Mẫu vết loét và mang được cấy vào môi trường SA, nuôi cấy ở 28 - 300C/3 - 5 ngày. Trong 19 mẫu cá chỉ một lần xuất hiện nấm ở mang với các đặc điểm sợi nấm màu trắng, có vách ngăn, đính bào tử hình tròn chứa các bào tử nhỏ, tròn, có
màu đen.... Dựa vào các tài liệu, đề tài đề nghị đây là nấm thuộc giống Aspergillus,
với tần số bắt gặp là 1/19 (5,3%). Hình thái khuẩn ty, đính bào tử, cuống bào tử được thể hiện qua hình 3.4.
Qua tìm hiểu tài liệu ở Việt Nam và trên thế giới, chưa thấy có báo cáo nào
đề cập đến nấm Aspergillus gây bệnh trên cá chẽm. Các báo cáo về nấm gây bệnh trên cá chẽm thì chủ yếu là Aphanomyces invadens gây nên hội chứng lở loét (EUS)
trên cá chẽm nuôi ở nước ngọt, không thấy có báo cáo trên cá chẽm nuôi ở nước mặn[38]. Còn theo FAO thì các loài nấm gây bệnh trên cá chẽm nuôi nước mặn gồm
Saprolegnia spp., Branchiomyces sp. và Achlya spp. gây nên các bệnh “nấm da”
(integumentary mycosis) và bệnh “branchiomycosis”[36]. Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008), cũng đã phân lập được loài nấm này trên cá mú nuôi tại Khánh Hòa nhưng với tần số bắt gặp thấp và chưa có kết luận cụ thể liệu loài này có gây bệnh hay không[20]. Theo Alisa P. Alker (2001), đã mô tả loài Aspergillus sydowii là tác nhân gây bệnh trên san hô hình quạt (Gorgonia spp) ở vùng biển Caribbean[26], Neta
Ein-Gil (2009) cũng phát hiện Aspergillus sydowii gây bệnh trên bọt biển (Spongia obscura)[53]. Theo báo cáo của Olivier Grovel và ctv (2003), Aspergillus fumigatus
sinh ra độc tố gliotoxin tích lũy trong loài vẹm xanh (Mytilus edulis) có thể gây độc
cho người ăn vẹm[56].
3.2.3. Kết nghiên cứu ký sinh trùng ngoại ký sinh trên cá chẽm bị bệnh lở loét Qua kiểm tra 19 mẫu cá bị bệnh lở loét, chỉ phát hiện 2 loại ký sinh trùng ký
sinh trên cá chẽm là Pseudorhabdosynochus sp. và Zeylanicobdella sp..
- Sán lá đơn chủ monogenea: Ở mang cá, tần số bắt gặp 52,6% (10/19) là
loài Pseudorhabdosynochus sp. (thuộc giống Pseudorhabdosynochus, họ Diplectanidae, bộ Dactylogyrida, lớp Monogenea, ngành Plathyhelminthes).
Pseudorhabdosynochus sp. có kích thước dài khoảng 0,2 - 1,2mm, rộng từ
0,1 - 0,4mm, tần số bắt gặp 52,6%, cường độ cảm nhiễm từ 1 - 10 trùng/lá mang.
Pseudorhabdosynochus sp. ký sinh trên mang cá, hút máu và chất dinh dưỡng, làm
tổn thương mang. Loài này có thể là tác nhân mở đường cho các tác nhân khác như
Hình 3.2. Nấm Aspergillus sp. phân lập được từ cá chẽm bị bệnh lở loét. A: khuẩn lạc trên môi trường Sabouraud agar, B: sợi nấm phân đốt, C: túi và cuống bào tử; D: bào tử.
