Bài viết thực hiện nghiên cứu nhằm phát triển một chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) để xác định nhanh chóng V. vulnificus thông qua hai mươi mồi ngẫu nhiên đã được sử dụng cho phản ứng PCR-RAPD để phát hiện đa hình DNA giữa các loài Vibrio.
Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 99–108, 2020 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 PHÁT TRIỂN CHỈ THỊ PHÂN TỬ SCAR NHẬN DIỆN LỒI Vibrio vulnificus GÂY BỆNH LỞ LT TRÊN CÁ NI TẠI TỈNH THỪA THIÊN HUẾ Hoàng Tấn Quảng1, Phạm Thị Diễm Thi1, Trần Thúy Lan1, Phạm Thị Hải Yến2, Trần Quang Khánh Vân2, Nguyễn Duy Quỳnh Trâm2* Viện Công nghệ sinh học, Đại học Huế, Tỉnh lộ 10, Phú Thượng, Phú Vang, Thừa Thiên Huế, Việt Nam Trường đại học Nông Lâm, Đại học Huế, 102 Phùng Hưng, Huế, Việt Nam * Tác giả liên hệ Nguyễn Duy Quỳnh Trâm (Ngày nhận bài: 18-04-2020; Ngày chấp nhận đăng: 28-05-2020) Tóm tắt Vi khuẩn Vibrio vulnificus xuất phổ biến cá nuôi bị bệnh xuất huyết tỉnh Thừa Thiên Huế mầm bệnh hội người, gây nhiễm trùng máu nguyên phát, nhiễm trùng vết thương viêm dày, ruột Vì vậy, chúng tơi thực nghiên cứu nhằm phát triển thị phân tử dựa kỹ thuật đa hình đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) để xác định nhanh chóng V vulnificus Hai mươi mồi ngẫu nhiên sử dụng cho phản ứng PCR-RAPD để phát đa hình DNA lồi Vibrio Trong đó, mồi OPA-09 tạo sản phẩm khuếch đại đặc hiệu cho loài V vulnificus với chiều dài 1356 bp Trình tự thiết kế mồi đặc hiệu chuyển thành thị SCAR với chiều dài 938 bp (A9-938) Cặp mồi đặc hiệu (Vvul-1F/Vvul-938R) khuếch đại băng tất chủng V vulnificus khơng xuất lồi Vibrio khác Đây thị có độ đặc hiệu cao sử dụng để nhận diện V vulnificus mẫu hải sản Từ khóa: bệnh xuất huyết, cá, RAPD, SCAR, Vibrio vulnificus Development of a diagnostic SCAR marker for Vibrio vulnificus causing ulcerative disease in marine fishes in Thua Thien Hue Hoang Tan Quang1, Pham Thi Diem Thi1, Tran Thuy Lan1, Pham Thi Hai Yen2, Tran Quang Khanh Van2, Nguyen Duy Quynh Tram2* Institute of Biotechnology, Hue University, Road No 10, Phu Thuong, Phu Vang, Thua Thien Hue, Vietnam University of Agriculture and Forestry, Hue University, 102 Phung Hung St., Hue, Vietnam * Correspondence to Nguyen Duy Quynh Tram (Received: 18 April 2020; Accepted: 28 May 2020) Abstract Vibrio vulnificus is widespread on cultured fish with the ulcerative disease in the Thua Thien Hue province, Vietnam, and it is a potential human pathogen that can cause primary septicemia, wound infection, and gastroenteritis in susceptible individuals Thus, this study is conducted to develop a molecular marker generated from random amplified polymorphic DNA (RAPD) for the rapid detection of V vulnificus Twenty random primers were tested by using the RAPD method to detect DNA polymorphisms among Vibrio species The random primer OPA-09 generates a 1356-bp DNA fragment DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5780 99 Hoàng Tấn Quảng CS specific for V vulnificus This sequence was designed for a specific primer, and it was transferred to a sequence-characterized amplified region (SCAR) marker with a length of 938 bp (A9-938) Specific primers (Vvul-1F/Vvul-938R) amplifies a unique DNA fragment in all isolates of V vulnificus but not in other tested Vibrio species This marker is highly specific and can be used to identify the presence of V vulnificus in seafood Keywords: fish, RAPD, SCAR, Vibrio vulnificus, ulcerative disease Đặt vấn đề [7] Ví dụ, sử dụng thị SCAR để xác định đối tượng gây bệnh vật nuôi xác định Nhóm vi khuẩn Vibrio xác định tác loài Actinobacillus pleuropneumoniae [8], nhân gây bệnh phổ biến loài cá biển Pseudomonas syringae [9], Pseudofabraea citricarpa giới tỷ lệ cá chết đợt dịch Vibrio có [10], Bipolaris sorokiniana [11]… Tuy nhiên, sử dụng thể 50% Cá có dấu hiệu hôn mê; màu sắc thị SCAR để xác định loài Vibrio chưa thể biến đổi xuất vùng hoại tử Khi cá bị công bố trước bệnh nặng, nội quan xuất huyết bên chứa đầy dịch lỏng [1] Trong loài Vibrio gây bệnh cá, Vibrio vulnificus loài phổ biến Loài gây bệnh cá chim vây vàng (Trachinotus ovatus) [2], cá bớp (Rachycertron canadum) [1]… Đây vi khuẩn gram âm, hình que, tác nhân gây bệnh người nguyên nhân gây tử vong liên quan đến hải sản toàn giới [3] V vulnificus mầm bệnh hội người, Tại Thừa Thiên Huế, sáu chủng Vibrio vulfinicus tìm thấy cá chẽm cá hồng mỹ bị bệnh lở loét [12] Do đó, nghiên cứu nhằm phát triển thị phân chẩn đốn có mặt V vulnificus có mẫu cá, cung cấp liệu khoa học làm sở cho việc nghiên cứu sản xuất kit chẩn đốn nhanh Vibrio tương lai gây nhiễm trùng máu nguyên phát, nhiễm trùng vết thương viêm dày, ruột người nhạy cảm [4] Đối tượng phương pháp 2.1 Các chủng Vibrio Trước đây, việc định danh loài Vibrio spp thực thông qua bước bao gồm phân lập môi trường thạch máu, xét nghiệm sinh hóa huyết học Tuy nhiên, ngày PCR phương pháp nhanh chóng linh hoạt để định danh Vibrio spp [5, 6] Đa hình đoạn khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) kỹ thuật dựa PCR, khuếch đại đoạn DNA mồi ngẫu nhiên Ưu điểm RAPD nhanh dễ dàng thực hiện, không cần Các chủng Vibrio phân lập từ loài cá nuôi địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế (Bảng 1) Đây chủng định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rDNA với cặp mồi 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) Đặc điểm chủng mô tả công bố trước [12] 2.2 Tách chiết DNA tổng số liệu trình tự để thiết kế mồi, phân bố ngẫu Khuẩn lạc Vibrio nuôi môi nhiên hệ gen thị trội Tuy nhiên, trường ASPW (alkaline saline peptone water) có thị RAPD khơng phù hợp để định danh lồi độ 2% peptone 2% NaCl, pH 8,6, tốc độ lắc 180 lặp lại thấp khơng phải thị đồng trội Chỉ vịng/phút 18 30 °C Sinh khối tế bào thị RAPD chuyển thành thị đồng thu cách ly tâm 13.000 vòng/phút trội thị SCAR (sequence-characterized phút °C [13] DNA tổng số tách chiết amplified region) để sử dụng xác định loài 100 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 99–108, 2020 AquaPure Genomic DNA Isolaton Kit (Cat tạo dòng vào vector pGEM-T Easy (Promega, Hoa 732-6340, Bio-rad) theo hướng dẫn nhà sản Kỳ) biến nạp vào tế bào Escherichia coli TOP10 xuất sau lưu trữ °C Nồng độ DNA theo hướng dẫn nhà sản xuất Khuẩn lạc tổng số xác định máy quang phổ bước dương tính xác định PCR với mồi M13; sóng 260/280 nm DNA khn mẫu pha loãng plasmid phân lập