Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer) nuôi lồng biển tại Nha Trang – Khánh Hòa

VIÊN ĐẠI PHÚC TÌM HIỂU TÁC NHÂN GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN CÁ CHẼM Lates calcarifer NUÔI LỒNG BIỂN TẠI NHA TRANG - KHÁNH HÒA Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ

VIÊN ĐẠI PHÚC

TÌM HIỂU TÁC NHÂN GÂY BỆNH LỞ LOÉT TRÊN

CÁ CHẼM (Lates calcarifer) NUÔI LỒNG BIỂN TẠI

NHA TRANG - KHÁNH HÒA

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Ts LÊ THỊ THÚY ÁI Ths NGUYỄN THỊ THANH THÙY

Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2011

Để hoàn thành luận văn này tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và tri ân sâu sắc nhất tới:

Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp Hồ Chí Minh, Khoa Sinh học, Phòng Đào tạo Sau đại học, Bộ môn Vi sinh vật đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa học và luận văn tốt nghiệp của mình

Quý Thầy Cô trong Khoa Sinh học đã tận tình giảng dạy, trang bị cho tôi những kiến thức quý báu trong những năm học vừa qua

Cô Lê Thị Thúy Ái và Chị Nguyễn Thị Thanh Thùy là những giáo viên hướng dẫn đã luôn ân cần chỉ dạy và tận tình giúp đỡ để tôi có thể hoàn thành luận văn này

Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 3, Giám đốc Trung tâm Quốc gia Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung đã tạo điều kiện và thời gian để tôi có thể tham gia và hoàn thành khóa học

Các anh chị và các bạn đồng nghiệp ở Trung tâm Quốc gia Quan trắc cảnh báo môi trường và phòng ngừa dịch bệnh thủy sản khu vực miền Trung, Dự án NUFU, Tổ phân tích và kiểm nghiệm thuộc Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản

3 đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn

Gia đình, người thân, bạn bè đã luôn dõi theo, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Một lần nữa tôi xin trân trọng cảm ơn những sự giúp đỡ quý báu đó!

MỞ ĐẦU

Cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) hay còn gọi là cá vược, là một loài

cá có giá trị kinh tế quan trọng ở vùng Nhiệt đới và Cận nhiệt đới thuộc châu Á - Thái Bình Dương Với đặc tính dễ nuôi và thời gian sinh trưởng nhanh, sau một năm thả nuôi từ cá giống cỡ 4 - 5cm, cá có thể đạt trọng lượng từ 1,5 - 3kg Hơn nữa, thịt cá chẽm thơm ngon, giá thành khá cao nên loài này đã được nuôi phổ biến

ở nhiều nước trên thế giới như Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Philippin, Indonesia, Australia…

Ở nước ta, sau khi trường Đại học Nha Trang sản xuất nhân tạo thành công giống cá chẽm (năm 2006) và chuyển giao công nghệ sản xuất giống cho các tỉnh thì nghề nuôi cá chẽm đã phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh ven biển, đến nay cá chẽm trở thành đối tượng nuôi xóa đói giảm nghèo, thay thế các đối tượng nuôi khác đang

bị suy thoái

Trong thời gian gần đây, cá chẽm nuôi thương phẩm ở vùng biển Vũng Ngán

- Nha Trang bị bệnh lở loét trên thân và chết (tỷ lệ mắc bệnh khoảng 30 - 40% cá thể trong đàn), bệnh xảy ra ở tất cả các cỡ cá nuôi, từ cá mới thả nuôi cho đến cá đã nuôi lớn (2 - 3kg) Tuy nhiên, nguyên nhân gây bệnh vẫn chưa được xác định và cách phòng trị bệnh vẫn chưa có giải pháp hiệu quả Xuất phát từ tình hình đó, việc tìm ra tác nhân gây bệnh để đưa ra cơ sở cho việc phòng và trị bệnh lở loét trên cá chẽm là vấn đề khá cần thiết và cấp bách hiện nay

Đề tài “Tìm hiểu tác nhân gây bệnh lở loét trên cá chẽm (Lates calcarifer)

nuôi lồng biển tại Nha Trang – Khánh Hòa” được thực hiện với mục tiêu “xác định

được tác nhân gây bệnh lở loét và đề xuất được biện pháp phòng trị bệnh cá hiệu quả”

Các nội dung nghiên cứu gồm:

- Phân tích tác nhân vi khuẩn, ký sinh trùng và vi nấm trên cá chẽm (Lates

calcarifer) biểu hiện lở loét

- Phân tích sự biến đổi mô học tại vết loét, gan và thận của cá bệnh

- Thử nghiệm cảm nhiễm tác nhân gây bệnh có tần số bắt gặp cao để làm cơ sở xác định đúng tác nhân gây bệnh lở loét

- Đề xuất biện pháp phòng trị bệnh lở loét ở cá chẽm

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ bổ sung vào nguồn tư liệu nghiên

cứu dịch bệnh trên cá chẽm nuôi ở nước ta

Ý nghĩa thực tiễn: Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ làm cơ sở để phòng và trị

bệnh trên cá chẽm, góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm ở nước ta

MỤC LỤC

Trang phụ bìa

Mục lục i

Danh mục các ký hiệu, các từ viết tắt iv

Danh mục các bảng v

Danh mục các biểu đồ và hình ảnh vi

Mở đầu 1

Chương 1 - Tổng quan tài liệu 3

1.1 Tổng quan về cá chẽm 3

1.1.1 Tên gọi và hệ thống phân loại 3

1.1.2 Hình thái, đặc điểm nhận dạng và cỡ 3

1.1.3 Vùng phân bố 4

1.1.4 Đặc điểm môi trường sống 4

1.1.5 Vòng đời sinh sản 4

1.1.6 Tính ăn 4

1.2 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam và trên thế giới 5

1.2.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới 5

1.2.2 Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam 7

1.3 Các nghiên cứu về bệnh cá chẽm trên thế giới 7

1.3.1 Bệnh do vi khuẩn 8

1.3.2 Bệnh do ký sinh trùng 10

1.3.3 Bệnh do nấm 13

1.3.4 Bệnh do virus 13

1.4 Các nghiên cứu về bệnh cá biển ở Việt Nam 14

Chương 2 - Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 17

2.1 Phương pháp thu mẫu cá 17

2.2 Phương pháp xử lý mẫu tại phòng thí nghiệm 17

2.3 Phương pháp phân tích các yếu tố hóa lý trong môi trường nước 17

2.4 Phương pháp định lượng vi khuẩn trong nước 18

2.5 Phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn 19

2.6 Phương pháp nghiên cứu bệnh do ký sinh trùng 22

2.7 Phương pháp nghiên cứu bệnh do nấm 23

2.8 Phương pháp nghiên cứu mô học 23

2.9 Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn lên cá khỏe 24

2.10 Phương pháp thử độ nhạy kháng sinh (kháng sinh đồ) 26

2.11 Phương pháp xử lý số liệu 27

Chương 3 - Kết quả nghiên cứu và thảo luận 28

3.1 Kết quả kiểm tra các yếu tố môi trường nước tại thời điểm thu mẫu cá bệnh 28

3.1.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý nước nuôi 28

3.1.2 Kết quả định lượng vi khuẩn vibrio tổng số và vi khuẩn hiếu khí tổng số trong nước tại vùng nuôi 31

3.2 Kết quả phân tích tác nhân gây bệnh 33

3.2.1 Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn trên cá chẽm bị bệnh lở loét 33

3.2.2 Kết quả phân lập nấm trên cá chẽm bị bệnh lở loét 39

3.2.3 Kết quả kiểm tra cứu ký sinh trùng ngoại ký sinh trên cá chẽm bị bệnh lở loét 40

3.3 Kết quả kiểm tra mô cá bị bệnh bằng phương pháp mô học 43

3.4 Kết quả cảm nhiễm chủng Vibrio alginolyticus (CH3G-TCBSVN) phân lập từ cá chẽm bị bệnh lên cá chẽm khỏe 45

3.4.1 Kết quả cảm nhiễm lần 1 45

3.4.2 Kết quả cảm nhiễm lần 2 (lặp lại) 47

3.5 Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ chủng Vibrio alginolyticus (CH3G-TCBSVN) phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét 50