vi khuẩn, virus xâm nhập và gây bệnh cho cá. Tuy nhiên, tần số bắt gặp của loài ký sinh trùng này là 52,6%, tức là gần một nửa trường hợp còn lại không bị nhiễm ký sinh trùng này nhưng cá vẫn bị bệnh. Điều này cho thấy rằng, có thể
Pseudorhabdosynochus sp. cũng là tác nhân cơ hội. Tức là, khi cá bị bệnh, cơ thể
yếu, bơi và hoạt động kém, ký sinh trùng sẽ dễ bám vào cơ thể cá. Xiang Y. Wu và
ctv (2005) cũng đã có báo cáo về Pseudorhabdosynochus seabassi ký sinh trên cá
chẽm nuôi lồng ở Quảng Đông, Trung Quốc[71]. Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv
(2008), phát hiện Pseudorhabdosynochus epinepheli và một số loài ký sinh trùng
khác là tác nhân mở đường cho vi khuẩn gây bệnh trên cá mú nuôi tại Khánh Hòa[20]. Theo Woo P.T.K (2002), Pseudorhabdosynochus thường gặp trên cá nuôi biển ở châu Á, có 2 loài thường gặp ở cá chẽm là P. lateis và P. monosquamodisci.[69].Theo Leong Tak Seng và ctv (2006), Pseudorhahdosynochus
sp. thường ký sinh trên mang cá, làm cho cơ thể cá trở nên đen, cá thường cọ vào lồng, mang nhợt nhạt, ăn kém, tiết nhiều dịch nhầy[47].
- Đỉa cá: Ký sinh trên da, tần số bắt gặp 10,5% (2/19) là loài Zeylanicobdella sp. (thuộc giống Zeylanicobdella, họ Piscicolidae, bộ Rhynchobdellida, lớp Hirudinea, ngành Annelida).
Zeylanicobdella sp. sống ký sinh trên da cá, hút máu và làm tổn thương da. Giống như Pseudorhahdosynochus sp., Zeylanicobdella sp. cũng có thể là tác nhân
mở đường cho các tác nhân gây bệnh khác xâm nhiễm vào cá và gây bệnh. Tuy (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhiên, với tần số bắt gặp thấp 10,5% (2/19), nên vai trò của Zeylanicobdella sp. trên
cá chẽm cũng có thể chỉ là tác nhân cơ hội. Cường độ cảm nhiễm của ký sinh trùng này ở cá CH4 là 23 trùng/ con cá và cá CH9 là 17 trùng/con cá. Theo Leong Tak Seng và ctv (2006), đỉa cá thường ký sinh trên cơ thể cá nuôi lồng biển ở khu vực châu Á Thái Bình Dương, chúng làm cho vây bị xơ, xuất huyết và sưng phồng ngay tại điểm đỉa bám, cá ăn kém và hoạt động yếu[47]. Nguyễn Thị Thanh Thùy và ctv (2008), khi tìm hiểu bệnh lở loét trên cá mú nuôi ở Khánh Hòa cũng bắt gặp đỉa cá nhưng với tỷ lệ cảm nhiễm thấp (6,3%)[20].
3.3. Kết quả kiểm tra mô cá bị bệnh bằng phương pháp mô học
Qua quá trình thực hiện cắt mô và quan sát dưới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần cho thấy các tổ chức mô gan, mô thận và vết loét bị biến đổi, nhiều tế bào bị phá hủy, đặc biệt trong mô gan và thận còn phát hiện thấy rất nhiều vi khuẩn tập trung thành từng đám hoặc riêng rẽ trong tế bào. Đây là một chứng cớ nữa cho thấy rằng khả năng vi khuẩn là tác nhân chính gây bệnh lở loét trên cá chẽm là rất lớn. Tuy nhiên, cần phải có thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn trở lại trên cá khỏe mới có các kết luận chính xác được liệu có phải vi khuẩn là tác nhân gây bệnh chính hay không. Kết quả kiểm tra mô học được thể hiện qua hình 3.5 và hình 3.6 sau.
Hình 3.5. Mô cơ cá khỏe và cá bị bệnh lở loét. A: mô cơ cá bệnh; B: mô cơ cá khỏe (ở độ phóng đại 10×40 lần).
Hình 3.6. Mô gan và mô thận của cá khỏe và cá bị bệnh lở loét. GA: mô gan cá bệnh; GB: mô gan cá khỏe; GC: mô gan cá khỏe theo Sonia Mumford và ctv, 2007.; TA: mô thận cá bệnh; TB: mô thận cá khỏe; TC: mô thận cá khỏe theo Sonia Mumford và ctv, 2007.[66](ở độ phóng đại 10×40 lần).