đoạn đặc hiệu giải đến nồng độ 50 ng/µL cho phản ứng khuếch trình tự cơng ty Firstbase sử dụng mồi M13 đại PCR (Malaysia) 2.3 2.5 Phân tích RAPD Phát triển thị SCAR Hỗn hợp DNA tổng số loài sử Các cặp mồi SCAR thiết kế dựa dụng làm khuôn mẫu để phân tích PCR-RAPD trình tự nucleotide đoạn đặc hiệu (Bảng 3) Để (Bảng 1) Hai mươi mồi RAPD (Operon Technologies, xác định tính đặc hiệu thị SCAR, cặp Hoa Kỳ) thử nghiệm để phát loài mồi sử dụng để đánh giá dựa DNA Vibrio vulnificus (Bảng 2) Các băng đặc hiệu cho tổng số mẫu nghiên cứu, bao gồm sáu lồi V vulfinicus (khơng xuất loài Vibrio chủng V vulfinicus loài Vibrio gây bệnh khác khác) khẳng định thí nghiệm lặp lại Phản ứng PCR thiết kế với tổng thể tích phản sau sử dụng cho nghiên cứu ứng 12 µL, bao gồm 50 ng DNA khuôn mẫu, 10 Phản ứng PCR-RAPD thực theo Quang pmol mồi loại, µL 2ì GoTaqđ Green Master v cs [12] Mix (Promega, USA) nước cất vơ trùng Q 2.4 trình khuếch đại PCR thực máy Tạo dòng phân tích trình tự Các đoạn khuếch đại đặc hiệu loài V vulfinicus thu hồi tinh chế từ agarose gel GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific, Lithuania) Sản phẩm DNA luân nhiệt MJ Mini™ Thermal Cycler (Bio-Rad, USA) với quy trình sau: 95 °C phút; theo sau 30 chu kỳ bao gồm 95 °C phút, 60 °C phút 72 °C phút; chu kỳ cuối 72 °C 10 phút Bảng Danh sách mẫu DNA tổng số chủng Vibrio [12] Ký hiệu DNA tổng số V1 Loài Vibrio parahaemolyticus Số lượng chủng 13 Ký hiệu mẫu VT19, VT34, VT41, VT44, VT59, VT62, VX01, K5, VT56, VC85, VC59, VC39, VC41 V2 Vibrio shilonii VT23, VT26, VT27, VT29, VT33 V3 Vibrio vulnificus VC15, VC17, VC21, VC28, VC37, VC67 V4 Vibrio harveyi VC24, VC25, VC45 V5 Vibrio cholera VC43, VC53, VC61 V6 Vibrio communis VT47 V7 Vibrio furnissii VT65 V8 Vibrio brasiliensis VC52 DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5780 101 Hồng Tấn Quảng CS Bảng Trình tự mồi sử dụng cho lồi Vibrio vulfinicus Mồi Trình tự nucleotide (5’–3’) Số lượng băng đặc hiệu Độ sáng băng đặc hiệu OPA–01 CAGGCCCTTC Mờ OPA–02 TGCCGAGCTG Trung bình OPA–03 AGTCAGCCAC Mờ OPA–09 GGGTAACGCC Sáng trung bình OPA–11 CAATCGCCGT – OPB–01 GTTTCGCTCC – OPB–04 GGACTGGAGT – OPB–18 CCACAGCAGT Trung bình OPC–13 AAGCCTCGTC – OPD–02 GGACCCAACC – OPD–07 TTGGCACGGG – OPD–11 AGCGCCATTG – OPF–04 GGTGATCAGG Trung bình OPF–08 GGGATATCGG – OPG–06 GTGCCTAACC – OPG–10 AGGGCCGTCT – OPG–17 ACGACCGACA – OPK–13 GGTTGTACCC – OPN–03 GGTACTCCCC Trung bình OPN–06 GAGACGCACA – Tổng 11 Bảng Trình tự mồi phát triển thị SCAR Mồi Xuôi Ngược Tên mồi Trình tự nucleotide (5’-3’) Tm Chiều dài (bp) Vvul-1F GGGTAACGCCTATTCAAACAG 63 21 Vvul-101F CGCTCTCCAACCAACCG 67 18 Vvul-350F AAGCCGGGTGTGGCAATTA 68 19 Vvul-549F TCACCGAACTGCTTTACAAAC 63 21 Vvul-368R TAATTGCCACACCCGGCTT 68 19 Vvul-938R ATAACTGAATACGCTCAGTC 59 20 Vvul-1356R GGGTAACGCCACATACGAATG 66 21 số thay cho mẫu riêng lẻ để tìm kiếm băng Kết thảo luận 3.1 Phân tích RAPD mà không xuất mẫu khác) DNA tổng số Để làm giảm số lượng mẫu cần phần phân hỗn hợp DNA tất chủng tích RAPD, chúng tơi sử dụng mẫu DNA tổng loài với tỷ lệ trộn Trong nghiên DNA đặc hiệu (băng xuất mẫu quan tâm 102 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 99–108, 2020 cứu này, chúng