3.6 Đề xuất phương pháp phòng trị bệnh cho cá chẽm bị bệnh lở loét 51

3.6.1 Xử lý bằng Tetracycline 52

3.6.2 Xử lý bằng Nalidixic acid 53

Chương 4 - Kết luận và kiến nghị 54

4.1 Kết luận 54

4.2 Kiến nghị 54

Tài liệu tham khảo 56

Phụ lục 65

Chương 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về cá chẽm[1],[22]

1.1.1 Tên gọi và hệ thống phân loại[1]

Tên khoa học: Lates calcarifer (Bloch, 1790)

Tên tiếng Anh: Sea bass, barramundi

Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược

Loài: Cá chẽm (Lates calcarifer Bloch, 1790)

1.1.2 Hình thái, đặc điểm nhận dạng và cỡ

Cá chẽm có thân dài, cuống đuôi khuyết sâu, đầu nhọn, nhìn bên lõm phía lưng (hình dạng lưng lõm) và lồi ở phía trước vây lưng Miệng rộng, hơi so le, hàm trên kéo dài tới tận mắt, răng dạng lông nhung, không có răng nanh Vây lưng có 7 -

9 gai và 10-11 tia mềm Vây hậu môn tròn, có 3 gai, 7 - 8 tia mềm, vây đuôi tròn, vảy dạng lược rộng (xù xì hay nhẵn)[22] Chiều dài tối đa 200cm, nặng tối đa 60kg[1]

Màu sắc: Giai đoạn cá giống có màu nâu ô-liu ở phía trên và màu bạc hoặc nâu vàng ở phần bên và phần bụng, giai đoạn trưởng thành cá có màu xanh lục hay vàng nhạt ở phần trên và màu trắng bạc ở phần bụng[22]

1.1.3 Vùng phân bố

Cá chẽm phân bố rộng ở các vùng Nhiệt đới và Cận nhiệt đới thuộc Tây Thái Bình Dương và Ấn Độ Dương, giữa kinh tuyến 500 Đông - 1600 Tây; vĩ tuyến 260Bắc - 250 Nam Cá còn tìm thấy ở khắp phần Bắc châu Á, phía Nam kéo dài đến Queensland (Australia), phía Tây đến Đông châu Phi Ở nước ta, cá chẽm phân bố ở dọc bờ biển từ bắc đến nam[1],[22]

1.1.4 Đặc điểm môi trường sống

Cá chẽm sinh trưởng và phát triển tốt ở điều kiện môi trường nhiệt độ: 15 -

280C, độ mặn: 2 - 35000, độ sâu: 5 - 20m Chúng thường sống tập trung ở vùng nước ven bờ, cửa sông, rừng ngập mặn và phân bố cho tới độ sâu 40m[1]

1.1.5 Vòng đời và sinh sản

Cá chẽm trải qua phần lớn thời gian sinh trưởng (2 - 3 năm) trong các thủy vực nước ngọt như sông, hồ Cá có tốc độ tăng trưởng nhanh, thường đạt cỡ 3 - 5kg sau 2 - 3 năm Cá trưởng thành (3 - 4 tuổi) di cư từ vùng nước ngọt về vùng cửa sông và ra biển, nơi có độ muối từ 30 - 32000 để phát triển tuyến sinh dục và đẻ trứng sau đó Cá đẻ đồng thời với thủy triều lên và theo chu kỳ trăng[22] Cá đẻ quanh năm, mùa đẻ rộ từ tháng 3 - 5 và 7 - 8 Thời gian ấp nở 18 giờ trong điều kiện nhiệt độ từ 28 - 300C và 12 - 17 giờ trong điều kiện nhiệt độ 29 - 320C, độ mặn từ

30 – 32000 Loài cá này chưa phân ra giới tính khi còn nhỏ[1]

1.1.6 Tính ăn:

Cá chẽm trưởng thành là loài cá dữ, phàm ăn, thức ăn ưa thích của chúng là các loài cá tạp, tôm, chúng không ăn thực vật và các loài giáp xác khác như cua, cáy Cá sinh trưởng nhanh, sau 1 năm, từ cỡ cá giống 4 - 5cm có thể đạt trọng lượng từ 1,5 - 3kg[1],[22]

1.2 Tổng quan về tình hình nuôi cá chẽm ở Việt Nam và trên thế giới

1.2.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới

Do giá trị dinh dưỡng cao, nhu cầu thị trường ngày càng mở rộng và là loài phân bố rộng, dễ nuôi đã làm cho cá chẽm trở thành một trong những đối tượng được lựa chọn để phát triển nuôi chính cho ngành nuôi trồng thủy sản Kỹ thuật nuôi cá chẽm được phát triển lần đầu tiên ở phòng thí nghiệm Songkhla Marine (Thái Lan) từ những năm đầu của thập niên 1970 và sau đó phát triển rộng ra các nước trong khu vực như Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Malaysia, Phillipines, Singapore, Đài Loan, Việt Nam và Australia, và gần đây ở một số quốc gia như Mỹ,

Hà Lan, Anh và Israel[38]

Từ năm 1997 đến năm 2006, sản lượng cá chẽm hàng năm ở khu vực châu Á

- Thái Bình Dương luôn ở trong khoảng từ 20.000 - 27.000 tấn, phần lớn cá chẽm được nuôi hồ hoặc lồng ở vùng nước lợ cửa sông hoặc bờ biển[39] Năm 2004, sản lượng cá chẽm khoảng 25.399 tấn, năm 2005 khoảng 26.584 tấn[50] và năm 2006 tăng lên 27.522 tấn[51]

Biểu đồ 1.1 Sản lượng cá chẽm (Lates calcarifer) theo quốc gia (cột) và giá trị (đường) ở khu vực châu Á - Thái Bình Dương từ năm 1997 đến 2006

(Nguồn Mike Rimmer (2008))[50].

Thái Lan: Là nước dẫn đầu về sản lượng nuôi cá chẽm trong khu vực Châu

Á - Thái Bình Dương Năm 2004, giá trị sản lượng cá chẽm của Thái Lan là 65,08 triệu USD, năm 2005 là 68,52 triệu USD với giá bán khá ổn định, trung bình mỗi kg

cá thương phẩm dao động trong khoảng 2,50 - 2,60 USD[51] Theo FAO (2006) (trích dẫn bởi Halwart, 2007), sản lượng cá chẽm nước mặn và lợ của Thái Lan tăng hằng năm, từ 3.884 tấn (năm 1995) và tăng lên 14.550 tấn (năm 2004)[39]

Malaysia: Cá chẽm là loài được nuôi truyền thống, đến năm 2007 vẫn là loài nuôi dẫn đầu trong nghề nuôi cá lồng ở Malaysia Theo thống kê của FAO (2006) (trích dẫn bởi Halwart, 2007), sản lượng cá chẽm của Malaysia là 4.003,73 tấn (năm 2002), 4.210,93 tấn (năm 2003), và 4.000,54 tấn (năm 2004)[39]

Indonesia: Là quốc gia có sản lượng cá có vảy (finfish) biển lớn nhất trong khu vực Đông Nam Á Trong đó cá chẽm cũng là một trong những loài nuôi chính của nước này với sản lượng năm 2004 vào khoảng 2.900 tấn[39]

Singapore: Dự tính đến năm 2012 sản lượng cá chẽm là 3.000 tấn và đến năm 2020 sản lượng sẽ tăng lên 20.000 tấn[74]