3.4. Kết quả cảm nhiễm chủng Vibrio alginolyticus (CH3G-TCBSVN)
phân lập từ cá chẽm bị bệnh lên cá chẽm khỏe
Qua kết quả phân lập tác nhân gây bệnh, kiểm tra mô học và các dấu hiệu
bệnh thu được, đề tài đã xác định V. alginolyticus có thể là tác nhân gây nên bệnh lở
loét ở cá chẽm nuôi và đã tiến hành thử nghiệm cảm nhiễm ngược trở lại vi khuẩn này trên cá chẽm khỏe với các liều thử thách là 1x103, 1x104, 1x105,1x106 CFU/g trọng lượng cơ thể cá. Qua hai lần thử nghiệm, đã thu được kết quả như sau:
3.4.1. Kết quả cảm nhiễm lần 1
- Cỡ cá thí nghiệm: Chiều dài thân trung bình: 18,5 (1,34)cm; cân nặng 76,7 (22,9)g
- Số lô bố trí thí nghiệm: 5 lô - Số cá mỗi lô: 6 con
- Nồng độ vi khuẩn tiêm mỗi lô:
+ Lô 1: 1×106 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 2: 1×105 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 3: 1×104 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 4: 1×103 CFU/g trọng lượng cơ thể cá
+ Lô 5 : Lô đối chứng, tiêm bằng nước muối sinh lý (0,85% NaCl). Kết quả thí nghiệm cho thấy:
Lô 1: Những ngày đầu vết tiêm tấy đỏ và sưng phồng lên, đến ngày thứ 3 cá có dấu hiệu tróc vảy ở vết tiêm và vết tiêm bị loét ngày càng lan rộng ra. Sau 96 giờ tiêm (4 ngày) thì cá chết 100%.
Lô 2: Những ngày đầu vết tiêm tấy đỏ, sau đó vết tiêm sưng phồng thành vết loét và vết loét lan rộng ra, cùng với đó là hiện tượng tróc vảy ở quanh vết loét. Sau 144 giờ (6 ngày) thì cá thí nghiệm chết 100%.
Lô 3 và lô 4: Trong 3 ngày đầu sau khi tiêm thì vết tiêm tấy đỏ và ngày càng lan rộng thành các vết loét, đến ngày thứ 4, vết loét lan rộng, có hiện tượng tróc vảy 2 bên sườn và lưng, vết loét lan dần từ sườn bên này sang sườn bên kia của cá, những ngày tiếp theo cá yếu dần. Đến ngày thứ 10 thí nghiệm cảm nhiễm thì lô 3 chết 66,33% con và lô 4 chết 33,32 %.
Lô 5: Cá vẫn khỏe mạnh và hoạt động bình thường từ đầu cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
Kết thúc đợt thí nghiệm thứ nhất cho thấy: Khi tiêm vi khuẩn vào cá khỏe, cá có các dấu hiệu bệnh giống với dấu hiệu cá bị bệnh ngoài tự nhiên là sau 4 ngày với sự lở loét và tróc vảy bên ngoài, cá hoạt động yếu. Giải phẩu bên trong cho thấy gan và thận cá sẫm màu. Khi phân lập trở lại cá thí nghiệm cảm nhiễm đã thu được
chủng V. alginolyticus, là chủng đã tiêm cảm nhiễm ban đầu.
Tỷ lệ chết của cá chẽm cảm nhiễm chủng V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN)
lần 1 được thể hiện qua biểu đồ 3.3 sau.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian cảm nhiễm (giờ)
T ỷ l ệ c h ế t tí c h l ũ y ( %) Nồng độ 1000 CFU/g Nồng độ 10000 CFU/g Nồng độ 100000 CFU/g Nồng độ 1000000 CFU/g
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ chết của cá chẽm cảm nhiễm chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus (CH3G-TCBSVN) lần 1.