tơi có tám mẫu DNA tổng số cho khuếch đại mạnh (Bảng 2) tám loài V parahaemolyticus, V shilonii, V 3.2 vulnificus, V harveyi, V cholera, V communis, V furnissii V brasiliensis (Bảng 1) Phát triển thị SCAR Băng A09-1400 lựa chọn để phát triển thành thị SCAR, sau tạo dịng phân Từ 20 mồi RAPD sử dụng ban đầu, chúng tơi tích trình tự Trình tự nucleotide thu có chiều thu 66 băng khuếch đại từ loài Vibrio dài 1356 bp; tỷ lệ GC 42,70% Kết so sánh vulfinicus (0–10 DNA band/mồi); phần lớn trình tự thu với trình tự cơng bố chúng băng đa hình lồi (Hình 1) Trong ngân hàng gen cho thấy chúng có tương đồng đó, có 11 băng đặc hiệu cho lồi V vulnificus thu 98,73% với chủng V vulfinicus FORC_016, từ mồi ngẫu nhiên (Bảng 2) Tuy nhiên, có tồn gen mã hóa enzyme cyclopropane-fatty- 11 băng đặc hiệu thu có băng có acyl-phospholipid synthase (EC:2.1.1.79, mã số tín hiệu khuếch đại mạnh (băng sáng) kích protein ANH62955) So với lồi Vibrio khác, thước nhỏ Phần lớn băng thu có tín trình tự tương đồng khoảng 70%; hiệu khuếch đại vừa phải kích thước lớn chẳng hạn, tương đồng 70,97% với loài V (hơn 2.000 bp) không phù hợp để làm thị parahaemolyticus FORC_071, 70,64% với lồi V Trong đó, chúng tơi chọn băng alginolyticus khuếch đại có kích thước khoảng 1.400 bp (ký hiệu neocaledonicus CGJ02-2, 70,62% với loài V diabolicus A09-1400 dựa theo tên mồi kích thước băng) LMG 3418, 70,55% với loài V harveyi WXL538, để phát triển thành thị SCAR Đây đoạn có 69,43% với lồi V natriegens NBRC 15636, kích thước tương đối lớn, băng khuếch đại 72,57% với lồi V azureus LC2-005 (Hình 2, mạnh có độ đặc hiệu cao Các băng đặc hiệu có trình bày đoạn có khác biệt lớn sử kích thước nhỏ thường băng dụng để thiết kế mồi đặc hiệu) K09K1, 70,50% với loài V Hình Các băng đặc hiệu cho lồi V vulfinicus thông qua khuếch đại hỗn hợp DNA với mồi ngẫu nhiên Mũi tên băng đặc hiệu; M: DNA molecular size marker (GeneRulerTM DNA kb ladder, Thermo Fisher Scientific) A mồi OPA-03 OPA-09; B mồi OPG-17 OPN-03 DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5780 103 Hoàng Tấn Quảng CS Từ kết này, thiết kế chủng V vulfinicus chủng có khác cặp mồi đặc hiệu dựa so sánh trình tự V paraheamoliticus, V harveyi, V cholerae… Mục tiêu với chủng thu Các cặp chọn đoạn đặc hiệu có kích thước mồi thiết kế để thu đoạn đặc hiệu vừa phải thỏa mãn điều kiện xuất sáu có kích thước khác (Bảng 3) Các mồi chủng V vulfinicus mà không xuất chủng sử dụng để khuếch đại DNA tổng số sáu khác 104 CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 CP032213 Vvul ACCTCTGCTCGATTAAAACGTAAGTGCCATTCGTTCA-GCGTCTTGGCGTAGTCCAAACC 60 TCTTCAGCTTGATTAAATCTAGAGTGCCACTCGCTCA-AGGTTTTCGCATAGTCCAGACC -ATTGATTAAAGCGGTGGTGCCATTCGTTAA-GCGTCTTGGCGTAATCCAACCC TCCTCAGCTTGATTAAACCGGCGATGCCATTCATTGA-GTGTTTTCGCATAATCGAGGCC CTTTGTGCCTGATTAAAACGCTGATGCCACTCATTAA-GTGTCTTGGCATAATCCAACCC TCGGAACACCAATTCAAACAGTAAAAGTGATGGTTGGAATCTACTGGCATGCGTTGAGGT TCGTTACACCAATACAAACGGTAAAAGTAATGGTTGGTATTTATTGGCACGCATTAAAAC GGGTAACGCCTATTCAAACAGTAAAAGTGTTGGTAGGGATTTACTGGCATGCGTTCAAAC Vvul-1F→ ** ** * * * * ** CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 CP032213 Vvul 61 AATATCGAACAAGTCTCGCGTCACTAAGTCACTGTATTTTGTTGTGGCTTGGGTTAGTGA 120 