò của protein trong việc giữ sự cân bằng nước trong tế bào, nếu lượng nước trong tế bào quá nhiều sẽ dẫn đến phù nề còn nếu tế bào bị mất nước sẽ dẫn đến kìm hãm hoặc chấm dứt hoạt động của tế bào – vì mọi phản ứng xẩy đều xẩy ra trong môi trường nước Sự họat động đồng bộ, thống nhất của các protein điều hòa đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát triển bình thường của một cơ thể sống

Kiến tạo và chống đỡ cơ học: Collagen và Elastin tạo nên cấu trúc sợi rất bền của

mô liên kết, dây chẳng, gân Keratin tạo nên cấu trúc chắc của da, lông, móng Protein tơ nhện, tơ tằm tạo nên độ bền vững của tơ nhện, vỏ kén

Truyền xung động thần kinh: Một số protein có vai trò trung gian cho các phản ứng

trả lời của tế bào thần kinh, đối với các kích thích đặc hiệu Ví dụ : vai trò của sắc tố thị giác rodopxin ở màng mắt

Dự trữ dinh dƣỡng: Một nhóm các protein là chất dự trữ dinh dưỡng quan trọng

cung cấp các axit amin cho phôi phát triển Ví dụ : ovalbumin trong lòng trắng trứng, casein của sữa, protein trong các loại hạt như đậu nành, lúa, bắp nguồn protein dự trữ cần cho hạt nảy mầm

Sự phân biệt các chức năng như trên chỉ là tương đối vì không phải lúc nào cũng rõ ràng, có những trường hợp, một protein có thể đảm nhận một số chức năng khác nhau, hoặc có thể trong từng điều kiện cụ thể chức năng của một protein không giống nhau

b) Giá trị dinh dưỡng của protein:

Các protein cấu thành từ các axit amin và cơ thể sử dụng các axit amin ăn vào để tổng hợp protein của tế bào và tổ chức Thành phần axit amin của cơ thể người không thay đổi và cơ thể chỉ tiếp thu một lượng các axit amin hằng định vào mục đích xây dựng

và tái tạo tổ chức Trong tự nhiên không có loại protein thức ăn nào có thành phần hoàn toàn giống với thành phần axit amin của cơ thể Do đó để đáp ứng nhu cầu cơ thể cần phối hợp các loại protein thức ăn để có thành phần axit amin cân đối nhất

Protein là một thành phần dinh dưỡng quan trọng cho người và động vật Trong thành phần dinh dưỡng phải cung cấp đủ lượng protein, đồng thời các protein này phải có

đủ các axit amin cần thiết cho nhu cầu của cơ thể: Có 10 axit amin cơ thể không thể tổng hợp được hoặc chỉ tổng hợp được một lượng rất ít, đó là lyzin, tryptophan, phenynalaninin, lơ-xin, izolơxin, valin, treonin, metionin

Thiếu protein sẽ dẫn đến sự suy nhược cơ thể, đặc biệt đối với trẻ em sẽ bị suy dinh dưỡng Thiếu protein là nguyên nhân chủ yếu của tình trạng sức khỏe kém Thiếu protein

thường đi kèm với tình trạng thiếu năng lượng và các yếu tố dinh dưỡng khác dẫn đến khả năng đề kháng của cơ thể kém đi và dễ bị nhiễm bệnh Nếu protein trong khẩu phần thức ăn thấp tới 3%, chiều cao ngừng phát triển, giảm cân Khi thiếu protein, thành phần hóa học và cấu trúc của xương thay đổi Khi lượng protein trong khẩu phần thấp tới 1,5 – 1,7 %, xương ngừng phát triển Những rối loạn xảy ra trong cơ thể do thiếu protein rất đa dạng và xảy ra ở nhiều bộ phận cơ thể

1.2.2 Cấu tạo hóa học của protein

1.2.2.1 Thành phần nguyên tố

Bốn loại nguyên tố chính xây dựng nên phân tử protein là: C, H, O, N

Trung bình, trong phân tử protein chứa 50-55% C, 21-24% O, 15-18% N, 6,5-7,5%

H, 0-2,4% S, 0-2% P Trong một số protein còn chứa Fe, Mg, I, Cu, Zn, Br, Mn, Ca v.v Do hàm lượng nitơ trung bình trong protein lớn 16% nên để biết hàm lượng protein trong mẫu phân tích người ta thường xác định hàm lượng nitơ rồi nhân với hệ số 100/16, tức 6,25

Protein cấu tạo nên từ 20 loại amino acid khác nhau

1.2.2.2 Các mức cấu trúc của protein

Về mặt cấu tạo hóa học có thể nói proteinlà một polymer mà monomer của nó là các axit amin Các axit amin này liên kết với nhau bằng liên kết peptide Các chuỗi polypeptide có thể chứa từ 10 đến hàng trăm, hàng nghìn gốc acid amin gắn kết chặt chẽ với nhau bằng các liên kết peptide

Do các tương tác trong phân tử protein mà tạo ra các cấu trúc không gian xác định, gọi là ”cấu trúc hình thể” của protein

Trật tự sắp xếp các acid amin trong phân tử protein quy định thông tin về cấu tạo trong không gian của protein Có 4 mức cấu tạo proteine gọi là cấu trúc bậc 1, bậc 2, bậc

3 và bậc 4 (hình 1.2)

Hình 1.2 - Sơ đồ các bậc cấu trúc của protein

Tồn tại những quy tắc chung, mà theo đó chúng ta có thể phân biệt các mức cấu trúc của phân tử protein

a) Cấu trúc bậc 1