3.4.2. Cảm nhiễm lần 2 (lặp lại) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Cỡ cá thí nghiệm: Chiều dài trung bình thân 20,6 ( 1,52) cm; cân nặng trung bình 106,8 (20,2)g
- Số lô bố trí thí nghiệm: 5 lô - Số cá mỗi lô: 6 con
- Nồng độ vi khuẩn tiêm mỗi lô:
+ Lô 1: 1×106 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 2: 1×105 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 3: 1×104 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 4: 1× 103 CFU/g trọng lượng cơ thể cá
+ Lô 5 : Lô đối chứng, tiêm bằng nước muối sinh lý (0,85% NaCl). Kết quả thí nghiệm cho thấy
Lô 1: Sau 24 giờ đầu tiên không có con cá nào chết, tuy nhiên cũng giống như lần thí nghiệm trước là các vết tiêm đỏ tấy, sang ngày thứ 2 thì cá đã bị chết và đến ngày thứ 5 thì 100% cá chết.
Lô 2: Đến ngày thí nghiệm thứ 3 cá bắt đầu chết và chết 100% sau 8 ngày thí nghiệm.
Lô 3: Những ngày đầu mới tiêm thì vết tiêm bị tấy đỏ, sau đó thành vết loét và cá có hiện tượng tróc vảy, cá bắt đầu chết từ ngày thứ 5 và sau 10 ngày thí nghiệm thì tỷ lệ cá chết là 50%.
Lô 4: Các dấu hiệu cũng tương tự như ở lô 3 nhưng đến ngày thứ 6 mới có 1 con chết (16,66%) và đây là con chết duy nhất của lô 4 trong đợt thí nghiệm này..
Lô 5: Trong suốt thời gian thí nghiệm cá vẫn khỏe và hoạt động, ăn bình thường.
Kết thúc đợt thí nghiệm cho thấy: Sau khi tiêm cảm nhiễm với tác nhân V. alginolyticus (CH3G-TCBS-VN), sau khoảng 4 ngày thì cá có các dấu hiệu giống
như cá bị bệnh lở loét ngoài tự nhiên, tức là vết loét lan rộng ra, có sự xuất huyết và tróc vảy. Giải phẫu bên trong thấy gan cá sẫm màu, vi khuẩn phân lập lại được từ
gan cá chính là vi khuẩn V. alginolyticus.
Qua 2 đợt thí nghiệm cảm nhiễm cùng một chủng vi khuẩn V. alginolyticus
(CH3G-TCBSVN) cho thấy, cá có các dấu hiệu giống nhau và giống với dấu hiệu
của cá bị bệnh ngoài tự nhiên. Từ kết quả này có thể kết luận V. alginolyticus là tác
nhân chính gây nên bệnh lở loét trên cá chẽm nuôi tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa trong đợt dịch lở loét vừa qua với liều gây chết LD50 sau 10 ngày là 1×104 CFU/g. Tuy nhiên, trong lần thí nghiệm thứ 2 thì cá chết chậm hơn điều này có thể là do ở lần thí nghiệm thứ 2 đề tài đã dùng cá có kích thước lớn hơn để tiêm cảm nhiễm, có thể cá có kích thước và trọng lượng lớn hơn nên sức đề kháng của cá có thể cao hơn so với các cá sử dụng để làm thí nghiệm cảm nhiễm lần đầu.
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian cảm nhiễm (giờ)
T ỷ l ệ ch ết t íc h l ũ y (%) Nồng độ 1000 CFU/g Nồng độ 10000 CFU/g Nồng độ 100000 CFU/g Nồng độ 1000000 CFU/g
Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ chết của cá chẽm cảm nhiễm chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus (CH3G-TCBSVN) lần 2.
Hình 3.8. Cá chẽm bị bệnh lở loét trong điều kiện thí nghiệm. Hình 3.7. Cá chẽm bị bệnh lở loét trong tự nhiên.
3.5. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ chủng Vibrio alginolyticus (CH3G-
TCBSVN) phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét
Sau khi xác định được V. alginolyticus là tác nhân chính gây bệnh lở loét
trên cá chẽm, đề tài đã tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ đối với 10 loại kháng sinh là tetracyclin (Tet), kanamycin (K), nofloxacin (Nor), streptomycin (S), erythromycin (Er), nalidixic acid (Ng), ciprofloxacin (Ci), gentamycin (Ge), cephalexin (Cp), ampicillin (Am) nhằm tìm ra kháng sinh phù hợp để điều trị bệnh cho cá. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ cho thấy có 2 loại kháng sinh nhạy cảm
cao với V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN) là tetracyclin, nalidixic acid; 4 loại
kháng sinh nhạy cảm ở mức trung bình là nofloxacin, streptomycin, ciprofloxacin và gentamycin; 4 loại kháng sinh bị kháng là kanamycin, erythromycin, cephalexin và ampicicllin. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ được trình bày cụ thể qua hình 3.9 và bảng 3.3.