AATATCAAATAAGTCTCTCACCACCAAGTCACTGTATTTGGTCGCAGCTTGAGTTAAAGA AATATCAAACAAGTCTCGCGTCACCAAGTCACTGTGTTTAGTTGTTGCTTGGGTGAGTGA GATATCGAACAGGTCTCGAACAACAAGATCACTGTACTTTGTCGCCGCTTGAGTCAGAGA AATATCAAACAGGTCTCTAACCACAAAGTCACTGTACTTGGTCGTCGCCTGAGTTAATGC TATGGATTAAAGGTGCGCCGTTTTATTCCCACCCTAAATATTTGACGACCAATGAACGTC TTTGGGTGAAAGGCGCACCTTTTTATTCTCATCCTAAATATTCAACGCATGAAGAAATAG TGTGGAAAAAAGGTGCACCATTTTACTCGCATCCCAAATAC-CGCTCTCCAACCAAC—C * * * * ** * Vvul-101F→ * CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 CP032213 Vvul 121 GGTTACCGACGGTAAAAAACCACCCGGGAAAATGTACTTTTGGATAAAGTCGACGTTGTT 180 TGTAACCGAAGGTAAGAACCCACCTGGAAAGATGTATTTCTGAATAAAGTCAACGTTGTT CGTTACCGAAGGTAAAAAGCCGCCGGGGAAAATGTACTTCTGAATGAAGTCGACATTGTT AGTCACTGAAGGTAAAAATCCACCTGGAAATATGTACTTTTGAATAAAATCGACGTTATT GGTAATAGAAGGTAGGAAACCACCTGGGAAAATATATTTTTGAATAAAATCAACACTATT AA GCCTCTAGCGACAAATAAGATAAGAAAA -AT -AATAAGCACAAGGAGAAT AA GCCGATATTGAAAAAACAGACAAAAAAA -AT -AAAAAGCACAAGGAGAAT GG ACTGAGAGTAACAACTAAACTGTGAAGA -AT -AATAAAGTTAGGGAGAAT ** ** * * * * * CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 CP032213 Vvul 361 TTTGAGTAGCGTGATTTTGTCTTCTAAGCCACGCTCTTTGATTTTTTGCTCCGCGTACGC 420 TTTTAATAGAGTGATCTTGTCGCCCAAATTTCGCTCTCTAATTTTTTGTTCAGCGTAAGC TTTGAGCAAGGTAATTTTGTCGGTCAAACCACGCTCATTTATCTTCTGTTCTGCGTAGGC TTTAAGCAAGGTGATTTTATCCGACAAGCCTTTCTCTTCAATCTGTTGCTTGGCGTAGGC TTTAAGCAACGTAATCTGATCCATTAAACCTCTTTGTTTGATCAGTTCTTCGGTATAAAG TTACTGCGCCAAACGGAGAATACAGTGGCCAACCTGTCGTTGCGACCATTGAGGTTAAGC TTAGTGCGCCAAATGGGGAGTACAGTGGTCAACCTGTTGTCGCTACTATAGAGGTAAAAC TTGTAGGGGTCCACAATCACAAGCCGGGTGTGGCAATTAGCGCAACAATAGAAGTCAAAC ** Vvul-350F→ ←Vvul-368R * CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 541 TCAAGTTGCTGACATAGACGATCCATTTTGTTGATTTGAGCCTGCTCTAGAGAGTCATCC 600 TCAAGTTGCTGGCACAAACGATCCATTTTGTTGATTTGCGCTTGTTCCAAAGTATCGTTG TCAAGTTGTTGACACAGGCGTTCCATCTTATTGATTTGCGCCTGCTCTAATGAGTCATCC TCGATCTGTTGGCAAAGACGATCCATTTTATTGATTTGCGCCTGCTCTAGTGACTCACTA GCCAATTGTTGACATAGCCGCTCCATTTTATTGATTTGAGCCTGTTCTAAGCTATCACTG ATGCGGGCCCTTGATAAGCTTGAGGAGCAGGGTAGTTG-GCTTACCAAGTTACTTTATAA pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 99–108, 2020 CP032213 Vvul ATGCGTGCTTTAGATAAACTCGAAGAGCAAGGCAGTTG-GTTGACTAAAATACTGTACAA CTGAATGCATTAGATGGATTAGAAAACCAAAGTAGCTG-GGTCACCGAACTGCTTTACAA * * ** * Vvul-549F→ CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 CP032213 Vvul 601 GCATGATTGTAAAGCGCCGACGAATACAGCATATTGATATCAAGGAACGCTTCGTATAGG TCTTGCACATATAAGGCCGATGAGTACAGCATGTTGTCGTCTAAAAATGACTCGTACAAA ACTTGGTTGTACAGGGCCGACGAGTACAGCATATTCGTATCAAGAAATGCTTCATACAAA CCTTGGCGATAAAGCGCAGATGAATAGAGCATATTACTGTCTAGAAATGACTCATACAGC TCTTGAAGGTATAAAGCCGAGGAGTAGAGCATTCTTTCATCAAGAAACGTCTCATAAAGC GTTTAGCCATTGGACGAATCGAAACTCGCAAGAAAACTCTCGGAAGAACATCCATGCTCA GTTCAGTCATTGGTCAAACAGAAACTCTGAAGAGAACTCACGTAAAAATATCCATGCGCA ACTCAGTCATTGGAGCAATCGAAATACGCAGGAAAACTCGCGTAAAAATATTCATGCCCA * * * * * * CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 CP032213 Vvul 901 GCCCTGCAAGATCCGTGAATAAAAGCCTGGATGTTTTACCTCTATAGTAGCGACAACAGG ACCTTGCAAGATTCGCGAGTAAAAGCCAGGATGCTTTACCTCAATCGTCGCCACAACAGG GCCCTGTAGAATTCGGGAGTAGAACCCCGGATGCTTAACTTCAATAGTTGCAGCAACGGG ACCTCGTAAAATACGTGAGTACAAACCGGGATGTTTCACCTCGATGGTCGCCGACACAGG