Hàn Quốc: Tổng sản lượng cá nuôi của Hàn Quốc năm 2003 khoảng 72.393 tấn, trong đó cá chẽm khoảng 2.778 tấn[39]

Australia: Cá chẽm được nuôi ở hầu hết các bang của Australia (ngoại trừ bang Tasmania)[39],[73], nhưng sản lượng cá chẽm tập trung chủ yếu ở Queensland (phần lớn là nuôi nước ngọt), Northern Territory (nuôi lồng biển và nuôi ao nước lợ) và Nam Australia (nuôi nước ngọt)[35] Cá chẽm được nuôi công nghiệp bắt đầu

từ những năm 1980, hiện nay có khoảng 100 trang trại được cấp phép nuôi[73] Theo

dữ liệu của FAO năm 2004 (trích dẫn bởi Halwart M., 2007), sản lượng cá chẽm khoảng 1.600 tấn, giá trị đạt 9,9 triệu USD Theo báo cáo của O’Sullivan và ctv (2005) (trích dẫn bởi Halwart M., 2007), niên vụ 2003/2004 sản lượng cá chẽm khoảng 2.800 tấn, đạt giá trị 17,6 triệu USD[39] Niên vụ 2008/2009 sản lượng cá chẽm cả nước ước khoảng 6.000 tấn và sẽ tăng lên 7.000 tấn trong niên vụ 2009/2010[73]

1.2.2 Tình hình nuôi cá biển ở Việt Nam

Ở nước ta, cá biển được nuôi chủ yếu ở 3 vùng là vùng biển phía Bắc, vùng Nam Trung Bộ và vùng phía Nam Năm 2001, sản lượng cá nuôi biển cả nước khoảng 2.600 tấn, năm 2002 sản lượng tăng lên 5.000 tấn, ước tính năm 2010 sẽ đạt

20.000 tấn Các loài nuôi chính là các loài cá mú (Epinephelus), cá giò (Rachycentron canadum), cá chẽm (Lates calcarifer), cá vược mõm nhọn (Psammoperca waigensis), cá hồng đỏ (Lutjanus erythropterus), cá tráp đen (Rhabdosargus sarba) và cá đù đỏ (Sciaenops ocellatus)[39] Cá chẽm được xem như

là vật nuôi xóa đói giảm nghèo và là đối tượng nuôi thay thế cho diện tích nuôi tôm không hiệu quả ở một số địa phương ven biển ở nước ta Hiện nay chưa có số liệu thống kê cụ thể về sản lượng cũng như diện tích nuôi cá chẽm ở nước ta, nhưng qua tìm hiểu thông tin từ các báo cho thấy cá chẽm đã nuôi thành công ở một số nơi như

ở Cam Ranh, Vạn Ninh (Khánh Hòa)[77],[78],[79], Hương Trà (Thừa Thiên Huế)[80], Hà Tĩnh[81], Đồng Nai, Bình Định[82], Cà Mau[76]

1.3 Các nghiên cứu về bệnh cá chẽm trên thế giới

Cá biển được nuôi lồng thành công đầu tiên ở Nhật Bản từ những năm 1950

và ở Đông Nam Á từ những năm 1970 Hiện nay đã có rất nhiều loài cá đã được

Biểu đồ 1.2 Sản lượng cá chẽm (cột) và giá trị (đường) của cá chẽm nuôi ở Australia từ năm 1986 đến năm 2004 (nguồn FAO, 2006 được trích dẫn bởi

Halwart M., 2007)[39]

nuôi thành công Tuy nhiên, các loại bệnh và sự nghiêm trọng của bệnh đã ảnh hưởng đến các loài cá nuôi Cá nuôi lồng sẽ trở nên dễ mắc bệnh khi mà các thông

số môi trường như nhiệt độ, độ mặn, nồng độ oxy hòa tan và các chất lơ lửng thay đổi nhiều hoặc đột ngột Chỉ cần một điều kiện thích hợp cho bệnh cũng có thể tạo điều kiện cho bệnh phát triển, quá trình dẫn tới bệnh ở môi trường nước xảy ra rất nhanh Việc xác định sớm sự thay đổi hoạt động và dấu hiệu của bệnh ở cá nuôi là rất quan trọng để chẩn đoán bệnh[69]

1.3.1 Bệnh do vi khuẩn

Bệnh vibriosis: Vibriosis là bệnh gây nên bởi các vi khuẩn thuộc giống

Vibrio, gây bệnh trên rất nhiều loài cá biển và cửa sông, chúng thường xuất hiện khi

môi trường nước xấu, cá bị sốc và thiếu dinh dưỡng[38] Khi nhiễm Vibrio, thường

màu cơ thể cá trở nên tối, lờ đờ, chán ăn, có các vết loét đỏ trên cơ thể, tích dịch ở bụng[36], bơi bất thường, mắt đục, bụng có màu đỏ Bên trong, có thể thấy các vùng hoại tử và xuất huyết ở thận, gan và lách[38]

Nghiên cứu của Renaul T và ctv (1994) cho thấy Vibrio damsela là nguyên nhân gây chết hàng loạt ở cá chẽm con nuôi ở Tahiti (nằm ở khu vực Thái Bình Dương, thuộc Pháp), dấu hiệu chính của bệnh là cá lờ đờ, xuất huyết ở gốc đuôi và

lở loét lan rộng ra[60]

Bệnh vi khuẩn nhiễm trùng máu xuất huyết: Gây ra bởi Aeromonas

hydrophila, Aeromonas sorbia, Aeromonas caviae, Aeromonas spp., pseudomonas

sp Các vi khuẩn này thường nhiễm ở cá chẽm nuôi nước ngọt, làm cho cá bị xuất huyết đỏ ở da, lờ đờ, cá biếng ăn, tích dịch ở bụng, mang nhợt nhạt Bệnh thường xuất hiện khi môi trường xấu, da bị tổn thương[36] Theo Kumaran S (2009),

Pseudomonas sp KUMS3 là tác nhân gây nên bệnh mòn vây ở cá chẽm nuôi ở Ấn

Độ, làm cá xuất huyết ở gốc vây, miệng và mất sắc tố da[43]

Bệnh vi khuẩn ở da: Do Aeromonas sorbia, Aeromonas hydorphila, Vibrio

harveyi, Vibrio alginolyticus gây nên, làm cá bị lở loét không đều, mất vảy Bệnh

thường xảy ra khi môi trường xấu, da bị tổn thương[36]

Bệnh streptococcusis: Streptococcusis là bệnh rất nghiêm trọng, tác nhân

chính là Streptococcus iniae Bệnh có thể xảy ra ở cả cá chẽm nuôi nước ngọt lẫn

nước mặn và kết quả là làm cho cá chết với tỷ lệ cao Bệnh này được ghi nhận là tác nhân gây bệnh trên cá chẽm nuôi lồng biển ở Northern Territory (Australia) năm

2005 Trong trường hợp cấp tính, cá có thể gần chết hoặc chết với một vài dấu hiệu bên ngoài và trong các nội tạng Trong trường hợp ít trầm trọng hơn thì cá bị nhiễm bệnh có thể bơi nhấp nhô gần mặt nước, có thể bị mù và không đáp ứng với sự kích thích bên ngoài, xuất huyết có thể thấy ở da và đặc biệt ở chân vây Cầu mắt bị lồi

và xuất huyết bên trong mắt, mang bị xung huyết Bên trong, sự xuất huyết nhiều có thể thấy ở bề mặt của các nội quan lớn, thường thì cơ xương có màu đỏ hồng[38] Các báo cáo của Alicia E và ctv (2005), Bromage E.S và ctv (1999) cũng cho thấy

Streptococcus iniae là tác nhân chính gây bệnh trên cá chẽm ở Australia với liều

gây chết LD50 là 2,5 x 105 CFU/g trong 2 ngày và 3,2 x 104 CFU/g trong 10 ngày[25],[32]

Bệnh columnaris: Nguyên nhân gây bệnh là Flavobacterium columnare;

Flavobacterium johnsoniae và Flavobacterium sp ở cá chẽm nước ngọt và Tenacibaculum marinimum ở cá chẽm nước mặn, khi nhiễm bệnh, cá xuất hiện các

đám nhợt nhạt trên bề mặt lưng, phần sau vây lưng và cuống đuôi, cá lờ đờ Phần lớn bệnh xảy ra khi cá mới đẻ, trong giai đoạn muộn của cá ấu niên có sự ăn mòn da xung quanh miệng Bệnh thường xảy ra do bị sốc môi trường, vệ sinh kém, da bị tổn thương[36]

Bệnh vi khuẩn mang: Các vi khuẩn khác nhau gây ra như Flavobacterium spp., Cytophaga spp Khi bị bệnh, cá thường bơi nổi trên bề mặt, mang hoạt động

đóng mở nhanh và có nhiều dịch nhầy, có các mảng trắng trên mang Kiểm tra mang đang còn tươi ở dưới kính hiển vi cho thấy một số lượng lớn vi khuẩn có hình que dài ở biểu mô của mang Bệnh phần lớn xảy ra ở giai đoạn cá nhỏ[36],[38]

Bệnh vi khuẩn viêm màng bụng: Các vi khuẩn gây bệnh là các vi khuẩn

Gram (-) và Gram (+) khác nhau trong đó có Vibrio harveyi, Aeromonas

hydrophila Các dấu hiệu bệnh chính là cơ thể cá có màu đen, cá lờ đờ, bụng sưng

phồng, có dịch keo và mùi khó chịu ở bụng, bệnh hay gặp trên cá nuôi ở hệ thống tuần hoàn[36]

Bệnh hoại tử viêm ruột và mưng mủ: Hội chứng hoại tử viêm ruột mưng

mủ, thường gọi là “sưng”, xuất hiện một cách định kỳ ở các trại nuôi cá chẽm Hội chứng này ảnh hưởng đến cá cỡ nhỏ tới các cá thể thành thục, gặp cả ở cá chẽm

nuôi nước ngọt và nước mặn Người ta đã phân lập được Vibrio harveyi và

Photobacterium damselae subspecies damselae trên cá bị bệnh này Cá bị bệnh

thường bụng phình, hôn mê và chết Điểm đặc trưng của bệnh là mùi của cá sắp chết hoặc mới chết giống với mùi cá đã chết 1 ngày, khoang bụng bị sưng phồng bởi một lượng lớn dịch phân hủy Trường hợp bệnh ở giai đoạn sớm có sự xuất hiện của tơ huyết bện lại với nhau, nối các cơ quan nội tạng và mô Ở trường hợp muộn hơn, ở các nội quan bên trong bị hoại tử và hóa lỏng[38]

Bệnh epitheliocystis: Là bệnh gây ra bởi sự xâm nhiễm vào mang của

Chlamydial, cá ấu niên bị nhiễm nặng ở mang có thể chết với tỷ lệ cao Cá bị nhiễm

bệnh có thể không thấy dấu hiệu rõ ràng, mang có thể trở nên đỏ và cá bơi gần với mặt nước, tỷ lệ chết có thể cao Ở dưới kính hiển vi có thể thấy một số lượng lớn các nang nằm trong biểu mô[38]

1.3.2 Bệnh do ký sinh trùng

Theo báo cáo của FAO và Glenn Schipp (2007), trên cá chẽm có các bệnh ký sinh trùng sau[36],[38]:

Bệnh cryptocaryonosis: Nguyên nhân gây bệnh là Cryptocaryon irritans

Đây là động vật đơn bào, có lông, sống ký sinh và không có vật chủ chuyên biệt Là nguyên nhân gây ra rất nhiều bệnh trên cá nuôi biển, đặc biệt ở vùng Nhiệt đới[38]

Cá bị nhiễm bệnh thường cọ vào đáy hoặc thành của lồng nuôi, cá biếng ăn và trở nên lờ đờ Nếu sau đó không chữa trị kịp thời thì mắt cá trở nên đục và có các đốm trắng cũng như những chỗ lở loét nhỏ có thể xuất hiện trên vảy Sự tiến triển của bệnh sẽ nhanh, cá có thể chết trong vòng 2 đến 3 ngày[38]

Bệnh trypanosomosis: Là bệnh gây ra bởi Trypanosoma sp Dấu hiệu bệnh

là cá bị hôn mê, mất tập trung, mù mắt và chết Mắt cũng có thể bị lồi và bị xuất huyết bên trong, đồng thời xuất hiện vùng lở loét xuất huyết và vùng ăn mòn trên

da Bên trong, thận căng to và tình trạng thiếu máu xảy ra, kết quả làm cho cá chết

với tỷ lệ cao Khi kiểm tra bằng kính hiển vi thấy rất nhiều Trypanosoma sp trong

Bệnh trichodiniasis: Do nhóm Trichodina spp gây nên Cá bị bệnh này có

các dấu hiệu bệnh như cá bơi ở bề mặt, nắp mang đóng mở nhanh, dịch nhầy ở mang tiết ra nhiều Bệnh thường xảy ra khi nhiệt độ môi trường nước thấp, chất hữu

cơ lơ lửng nhiều và nuôi cá với mật độ dày[36]

Bệnh chilodonelliasis: Gây ra bởi Chilodonella spp và Chilodonella

hexasticha Khi nhiễm ký sinh trùng này, cá thường bơi trên bề mặt, nắp mang đóng

mở nhanh và mở rộng Môi trường nước xấu và cá bị ốm yếu là điều kiện thuận lợi

để ký sinh trùng này xâm nhập và gây bệnh[36]

Bệnh Ichthyobodosis (costiasis): Ichthyobodo necator là nguyên nhân

chính gây bệnh Cá bị bệnh thường cọ lên thành lồng, xuất hiện các vết sẫm màu trên da, tróc vảy, bơi trên bề mặt, nắp mang mở to và hoạt động đóng mở nhanh[36]

Bệnh piscinoodiniasis: Nguyên nhân gây bệnh là Piscinoodiniasis sp., bệnh

thường gặp ở cá chẽm nuôi nước ngọt Bệnh xảy ra ở cá nhỏ thì có các vết mờ hoặc màu xanh bạc trên da, ở cá lớn hơn thì có các mảng nổi lên trên bề mặt da và có các vết lở loét, nắp mang hoạt động mạnh, mang tiết nhiều dịch và có màu xanh đen[36]

Bệnh Amyloodiniasis: Nguyên nhân chính là do Amyloodinium ocellatum

Thường gặp ở cá chẽm nuôi biển, xuất hiện các vết mờ hoặc mất màu trên da ở cá nhỏ Cá lớn hơn thường có các vết lở loét, nắp mang đóng mở nhanh, dịch tiết từ

mang nhiều, mang có màu xanh đen Bệnh thường xuất hiện khi nhiệt độ thấp và nhiệt độ giảm đột ngột[36]

Bệnh mụn đỏ: Gây ra bởi Epistylis sp Bệnh này xảy ra ở cá chẽm nước

ngọt, gây nên lở loét trên da và làm cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể cá gây bệnh[36]

Bệnh sán lá mang: Tác nhân chính gây bệnh là Diplectanum sp.,

Dactylogyrus sp Cá bị bệnh thường đóng mở nắp mang nhanh, biếng ăn, có các

vùng trắng trên mang[36]

Bệnh sán lá da: Gây ra bởi Neobenedinia melleni, Gyrodactylus spp Dấu

hiệu chính của bệnh là mắt mờ, xuất hiện các mảng trắng trên da, lở loét trên da Bệnh thường xảy ra ở điều kiện độ mặn cao và nhiệt độ nước thấp[36]

Bệnh myxosporidiosis: Nguyên nhân gây bệnh là Henneguya sp., Kudoa

sp., bệnh này không thường xuyên xảy ra Kiểm tra mô học thấy có bào tử của

chúng ở tơ mang (Henneguya sp.) và trong não (Kudoa sp.)[36]

Bệnh microspridiosis: Nguyên nhân là do Peistophora sp Khi nhiễm bệnh,

thường có các khối u nổi lên trên da, có các u mềm màu trắng ở cơ[36]

Theo báo cáo của Rückert S và ctv (2008), khi nghiên cứu ký sinh trùng ký sinh trên cá chẽm nuôi tại vịnh Lampung, Indonesia đã ghi nhận được 19 loài ký sinh trùng trên cá chẽm nuôi lồng và tất cả cá đều nhiễm từ 2 đến 10 loài ký sinh trùng Trong đó, nhóm protozoan (1 loài), myxozoans (1 loài), digeneans (3 loài), monogenean (5 loài), cestodes (3 loài), nematodes (5 loài) và acanthocephalans (1 loài)[62] Theo Rajkumar M và ctv (2005), khi nuôi cá chẽm trong phòng thí nghiệm

được 14 ngày, nhóm nghiên cứu đã phát hiện thấy Cymothoa indica xuất hiện ở

vùng mang và trước lưng, tạo thành các vết tổn thương có màu đỏ, xuất huyết mà không có hiện tượng tiết nhớt nhiều Tỷ lệ cá chết sau 3 tuần nuôi là 16,54% Ký sinh trùng này đã được truyền vào theo con đường thức ăn của cá và gây bệnh[59] Báo cáo của Saugata Basu và Durga P Haldar (2003) cho thấy, cá chẽm nuôi ở

vùng Đông Bengal, Ấn Độ phát hiện thấy có nhiễm loài ký sinh trùng Myxobolus

calcariferum sp n ở mang cá, gây bệnh và làm chết cá[63]

1.3.3 Bệnh do nấm

Bệnh chấm đỏ: Bệnh chấm đỏ hay hội chứng lở loét (EUS) đã được báo cáo trên rất nhiều loài cá, trong đó có cá chẽm Tuy nhiên bệnh chỉ xảy ra ở cá nuôi nước ngọt, chưa thấy có báo cáo trên cá nuôi biển Nguyên nhân gây bệnh là nấm

Aphanomyces invadens Dấu hiệu của bệnh là có các vết lở loét sâu màu đỏ hoặc

xuất huyết trên da, hiện tượng lở loét có thể lan đến mắt Khi bị bệnh, cá trở nên hôn mê và dễ trở thành con mồi cho những loài khác[38]

Bệnh nấm da: Do nấm Saprolegnia spp., Achlya spp gây ra Bệnh thường

làm cho cá nổi cục và phát triển thành dạng như múi bông trên da và vây Bệnh thường xảy ra khi nhiệt độ thấp và cá bị tổn thương ở da[36]

Bệnh branchiomycosis: Do nấm Branchiomyces sp và Achlya spp gây ra

Biểu hiện của bệnh là cá bơi nổi trên mặt nước, nắp mang đóng mở liên tục, có các vết đỏ và trắng (xuất hiện lốm đốm) ở mang Bệnh thường xuất hiện khi nhiệt độ nước thấp, chất hữu cơ tập trung trong nước nuôi nhiều[36]

1.3.4 Bệnh do virus

Bệnh virus ở cá biển nuôi lồng đã được báo cáo ở Đông Á từ những năm

1980 và các nước Đông Nam Á từ những năm 1990[69] Ở cá chẽm, đã phát hiện được 2 virus gây bệnh chính là:

Bệnh virus gây hoại tử thần kinh VNN (Viral Nervous Necrosis):

Tác nhân gây bệnh là nhóm Nodavirus cá Bệnh VNN trên cá chẽm lần đầu

tiên được báo cáo từ những năm 1980 ở Australia khi gây bệnh trên cá chẽm ấu niên Ngày nay, VNN là nguyên nhân gây chết ở cá hương và cá ấu niên ở các trại giống cá chẽm[38] Đặc điểm của bệnh là virus làm thoái hóa các nơron thần kinh và sinh không bào trong hệ thần kinh trung ương và võng mạc Vì vậy, khi bị nhiễm virus, cá ở trạng thái mất cân bằng, cơ không kiểm soát được và loạn chức năng thị

giác[36] Hiện nay, bệnh này đã được báo cáo ở hơn 30 loài cá biển trên thế giới Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn cá hương từ 15 đến 24 ngày tuổi, còn có thể xuất hiện cho tới khi cá được 7 tuần tuổi[38] Khi mắc bệnh, cá bị nhạt hoặc sẫm màu, bơi xoắn ốc, choáng, có sự phồng và các không bào lớn ở não và dây sống[36]

Theo báo cáo của Azad IS và ctv (2005), ở Ấn Độ, VNN gây bệnh ở các trại giống cá chẽm ở giai đoạn cá hương làm cá chết từ 60 - 90% Khi bị bệnh, cá hương

có màu đen, khi kiểm tra không thấy có dấu hiệu bị nhiễm vi khuẩn hay ký sinh trùng Dựa vào các lát cắt mô ở não và tủy sống người ta đã thấy rất rõ các vùng bị hoại tử, qua kiểm tra bằng kỹ thuật RT-PCR, người ta đã phát hiện được

Nodavirus[28] Một nghiên cứu khác ở Chennai và Nagapattinam thuộc Tamilnadu,

Ấn Độ cũng cho thấy, VNN là nguyên nhân gây chết hàng loạt cá hương ở các trại giống với các dấu hiệu như cá biếng ăn, da có màu tái nhợt, mất trạng thái cân bằng, bơi xoắn hay bơi vòng trước khi chết[57]

Bệnh lymphocytis: Do Iridovirus gây nên Bệnh làm cho cá xuất hiện các

mụn cóc trên da, vây, thông thường chỉ gây chết nếu xâm nhiễm nhiều và kết hợp với điều kiện môi trường xấu[36], giai đoạn cá ấu niên thường dễ mắc bệnh hơn cá trưởng thành[69]

1.4 Các nghiên cứu về bệnh cá biển ở Việt Nam

Ở nước ta hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào cụ thể về bệnh lở loét trên cá chẽm Tuy nhiên, trên cá biển nói chung thì cũng đã có khá nhiều các công trình nghiên cứu như:

Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2008), cá biển nuôi tại Khánh Hòa có 10 bệnh thường gặp trên cá biển nuôi là[5]:

+ Bệnh vibriosis: Gây bệnh xuất huyết lở loét trên cá mú, cá hồng, cá chẽm thời gian xuất hiện bệnh chính là mùa khô

+ Bệnh mòn vây và đuôi: Nguyên nhân gây bệnh có thể là vi khuẩn Gram

(-), có đặc điểm gần giống với Flexibacter maritimus, bệnh xuất hiện quanh năm và

gây chết rải rác tới hàng loạt cá nuôi lồng, đặc biệt là giai đoạn cá con Các loài cá hay gặp là cá mú, cá hồng, cá chẽm

+ Bệnh sán lá da (bệnh mè cá): Nguyên nhân gây bệnh thường là sán lá đơn chủ (monogenea) dạng hạt mè trên bề mặt cơ thể Bệnh làm cho cá có thể đục mắt, ngứa ngáy, giai đoạn cuối nổi lờ đờ trên mặt nước, nếu bị nhiễm nặng, cá có thể bị chết Bệnh thường xuất hiện vào thời gian giao mùa giữa mùa mưa và mùa khô, các loài cá thường bị bệnh là cá mú, cá hồng, cá chẽm, cá giò

+ Bệnh sán lá mang (bệnh sưng mang, hay bệnh mủ mang): Làm cá hoạt động yếu, bỏ ăn, khi bơi nắp mang thường phồng lên, mang tiết nhiều dịch nhầy (mủ mang) Trường hợp bị bệnh nặng có thể gây chết cá từ rải rác đến hàng loạt Nguyên nhân gây bệnh là các loài sán lá đơn chủ ký sinh khác nhau như loài

Pseudorhabdosynochus spp., Diplectanum spp và Haliotrema spp Các loài cá

+ Bệnh hoại tử thần kinh (bệnh bơi xoắn): Khi nhiễm bệnh này, cá thường

có các dấu hiệu như: màu sắc cá đen sậm, bơi lội không định hướng, bơi xoắn ốc, đuôi cong và liệt cứng, bụng chướng to do bong bóng cá căng phồng, ruột không có thức ăn nhưng thấy có chứa chất dịch màu xanh lá cây Nguyên nhân gây bệnh là virus gây hoại tử thần kinh VNN Các loài cá hay nhiễm bệnh là cá mú, cá chẽm, cá giò

+ Bệnh đỉa cá: Làm cá gầy yếu, suy kiệt sức khỏe, chết rải rác do mất máu hoặc do nhiễm khuẩn cơ hội Nguyên nhân gây bệnh là ký sinh trùng thuộc họ đỉa

Hirunidae Các loài cá thường bị bệnh là cá mú, cá chẽm và cá hồng

+ Bệnh đốm trắng ở thận: Thường gặp ở cá giò nuôi lồng ở Vạn Ninh, Khánh Hòa Với các biểu hiện bệnh như cá kém ăn, chậm lớn Ở thận, gan, tụy xuất

hiện các đốm trắng dạng hạt Trên cá bị bệnh này, người ta đã phân lập được vi

khuẩn Photobacterium damselae

+ Bệnh lymphocystic (bệnh u sần): Cá bị bệnh này thường xuất hiện các u nhỏ có màu trắng hay hồng trên vây, lưng, đầu Bệnh này chỉ gây chết rải rác nhưng ảnh hưởng tới sinh trưởng và giá trị thương phẩm của cá nuôi Các loài cá thường gặp là cá giò và cá chẽm

+ Hội chứng dị dạng ở cá biển: Cá có hình dạng không bình thường, cột sống

bị ưỡn cong và bụng cá hóp lại như bị đói lâu ngày và không lâu sau thì cá sẽ chết Bệnh này hay gặp trên cá mú

Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008), khi nghiên cứu về bệnh lở loét trên

cá mú cho thấy hai loài vi khuẩn là Vibrio alginolyticus và Vibrio parahaemolyticus

là tác nhân chính gây nên bệnh lở loét ở cá mú nuôi tại Khánh Hòa Trên các mẫu

bệnh còn phân lập được 7 loài ký sinh trùng là Pseudorhabdosynochus epinepheli,

Benedenia sp., Caligus sp., Trichodina sp., Apiosoma sp., Ampiphrya sp., Zeylanicobdella sp., và nấm thuộc giống Aspergillus Tuy nhiên theo tác giả thì các

loài ký sinh trùng và nấm chỉ là tác nhân cơ hội hoặc là tác nhân mở đường cho vi khuẩn xâm nhập và gây bệnh cho cá[20] Võ Thế Dũng và ctv (2005) nghiên cứu về

thành phần loài ký sinh trùng trên cá mú (Epinephelus spp.) tự nhiên, nuôi ao, nuôi

lồng tại Khánh Hòa, đã phát hiện thấy có 22 loài ký sinh trùng thuộc 7 giống, 12 họ,

11 bộ, 9 lớp, 8 ngành Trong đó, Trichodina chiếm tỷ lệ cao nhất (74,2%), các loài monogenea ký sinh ở mang và da với tỷ lệ cảm nhiễm 31,9%[67] Nghiên cứu của

Đỗ Thị Hòa và ctv (2007) về sán lá đơn chủ (monogenean) trên cá mú (Epinephelus sp.) và cá chỉ vàng (Lutjanus argentimaculatus) nuôi tại Khánh Hòa cho thấy, cá bị

nhiễm monogenea thường bơi lờ đờ, ăn kém, tiết nhiều dịch nhờn từ chỗ da và mang bị tổn thương Nếu nhiễm monogenea ở da với cường độ cao sẽ gây nên lở loét trên da ở giai đoạn cuối của bệnh Nếu cường độ cảm nhiễm của ký sinh trùng

ở mang cao, thì nắp mang bị căng ra, tiết rất nhiều dịch nhầy, da cá bị sậm đen và

có thể làm cá chết rải rác[34]

Chương 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Phương pháp thu mẫu cá

Mẫu được thu chọn lọc tại thời điểm cá mắc bệnh lở loét, mẫu thu phải là cá còn sống và được vận chuyển về phòng thí nghiệm bằng thùng xốp có sục khí Khi thu mẫu, ghi thông tin về ngày tháng, tình trạng của cá

2.2 Phương pháp xử lý mẫu tại phòng thí nghiệm

Mẫu cá đem về phòng thí nghiệm, trước hết cần đo chiều dài, cân trọng lượng, quan sát bằng mắt thường về các biểu hiện bệnh lý bên ngoài

Nhớt ở thân, vết loét, vây, phiến mang được lấy bằng dao đã vô trùng để kiểm tra ký sinh trùng Tơ mang, vây, mẫu cơ ở vết loét được thu để phân lập nấm

Sát trùng toàn bộ cơ thể cá bằng cồn 700, sau đó giải phẩu quan sát các biểu hiện của nội quan bên trong như gan, thận, lách, dạ dày, bóng bơi, xoang bụng Thu mẫu bệnh phẩm gan, thận, lách vào các ống nghiệm vô trùng để phân lập vi khuẩn

và nấm

Thu mẫu cơ ở vết loét để phân lập vi khuẩn, nấm và kiểm tra ký sinh trùng Thu mẫu gan, thận, cơ ở vết loét… tất cả được cố định bằng dung dịch Bouin

để kiểm tra mô học bằng phương pháp cắt mô

2.3 Phương pháp phân tích các yếu tố hóa lý môi trường nước

pH: Sử dụng máy đo pH; Độ mặn: Sử dụng khúc xạ kế; Nhiệt độ nước: Sử dụng nhiệt kế thủy ngân có chia độ từ 0 – 1000C

Độ kiềm: Xác định bằng phương pháp chuẩn độ axít

Oxy hòa tan trong nước (Dissolved Oxygen - DO): Xác định bằng phương pháp Winkler

Nhu cầu oxy hóa học (Chemical Oxygen Demand - COD): Xác bằng phương pháp KMnO4 trong môi trường kiềm

Nhu cầu oxy sinh hóa (Biochemical Oxygen Demand – BOD5): Xác định bằng phương pháp nuôi cấy và pha loãng

Amoni (NH4+-N): Xác định theo phương pháp Salicylate, đo quang trên máy DR2010 ở bước sóng 655nm

Nitrite (NO2--N): Thực hiện với thuốc thử axit sunphanilic và α-napthylamin,

đo quang trên máy DR2010 ở bước sóng 507nm

Nitrate (NO3--N): Dùng cột khử cadimi để chuyển nitrate về nitrite, sau đó xác định nitrite bằng thuốc thử sunphanilic và α-napthylamin, đo quang trên máy DR2010 ở bước sóng 507nm

Sulfide (S2-): Sử dụng phương pháp đo quang với thuốc thử Phenylendiamin tạo phức màu xanh và đo trên máy DR2010 ở bước sóng 665nm Phosphat (PO43--P): Thực hiện bằng thuốc thử molipdate và đo quang trên máy DR2010 ở bước sóng 680nm

N,N-Dimethy-1-4-2.4 Phương pháp định lượng vi khuẩn trong nước

+ Môi trường nuôi cấy cần thiết:

- Môi trường định lượng vi khuẩn hiếu khí tổng số: TSA (Tryptone Soya Agar) + 2%NaCl

- Môi trường định lượng Vibrio tổng số: TCBS (Thiosulfat Citrat Bile salts Sucrose agar)

- Nước muối vô trùng 2% NaCl dùng để pha loãng mẫu nếu cần thiết

- Hút 0,1ml mẫu ở các nồng độ pha loãng khác nhau vào trong các đĩa petri

đã chứa môi trường thạch TCBS và TSA (2%NaCl), dùng que trang thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô, lật úp đĩa petri, nuôi cấy ở 29 - 310C từ 24 - 72 giờ lấy ra đọc kết quả

- Chọn tất cả các đĩa có không quá 300 khuẩn lạc để tính kết quả Sự phân bố của các khuẩn lạc trên các đĩa nuôi cấy phải hợp lý: độ pha loãng càng cao thì số khuẩn lạc càng ít Nếu kết quả không hợp lý, phải tiến hành lại các bước nuôi cấy

- Cách tính kết quả: Chọn những đĩa không quá 300 khuẩn lạc ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp, tính số khuẩn lạc vi khuẩn cho 1ml bằng cách tính trung bình cộng tổng số khuẩn lạc của các đĩa trên theo công thức:

( 1 0,1 2 )

C N

2.5 Phương pháp nghiên cứu bệnh do vi khuẩn

Tham khảo các công trình của Đỗ Thị Hòa (2005)[3], Austin B và ctv (2007)[29], và Nicky B Buller (2004)[54]

+ Môi trường nuôi cấy và hóa chất cần thiết:

- Môi trường tổng hợp: TSA +2% NaCl

- Môi trường nuôi cấy chọn lọc cho vi khuẩn Vibrio: TCBS

- Môi trường nuôi cấy chọn lọc cho vi khuẩn Pseudomonas: CA (Cetrimid Agar) + 2% NaCl

- Môi trường nuôi cấy tăng sinh (nếu cần thiết): TSB (Tryptone Soya Broth)

- Nước muối vô trùng 2% NaCl dùng để rửa và pha loãng mẫu

- Bộ test kit API 20E của hãng Biomerieux với các phản ứng sinh hóa: ONPG (o-nitrophenyl-D-galactopyranosid), ADH (arginine hidrolase), LDC (lysine decarboxylase), ODC (ornithine decarboxylase), CIT (sử dụng citrate làm nguồn carbon duy nhất), H2S (sinh H2S), URE (thử nghiệm urease), TDA (thử nghiệm tryptophan deaminase), IND (khả năng sinh Indol), VP (Voges-Proskauer), GEL (thử nghiệm gelatinase), GLU (lên men glucose), MAN (lên men manose), INO (lên men inositol), SOR (lên men sorbitol), RHA (lên men rhamnose), SAC (lên men sucrose), MEL (lên men melibiose), AMY (lên men amygladin), ARA (lên men arabinose), NO2 (khử nitrate), McC (phát triển trong môi trường MacConkey), OX (oxidase), MOB (khả năng di động), O/F (khả năng oxi hóa - lên men) Ngoài ra còn thực hiện thêm các phản ứng catalase, thử khả năng phát triển trong các nồng

độ muối khác nhau, vibriostat (0/129)

+ Phương pháp thực hiện:

Vết loét và các nội quan (tim, gan, thận, lách…) được chú trọng phân tích tính nhiễm khuẩn Các mẫu này được đồng nhất và dùng làm nguồn phát hiện vi khuẩn gây bệnh trên các môi trường chọn lọc (TSBS, CA), không chọn lọc (TSA), hay tăng sinh trong môi trường TSB Dựa vào đặc tính khuẩn lạc ưu thế trên các môi trường chọn lọc và kết quả thử nghiệm sinh hóa làm tiêu chí định danh nhanh

vi khuẩn Quy trình nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh trên cá được tóm tắt qua sơ đồ hình 2.1:

- Tần số bắt gặp các loài vi khuẩn được tính theo công thức:

TSBG = Số cá có xuất hiện loài vi khuẩn cần tính

Tổng số cá kiểm tra

×100 (%)

Quan sát hình thái khuẩn lạc,

làm tiêu bản giọt ép, giọt

treo, nhuộm Gram…

Kết luận giống loài vi

khuẩn gây bệnh

Hình 2.1 Sơ đồ nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh

2.6 Phương pháp nghiên cứu bệnh do ký sinh trùng

Tham khảo công trình của Bùi Quang Tề (2002) [14] và Đỗ Thị Hòa(2005)[3]

+ Các trang thiết bị cần thiết: kính lúp, kính hiển vi soi nổi, kính hiển vi quang học

+ Phương pháp thực hiện:

Mẫu sau khi thu về phòng thí nghiệm, trước tiên được quan sát bằng mắt thường hoặc kính lúp để phát hiện các ký sinh trùng lớn ngoại ký sinh Sau đó thu các mẫu nhớt ở da, vây, mang, hốc mũi, vết loét lên lam kính sạch, quan sát tươi dưới kính hiển vi soi nổi và kính hiển vi quang học để phát hiện ký sinh trùng, kết hợp với các tài liệu để định danh ký sinh trùng

+ Cách tính tần số bắt gặp:

Tần số bắt gặp =

+ Đánh giá cường độ cảm nhiễm (CĐCN):

- Đối với những ký sinh trùng nhỏ như ký sinh trùng đơn bào, CĐCN được tính theo công thức:

CĐCN =

- Đối với những loài ký sinh trùng có kích thước lớn như Monogenea,

Trichodina , CĐCN được tính trên lam kính hay lá mang kiểm tra theo công thức:

CĐCN =

Tổng số ký sinh trùng trên các thị trường kính kiểm tra

Tổng số thị trường kính kiểm tra

(Trùng/thị trường kính)

Tổng ký sinh trùng trên các lam kính hay lá mang kiểm tra

Tổng lam kính hay lá mang kiểm tra

(Trùng/lam kính hoặc lá mang)

Số cá bị nhiễm ký sinh trùng Tổng số cá kiểm tra ×100 (%)

- Đối với các ký sinh trùng lớn hơn như đỉa, giun tròn, giáp xác , CĐCN được tính bằng toàn bộ số ký sinh trùng đếm được/cơ thể cá.

2.7 Phương pháp nghiên cứu bệnh do nấm

+ Môi trường nuôi cấy: Môi trường sử dụng nuôi cấy nấm là Sabouraud agar (SA) bổ sung 100mg chloramphenicol và 20g NaCl/ 1 lít môi trường

+ Phương pháp thực hiện:

Các mẫu vây, mang, vết loét được thu vào các ống nghiệm vô trùng và được rửa sạch nhiều lần bằng nước muối 2% NaCl vô trùng, dùng đũa thủy tinh tán đều mẫu Mẫu được nuôi cấy trên môi trường SA ở 29 - 310C/3 - 5 ngày Hình thái đại thể và hiển vi được sử dụng định danh sơ bộ nấm gây bệnh

2.8 Phương pháp nghiên cứu mô học

Tham khảo công trình của Đỗ Thị Hòa (2005)[3]

+ Các hóa chất và dụng cụ cần thiết: Dung dịch Bouin, cồn (ở các nồng độ

50, 70, 80, 95, 100%), xylene, hematocylin, eosin, parafin, keo bomcanda, bộ xử lý mẫu và máy cắt lát mẫu, kính hiển vi quang học

- Cắt lát mẫu: Dùng máy cắt mô chuyên dụng microtome, cắt lát mô có độ dày từ 5-7 µm

- Nhuộm mẫu: Mẫu sau khi được cắt lát sẽ được đưa vào trong bể chứa nước

ấm (40 - 450C) từ 1 - 2 phút để lát cắt dãn, không bị nhăn nhúm Dùng lam sạch, lấy lát cắt ra để khô ở nhiệt độ 46 - 600C (1 - 4 giờ) Khử parafin bằng xylene, rồi nhuộm tiêu bản bằng Hematocylin và Eosin Gắn lamen lên tiêu bản bằng keo bomcanada

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10×40 lần

2.9 Phương pháp cảm nhiễm vi khuẩn lên cá khỏe

- Thí nghiệm được bố trí thành 5 lô với 4 lô tiêm vi khuẩn và 1 lô tiêm nước muối sinh lý (0,85% NaCl) làm đối chứng

- Cá thí nghiệm: Chọn cá chẽm khỏe, ăn tốt, có chiều dài và khối lượng thân trung bình lần lượt là 18,5 (1,34)cm và 76,7 (22,9)g (thí nghiệm lần 1); 20,6 (1,52)cm và 106,8 (20,2)g (thí nghiệm lần 2), cá mua từ các lồng nuôi thương phẩm và được nuôi thuần dưỡng trong bể composit 2000 lít, có hệ thống nước chảy

ra vào liên tục trong 2 tuần trước khi bố trí ngẫu nhiên vào trong các lô thí nghiệm

- Vi khuẩn thí nghiệm: Là chủng có tần số bắt gặp cao nhất là V

alginolyticus (CH3G-TCBSVN), bố trí thành 4 lô tiêm là 1×103, 1×104, 1×105, 1×106CFU/g khối lượng thân cá

- Điều kiện nuôi thí nghiệm:

Mật độ: 6 con/bể composit 200 lít

Độ mặn 30 – 32‰

Nhiệt độ nước 27 – 280C Sục khí liên tục

Cho ăn thức ăn công nghiệp, khẩu phần ăn 2% khối lượng thân/ ngày, cho ăn ngày 2 lần vào buổi sáng và chiều

- Thí nghiệm cảm nhiễm: Mỗi con cá ở các lô thí nghiệm được tiêm dưới da 0,2 ml dung dịch chứa vi khuẩn (lô đối chứng được tiêm 0,2 ml dung dịch nước muối sinh lý (0,85% NaCl) vô trùng)

- Theo dõi cá thí nghiệm: Cá thí nghiệm được cho ăn và chăm sóc bình thường như trước khi thí nghiệm, đồng thời theo dõi các biểu hiện của cá sau khi tiêm Khi cá bị bệnh, quan sát các biểu hiện bệnh bên ngoài, giải phẫu để kiểm tra

sự biến đổi các nội quan bên trong và thu mẫu bệnh phẩm để nghiên cứu vi khuẩn

- Tính LD50 (Liều gây chết 50% cá thể sau khi thí nghiệm): LD50 được xác định theo công thức của Reed và Muench (1938)

LD50 = Nồng độ gây chết lớn hơn 50% thấp nhất trừ cho số nội suy (p.d)

pd =

%

%

% 50

%

H L

L



 (L là tỷ lệ chết trên 50% thấp nhất; H là tỷ lệ chết dưới 50% cao nhất.)

Thí nghiệm được tóm tắt qua sơ đồ hình 2.2 sau:

2.10 Phương pháp thử nghiệm độ nhạy kháng sinh (kháng sinh đồ)

+ Môi trường và vật liệu cần thiết:

- Môi trường TSA + 2% NaCl, nước muối 2% NaCl vô trùng

- Đĩa giấy kháng sinh các loại: nalidixic acid, gentamycin, ampicillin, ciprofloxacin, cephalexin, tetracyclin, erythromycin, streptomycin, nofloxacin, kanamycin

Nuôi cấy tăng sinh

Xác định mật độ vi khuẩn

Đo chiều dài và cân khối lượng

Chia cá ngẫu nhiên vào các lô

Tiêm 0,2 ml dịch VK/1con cá

Lô TN 1

106CFU/g

Lô TN 2

105CFU/g

Lô TN 3

104CFU/g

Lô TN 5 NaCl 0,85% (Đ/C)

Lô TN 4

103CFU/g

- Theo dõi các biểu hiện ở bên ngoài và trong, ghi nhận các các thay đổi và biểu hiện bệnh của

+ Phương pháp tiến hành:

- Vi khuẩn thử nghiệm độ nhạy kháng sinh được lấy từ các khuẩn lạc đã được làm thuần và nuôi cấy trên môi trường TSA (2% NaCl)/ 18 - 24 giờ Sau đó huyền phù trong môi trường nước muối vô trùng 2% NaCl đến mật độ khoảng 108 CFU/ml

- Hút dung dịch huyền phù vi khuẩn này cấy lên đĩa lồng chứa TSA (2% NaCl) đã chuẩn bị sẵn, dùng que trang thủy tinh trang đều dung dịch vi khuẩn lên mặt thạch TSA, đặt vào tủ ấm sấy khô trong 15 phút

- Đặt các đĩa giấy kháng sinh lên mặt thạch sao cho các đĩa giấy cách nhau từ 1,5 - 2cm

- Lật ngược đĩa lồng, ủ ở 29 - 310C/24 giờ

- Đo đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy kháng sinh Dựa vào độ nhạy chuẩn của từng loại kháng sinh để so sánh với độ nhạy thực nghiệm đạt được

Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel

Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả kiểm tra các yếu tố môi trường nước tại thời điểm thu mẫu

cá bệnh

Nhân tố môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của

cá Nếu môi trường thay đổi theo hướng bất lợi sẽ làm cho cá bị yếu đi và trở thành yếu tố trực tiếp gây bệnh hoặc tạo cơ hội cho tác nhân gây bệnh khác phát huy hiệu quả gây bệnh trên cá Việc phân tích các thông số môi trường nước ở thời điểm cá

bị bệnh là rất quan trọng và là cơ sở để xác định tác nhân gây bệnh chính cho cá 3.1.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý nước tại vùng nuôi

Cùng với việc thu mẫu cá bệnh, mẫu nước vùng nuôi cá cũng được thu và đem về phòng thí nghiệm để phân tích các chỉ tiêu hóa lý cần thiết Kết quả phân tích cho thấy, các yếu tố như nhiệt độ nước, pH, độ mặn, độ kiềm, oxy hòa tan (DO), nhu cầu oxy hóa học (COD), nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), amonia (NH4+-N), nitrate (NO3

N), nitrite (NO2

-N) đều nằm trong giới hạn cho phép đối với nước nuôi trồng thủy sản Chỉ riêng có nồng độ Sulfide (S2-) và phosphate (PO43--P) có vượt giới hạn nhưng không nhiều Cụ thể, đối với sulfide (S2-) đo ở các đợt 2 (0,007 mg/l) và 4 (0,006 mg/l) vượt quá giới hạn cho phép là 0,005mg/l, phosphate (PO43--P) trong các đợt đo luôn ở mức bằng hoặc cao hơn so với tiêu chuẩn cho phép, nhưng cao hơn không nhiều, cao nhất là đợt phân tích mẫu thứ 5 (0,020 mg/l)

-Theo Sena S De Silva (1998), đối với môi trường nuôi cá chẽm, giới hạn cho phép đối với H2S là <0,3 mg/l, điều kiện tối ưu để cá phát triển tốt là 0 mg/l; nhiệt độ tối ưu: 26 - 320C (giới hạn >150C); độ mặn: 0 - 35‰; pH tối ưu từ 7,5 - 8,5 (giới hạn >4); amonia (NH4

+-N) tối ưu là 0 mg/l (giới hạn <0,46 mg/l); oxy hòa tan (DO) tối ưu từ 4 - 9 mg/l (giới hạn >1 mg/l)[64] Cũng theo một tài liệu khác là “sinh học và kỹ thuật nuôi cá chẽm” của Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ (1994) thì vị trí chọn vùng nuôi thích hợp cho cá chẽm là ở môi trường nước có: pH từ 7,5 - 8,5; oxy hòa tan nằm trong khoảng 4 - 9 mg/l; độ mặn 10 - 30‰; nhiệt độ từ 26 - 320C;