Hình 3.9. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ chủng V. alginilyticus (CH3G- TCBSVN) phân lập được từ cá chẽm bị bệnh lở loét. Ng: Nalidixic acid; Ge: Gentamycin;
Am: Ampicillin; Ci: Ciprofloxacin; Cp: Cephalexin; Te: Tetracyclin; Er: Erythromycin; S: Streptomycin; Nor: Nofloxacin; K: Kanamycin. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Te Er Nor S Ng K Ci Ge Am Cp
3.6. Đề xuất phương pháp phòng trị bệnh cho cá chẽm bị bệnh lở loét
Việc chữa bệnh cho cá nói riêng và các động vật thủy sản khác nói chung là rất khó khăn. Bởi cá sống dưới nước nên các triệu chứng bệnh ban đầu rất khó phát hiện, chỉ khi cá bị bệnh nặng mới có các biểu hiện ra bên ngoài. Mặt khác, khi phát hiện cá bị bệnh, thường là cá bỏ ăn hoặc chán ăn, nên chữa bệnh cho cá bằng các biện pháp cho ăn là rất khó khăn. Dùng phương pháp tắm thì phải bắt cá, điều này sẽ dễ làm cho cá bị các tổn thương bên ngoài da, tạo cơ hội cho các tác nhân gây
Ghi chú: R (Resistant): đề kháng; I (Intermediate): nhạy cảm vừa; S (Susceptible): nhạy cảm
Độ nhạy chuẩn (mm) Loại kháng sinh R I S Đường kính vòng vô khuẩn đo được (mm) Kết luận Tetracyclin (30µg/đĩa) 14 15-18 19 25 S Kanamycin (30µg/đĩa) ≥ 13 - - 12 R Nofloxacin (10µg/đĩa) 12 13-20 21 18 I Streptomycin (10µg/đĩa) ≥11 - - 14 I Erythromycin (15µg/đĩa) 13 14-22 23 16 I
Nalidixic acid (30µg/đĩa) 13 14-18 19 21 S
Ciprofloxacin (5µg/đĩa) 18 19-22 23 19 I
Gentamycin (10µg/đĩa) 12 13-14 15 14 I
Cephalexin (30µg/đĩa) ≥ 13 - - 10 R
Ampicillin (10µg/đĩa) 10 11-17 18 8 R
Bảng 3.3. Tính nhạy cảm của V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN) phân lập được từ cá chẽm bị bệnh lở loét đối với các loại kháng sinh.
bệnh khác xâm nhập và tiếp tục gây bệnh cho cá… Chính vì vậy mà phòng bệnh cho cá là rất quan trọng. Từ việc chọn con giống tốt, khỏe mạnh, sạch bệnh đến chọn địa điểm nuôi cá có nguồn nước ít bị ô nhiễm và không chịu tác động nhiều từ các hoạt động của con người, quản lý và chăm sóc cá nuôi tốt, thường xuyên theo dõi hoạt động của cá. Tuy nhiên, khi cá đã bị bệnh, nếu phát hiện sớm và chữa đúng cách thì hiệu quả trị bệnh của cá cũng khá cao, đặc biệt đối với cá bị nhiễm vi khuẩn. Qua tìm hiểu tài liệu của các tác giả trên thế giới và kết quả kháng sinh đồ, đề tài đã tổng hợp và đề xuất cách trị bệnh cho cá bằng kháng sinh tetracycline và nalidixic acid như sau:
3.6.1. Xử lý bằng tetracyclin
Tác dụng chính của tetracyclin là bám vào tiểu phần ribosome 30S, làm ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn[31]. Tetracyclin có hiệu lực chống lại rất