ACCTTGTAAAATCCGCGAGTAAAATCCAGGGTGCTTGACCTCAATTGTCGCTGCAGCAAG ATTTCGGAAGAGCAGTATGAGTATGCTCGACAGCAAATCGTACAACGAGGTTTAGCCGAT ATATCTGAAGAGCAACACGCGTACGCGGAGCAAAAAATCATAGAGCGTGGCTTAGAAGAC ATTTCAGATGAGCAATATGACTACGCAAAACAACAGATTGCAGAAAGAGGTTTGACTGAG * * * * * * * CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 CP032213 Vvul 961 TTGACCACTGTACTCCCCATTTGGCGCACTAAAACGCTCGCTTCGCTCTGTCGTTTCCGT CTGACCGCTGTATTCACCGTTGGGCGCATTAAAGCGCTCGCTTCTTTCTTTCGTTTCCGT TTCTCCGTTATGCTCACCATTGGGCGTCGAAAAACGCTCGCTACGCTCAGTCGTTTCTGT CTCCTCGCGATACATACCAGCCGGTGCTGTAAATCGTTCGCTTCTTTCTGCTCCGCCGGA GACACCATTGTGTTCAAGCATCTGGGTTGCGAATCGTTCACTCCGCTCTGTCGTGCCTGT CGAATTACTTTACTTAAAGAAGACTACCGTAATCTTACTGGGACGTACGATAAATTGGTT AAAATCACTCTACTCAAAGAAGATTACCGAAACCTAACCGGAACTTATGACAAGCTCGTT CGTATTCAGTTATTGAAGAAAGATTATCGAGATTTAACTGGGCAGTTTGATAAATTGGTT ←Vvul-938R * * CP017919 CP014134 CP045070 CP009977 CP018616 CP023485 CP032213 Vvul 1380 TGCGTGCCAATAAATACCAACCATTACTTTTACCGTTTGTATTGGTGTAA 1430 TGCGTGCCAATAAATACCAACCATTACTTTTACCGTCTGTATTGGCGTAA TGCGTGCCAATAAATACCAACCATTACTTTTACCGTTTGAATCGGCGTAA TGCGTGCCAGTAAATGCCAAACACCACTTTGACTGTTTGTATCGGTGTGA TGCATGCCAATAGATACCCACCATCACTTTTACCGTTTGAATAGGAGTTA GTACGAGGGTTTGGGTACGATGACCGGTTTGTCCGCATGTGGCGTTA GTGCGCTCGTTTGGCTACGACGACCGCTTTGTGCGTATGTGGCGCTACTA GTAAAAAGACTAGGGTATGACGAGCGATTCATTCGTATGTGGCGTTACCC * * * ** * ** * ←Vvul-1356R Hình So sánh trình tự nucleotide đoạn A9-1400 với trình tự khác ngân hàng gen (các vùng thiết kế mồi) CP023485: V parahaemolyticus FORC_071; CP017919: V alginolyticus K09K1; CP032213: V neocaledonicus CGJ02-2; CP014134: V diabolicus LMG 3418; CP045070: V harveyi WXL538; CP009977: V natriegens NBRC_15636; CP018616: V azureus LC2-005 Phần gạch chân trình tự mồi; tên mồi thể bên trình tự mồi Từ Bảng 3, chúng tơi có tổng cộng tám tổ mẫu V vulnificus khơng có sản phẩm khuếch đại hợp PCR để tuyển chọn thị SCAR cho loài V mẫu đại diện khác; cặp mồi vulnificus Trong tám cặp mồi, có hai cặp mồi sử dụng để làm thị SCAR Trong hai cặp mồi Vvul-1F/Vvul-1356R (Hình 3a) Vvul-1F/Vvul- này, ưu tiên sử dụng cặp mồi Vvul- 938R (Hình 3c) có sản phẩm khuếch đại sáu 1F/Vvul-938R có băng khuếch đại mạnh DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5780 105 Hồng Tấn Quảng CS kích thước ngắn Tất cặp mồi lại Hiện nay, phương pháp định danh phân không đạt tiêu chí làm thị cho lồi V vulnificus tử cho lồi Vibrio spp cơng bố, bao Các cặp mồi có sản phẩm khuếch đại tương tự gồm xét nghiệm khuếch đại đẳng nhiệt qua trung lồi Vibrio khác (ví dụ cặp mồi Vvul-1F/Vvul- gian 368R, Hình 3b) khơng có sản phẩm khuếch amplification-LAMP) cho V parahaemolyticus [14], đại sáu chủng V vulnificus (đối với cặp multiplex PCR cho Vibrio spp [15] hay V vulnificus mồi lại, số liệu khơng trình bày chi tiết) [16]… PCR gen đặc hiệu cho Vibrio spp Sau đó, cặp mồi kiểm tra tất loài công bố [17]… Tuy nhiên, thị SCAR Vibrio có Kết cho thấy băng đặc hiệu cho lồi Vibrio spp chưa cơng bố ngoại xuất mẫu thuộc loài V Vulnificus mà trừ nghiên cứu nhóm chúng tơi vịng (loop-mediated isothermal khơng xuất lồi Vibrio khác (Hình 4) Hình Phản ứng PCR với cặp mồi cho loài V Vulnificus a Vvul-1F/Vvul-1356R; b Vvul-1F/Vvul-368R; c Vvul-1F/Vvul-938R; d Vvul-350F/Vvul-1356R; e Vvul-549F/Vvul938R; f Vvul-549F/Vvul-1356R; M: DNA molecular size marker (GeneRulerTM DNA kb ladder, Thermo Fisher Scientific) V vulnificus VC15; V vulnificus VC17; V vulnificus VC21; V vulnificus VC28; V vulnificus VC37; V vulnificus VC67; V paraheamoliticus; V harveyi; V cholerae; 10 Đối chứng (–) 106 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 99–108, 2020 Hình Phản ứng PCR với cặp mồi Vvul-1F/Vvul-938R M: DNA molecular size marker (GeneRulerTM DNA kb ladder, Thermo Fisher Scientific) V vulnificus VC15, V vulnificus VC17, V vulnificus VC21, V vulnificus VC28, V vulnificus VC37, V vulnificus VC67, V cholerae, V harveyi, V brasiliensis, 10 V paraheamoliticus, 11 V shilonii, 12 V communis, 13 V furnissii, 14 V fluvialis, 15 V natriegens, 16 Đối chứng (–) Trong nghiên cứu này, thị SCAR để phát V vulnificus cách nhanh chóng đặc chủng V vulnificus mà không xuất loài Vibrio khác hiệu cao phát triển đặt tên A9- Thông tin tài trợ 938 Có thể áp dụng mồi SCAR thiết kế để phát trực tiếp chủng V vulnificus có mẫu Độ đặc hiệu xác nhận Cơng trình thực với tài trợ PCR với tám loài Vibrio khác thị A9-938 Bộ Giáo dục Đào tạo (Việt Nam) năm 2018–2020 xuất lồi V vulnificus mà khơng (Đề tài mã số CT-2018-DHH-01 CT-2018-DHH- xuất loài khác Chỉ thị giúp việc 02) xác định có mặt chủng V vulnificus Tài liệu tham khảo nhanh chóng xác phương pháp vi sinh cổ điển So với phương pháp định danh phân tích trích tự gen 16S rDNA với vùng bảo tồn gen hemolysin cytolysin, phương pháp dùng thị SCAR có thời gian tiến hành ngắn giá thành thấp khơng phải phân tích trình tự gen Chỉ thị sử dụng nghiên cứu dịch tễ lẫn phát triển chương trình ni trồng thủy sản sau Kết luận Kết nghiên cứu cho thấy mức độ đa hình cao phân tích RAPD lồi Vibrio khác thị SCAR (A9-938) phát triển dựa trình tự đặc hiệu 1356 bp cho loài V vulnificus Cặp mồi đặc hiệu (Vvul-1F/Vvul-938R) khuếch đại đoạn DNA tất DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5780 An NTT, Hải TN, Dung TT Phân lập vi khuẩn Vibrio cá bớp (Rachycentron canadum) bị lở loét Báo cáo tại: Hội nghị khoa học trẻ thủy sản tồn quốc lần thứ IV; 2013; Hồ Chí Minh Li G, Zhao D, Huang L, Sun J, Gao D, Wang H, et al Identification and phylogenetic analysis of Vibrio vulnificus isolated from diseased Trachinotus ovatus in cage mariculture Aquaculture 2006;261(1):17-25 Heng SP, Letchumanan V, Deng CY, Ab Mutalib NS, Khan TM, Chuah LH, et al Vibrio vulnificus: An environmental and clinical burden Frontiers in Microbiology 2017;8:997- Strom MS, Paranjpye RN Epidemiology and pathogenesis of Vibrio vulnificus Microbes and Infection 2000;2(2):177-88 Ramazanzadeh R, Rouhi S, Shakib P, Shahbazi B, Bidarpour F, Karimi M Molecular characterization of Vibrio cholerae Isolated from clinical samples in Kurdistan province, Iran Jundishapur J Microbiol 2015;8(5):e18119-e 107 Hoàng Tấn Quảng CS Khanh NV, Linh NQ, Lan TT, Nhân LTT, Vân TQK, Cơ NTK, et al Phân lập sàng lọc chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm thẻ chân trắng ni Phong Điền, Thừa Thiên Huế thị phân tử 16S rRNA Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 2019;128(1E):47-58 Sairkar PK, Sharma A, Shukla NP SCAR marker for identification and discrimination of Commiphora wightii and C myrrha Mol Biol Int 2016;2016:1-10 Rossi CC, Pereira MF, Langford PR, Bazzolli DMS A BOX-SCAR fragment for the identification of Actinobacillus pleuropneumoniae FEMS Microbiology Letters 2014;352(1):32-7 Kałużna M, Albuquerque P, Tavares F, Sobiczewski P, Puławska J Development of SCAR markers for rapid and specific detection of Pseudomonas syringae pv morsprunorum races and 2, using conventional and real-time PCR Appl Microbiol Biotechnol 2016;100(8):3693-711 10 Yang Y, Hu J, Chen F, Ding D, Zhou C Development of a SCAR marker-based diagnostic method for the detection of the Citrus target spot pathogen Pseudofabraea citricarpa BioMed Research International 2018;2018:1-5 11 Aggarwal R, Gupta S, Banerjee S, Singh V Development of a SCAR marker for detection of Bipolaris sorokiniana causing spot blotch of wheat Canadian journal of microbiology 2011;57:934-42 12 Quang HT, Lan TT, Hai TTH, Yen PTH, Van TQK, Tung HT, et al Genetic diversity and toxic genes analysis of Vibrio spp isolated from white leg shrimp and marine fishes cultured in Tam Giang 108 lagoon in Thua Thien Hue province, Vietnam Indian Journal of Science & Technology 2020;13(13):1412-22 13 Quảng HT, Lan TT, Thi PTD, Nhân LTT, Ngọc LMT, Trâm NDQ, et al Xác định diện gen độc tố chủng Vibrio gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm Thừa Thiên Huế Tạp chí Khoa học, Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên 2020;129(1A):115-123 14 Anupama KP, Chakraborty A, Karunasagar I, Maiti B Loop-mediated isothermal amplification assay as a point-of-care diagnostic tool for Vibrio parahaemolyticus: recent developments and improvements Expert Review of Molecular Diagnostics 2019;19(3):229-39 15 Kim HJ, Ryu JO, Lee SY, Kim ES, Kim HY Multiplex PCR for detection of the Vibrio genus and five pathogenic Vibrio species with primer sets designed using comparative genomics BMC Microbiology 2015;15(1):239-50 16 Tsai YH, Chen PH, Yu PA, Chen CL, Kuo LT, Huang KC A multiplex PCR assay for detection of Vibrio vulnificus, Aeromonas hydrophila, methicillin-resistant Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, and Streptococcus agalactiae from the isolates of patients with necrotizing fasciitis International Journal of Infectious Diseases 2019;81:73-80 17 Alramahy SK Molecular diagnostics for Vibrio cholera based on recA gene isolated from human in Diwaniyah city Journal of Pharmaceutical Sciences and Research 2018;10:1125-7 ... trước bệnh nặng, nội quan xuất huyết bên chứa đầy dịch lỏng [1] Trong loài Vibrio gây bệnh cá, Vibrio vulnificus loài phổ biến Loài gây bệnh cá chim vây vàng (Trachinotus ovatus) [2], cá bớp... nhân gây bệnh người nguyên nhân gây tử vong liên quan đến hải sản toàn giới [3] V vulnificus mầm bệnh hội người, Tại Thừa Thiên Huế, sáu chủng Vibrio vulfinicus tìm thấy cá chẽm cá hồng mỹ bị bệnh. .. et al Phân lập sàng lọc chủng Vibrio parahaemolyticus gây bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm thẻ chân trắng nuôi Phong Điền, Thừa Thiên Huế thị phân tử 16S rRNA Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa