- Thí nghiệm được bố trí thành 5 lô với 4 lô tiêm vi khuẩn và 1 lô tiêm nước muối sinh lý (0,85% NaCl) làm đối chứng.
- Cá thí nghiệm: Chọn cá chẽm khỏe, ăn tốt, có chiều dài và khối lượng thân trung bình lần lượt là 18,5 (1,34)cm và 76,7 (22,9)g (thí nghiệm lần 1); 20,6 ( 1,52)cm và 106,8 (20,2)g (thí nghiệm lần 2), cá mua từ các lồng nuôi thương phẩm và được nuôi thuần dưỡng trong bể composit 2000 lít, có hệ thống nước chảy ra vào liên tục trong 2 tuần trước khi bố trí ngẫu nhiên vào trong các lô thí nghiệm.
- Vi khuẩn thí nghiệm: Là chủng có tần số bắt gặp cao nhất là V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN), bố trí thành 4 lô tiêm là 1×103, 1×104, 1×105, 1×106CFU/g khối lượng thân cá
- Điều kiện nuôi thí nghiệm:
Mật độ: 6 con/bể composit 200 lít Độ mặn 30 – 32‰
Nhiệt độ nước 27 – 280C Sục khí liên tục
Cho ăn thức ăn công nghiệp, khẩu phần ăn 2% khối lượng thân/ ngày, cho ăn ngày 2 lần vào buổi sáng và chiều.
- Thí nghiệm cảm nhiễm: Mỗi con cá ở các lô thí nghiệm được tiêm dưới da 0,2 ml dung dịch chứa vi khuẩn (lô đối chứng được tiêm 0,2 ml dung dịch nước muối sinh lý (0,85% NaCl) vô trùng).
- Theo dõi cá thí nghiệm: Cá thí nghiệm được cho ăn và chăm sóc bình thường như trước khi thí nghiệm, đồng thời theo dõi các biểu hiện của cá sau khi tiêm. Khi cá bị bệnh, quan sát các biểu hiện bệnh bên ngoài, giải phẫu để kiểm tra sự biến đổi các nội quan bên trong và thu mẫu bệnh phẩm để nghiên cứu vi khuẩn.
- Tính LD50 (Liều gây chết 50% cá thể sau khi thí nghiệm): LD50 được xác định theo công thức của Reed và Muench (1938)
LD50 = Nồng độ gây chết lớn hơn 50% thấp nhất trừ cho số nội suy (p.d) pd = % % % 50 % H L L (L là tỷ lệ chết trên 50% thấp nhất; H là tỷ lệ chết dưới 50% cao nhất.).
2.10. Phương pháp thử nghiệm độ nhạy kháng sinh (kháng sinh đồ)
+ Môi trường và vật liệu cần thiết:
- Môi trường TSA + 2% NaCl, nước muối 2% NaCl vô trùng...
- Đĩa giấy kháng sinh các loại: nalidixic acid, gentamycin, ampicillin, ciprofloxacin, cephalexin, tetracyclin, erythromycin, streptomycin, nofloxacin, kanamycin.
Chủng vi khuẩn thử nghiệm Cá thí nghiệm
Nuôi cấy tăng sinh
Xác định mật độ vi khuẩn
Đo chiều dài và cân khối lượng
Chia cá ngẫu nhiên vào các lô
Tiêm 0,2 ml dịch VK/1con cá Lô TN 1 106 CFU/g Lô TN 2 105 CFU/g Lô TN 3 104 CFU/g Lô TN 5 NaCl 0,85% (Đ/C) Lô TN 4 103 CFU/g
- Theo dõi các biểu hiện ở bên ngoài và trong, ghi nhận các các thay đổi và biểu hiện bệnh của cá.
- Ghi nhận số cá chết trong vòng 10 ngày thí nghiệm, tính LD50.
+ Phương pháp tiến hành:
- Vi khuẩn thử nghiệm độ nhạy kháng sinh được lấy từ các khuẩn lạc đã được làm thuần và nuôi cấy trên môi trường TSA (2% NaCl)/ 18 - 24 giờ. Sau đó huyền phù trong môi trường nước muối vô trùng 2% NaCl đến mật độ khoảng 108 CFU/ml.
- Hút dung dịch huyền phù vi khuẩn này cấy lên đĩa lồng chứa TSA (2% NaCl) đã chuẩn bị sẵn, dùng que trang thủy tinh trang đều dung dịch vi khuẩn lên mặt thạch TSA, đặt vào tủ ấm sấy khô trong 15 phút.
- Đặt các đĩa giấy kháng sinh lên mặt thạch sao cho các đĩa giấy cách nhau từ 1,5 - 2cm.
- Lật ngược đĩa lồng, ủ ở 29 - 310C/24 giờ.
- Đo đường kính vòng vô khuẩn của các đĩa giấy kháng sinh. Dựa vào độ nhạy chuẩn của từng loại kháng sinh để so sánh với độ nhạy thực nghiệm đạt được.
2.11. Phương pháp xử lý số liệu:
Chương 3 - KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả kiểm tra các yếu tố môi trường nước tại thời điểm thu mẫu cá bệnh cá bệnh
Nhân tố môi trường ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cá. Nếu môi trường thay đổi theo hướng bất lợi sẽ làm cho cá bị yếu đi và trở thành yếu tố trực tiếp gây bệnh hoặc tạo cơ hội cho tác nhân gây bệnh khác phát huy hiệu quả gây bệnh trên cá. Việc phân tích các thông số môi trường nước ở thời điểm cá bị bệnh là rất quan trọng và là cơ sở để xác định tác nhân gây bệnh chính cho cá. 3.1.1. Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý nước tại vùng nuôi
Cùng với việc thu mẫu cá bệnh, mẫu nước vùng nuôi cá cũng được thu và đem về phòng thí nghiệm để phân tích các chỉ tiêu hóa lý cần thiết. Kết quả phân tích cho thấy, các yếu tố như nhiệt độ nước, pH, độ mặn, độ kiềm, oxy hòa tan (DO), nhu cầu oxy hóa học (COD), nhu cầu oxy sinh hóa (BOD), amonia (NH4+-N), nitrate (NO3
-
-N), nitrite (NO2 -
-N) đều nằm trong giới hạn cho phép đối với nước nuôi trồng thủy sản. Chỉ riêng có nồng độ Sulfide (S2-) và phosphate (PO43--P) có vượt giới hạn nhưng không nhiều. Cụ thể, đối với sulfide (S2-) đo ở các đợt 2 (0,007 mg/l) và 4 (0,006 mg/l) vượt quá giới hạn cho phép là 0,005mg/l, phosphate (PO43-- P) trong các đợt đo luôn ở mức bằng hoặc cao hơn so với tiêu chuẩn cho phép, nhưng cao hơn không nhiều, cao nhất là đợt phân tích mẫu thứ 5 (0,020 mg/l).
Theo Sena S. De Silva (1998), đối với môi trường nuôi cá chẽm, giới hạn cho phép đối với H2S là <0,3 mg/l, điều kiện tối ưu để cá phát triển tốt là 0 mg/l; nhiệt độ tối ưu: 26 - 320C (giới hạn >150C); độ mặn: 0 - 35‰; pH tối ưu từ 7,5 - 8,5 (giới hạn >4); amonia (NH4
+
-N) tối ưu là 0 mg/l (giới hạn <0,46 mg/l); oxy hòa tan (DO) tối ưu từ 4 - 9 mg/l (giới hạn >1 mg/l)[64]. Cũng theo một tài liệu khác là “sinh học và kỹ thuật nuôi cá chẽm” của Khoa Thủy sản – Đại học Cần Thơ (1994) thì vị trí chọn vùng nuôi thích hợp cho cá chẽm là ở môi trường nước có: pH từ 7,5 - 8,5; oxy hòa tan nằm trong khoảng 4 - 9 mg/l; độ mặn 10 - 30‰; nhiệt độ từ 26 - 320C;
NH4+< 1 mg/l; H2S <0,3 mg/l[22]. Chỉ tiêu phosphate trong nước nuôi cá chẽm thì các tài liệu trên không quy định.
Như vậy, trong các yếu tố môi trường nước đã phân tích thì đa số đều nằm trong giới hạn cho phép để nuôi cá chẽm. Riêng chỉ có chỉ tiêu sulfide (S2-) và phosphate (PO43--P) có vượt giới hạn không đáng kể so với các tiêu chuẩn hiện hành đối với môi trường nước nuôi trồng thủy sản nói chung, nhưng vẫn nằm trong giới hạn cho phép so với các tài liệu chuyên môn về nuôi cá chẽm. Từ kết quả này đề tài nhận thấy, các yếu tố môi trường nước cơ bản đã phân tích đều không ảnh hưởng xấu đến cá, nguyên nhân gây bệnh lở loét cho cá có thể đến từ một tác nhân hữu sinh khác.
Kết quả cụ thể các chỉ tiêu hóa lý nước nuôi thu tại thời điểm cá chẽm bị bệnh lở loét được thể hiện qua bảng 3.1 sau.
Bảng 3.1. Kết quả phân tích các chỉ tiêu hóa lý trong khu vực nước nuôi cá chẽm bị bệnh lở loét qua các đợt thu mẫu.
Chỉ tiêu\đợt Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Đợt 4 Đợt 5 Mức tiêu chuẩn cho phép pH 7,9 8,0 7,8 7,8 8,0 6,5 – 8,5* T0 nước (0C) 28 29 27 28 28 ≤ 30* Độ mặn (‰) 32 33 33 32 32 - Độ kiềm (mg/l) 92 98 100 94 98 60-180 DO (mg/l) 5,15 5,20 5,22 5,55 5,30 ≥ 5* COD (mg/l) 1,12 1,34 1,96 2,50 1,16 ≤ 3* BOD (mg/l) 0,87 0,28 1,10 1,34 0,52 ≤ 10** NH4+-N(mg/l) 0,012 0,023 0,035 0,023 0,030 ≤ 0,1* NO2--N (mg/l) <0,005 <0,005 <0,005 <0,005 0,005 ≤0,055*** NO3--N (mg/l) 0,042 0,056 0,045 0,060 0,049 ≤ 0,07*** S2- (mg/l) 0,003 0,007 0,005 0,006 0,004 ≤ 0,005* PO43--P (mg/l) 0,015 0,016 0,016 0,018 0,020 ≤ 0,015***
Ghi chú: “-”, không quy định; *, áp dụng theo QCVN 10: 2008/BTNMT[12]; **, áp dụng theo TCVN 5943 - 1995[21]; ***, Áp dụng theo tiêu chuẩn Asean về chất lượng nước biển bảo vệ đời sống thủy sinh[75].
3.1.2. Kết quả định lượng vi khuẩn Vibrio tổng số và vi khẩn hiếu khí tổng số trong nước tại vùng nuôi
Vibrio được báo cáo là giống vi khuẩn gây bệnh trên các đối tượng nuôi thủy sản nước mặn nhiều nhất. Vì vậy, việc định lượng Vibrio tổng số và vi khuẩn hiếu khí tổng số trong nước nuôi sẽ góp phần đánh giá chất lượng nước nuôi, đồng thời là cơ sở để xác định khả năng gây bệnh cá từ nhóm tác nhân này. Vibrio tổng số được định lượng trên môi trường chọn lọc TCBS, vi khuẩn hiếu khí được định lượng trên môi trường TSA.
+ Kết quả định lượng Vibrio tổng số: Qua 5 đợt thu mẫu, Vibrio tổng số trong nước nuôi dao động từ 60 – 320 CFU/ml, kết quả phân tích này cao hơn so với các nghiên cứu trước đây về số lượng Vibrio trong nước biển ở một số khu vực nuôi trồng thủy sản. Theo Võ Hải Thi và ctv (2001), ở khu vực cửa sông Cái và sông Bé – Nha Trang – Khánh Hòa, số lượng Vibrio dao động từ 24 - 54 tế bào/ml (vào mùa mưa) và 3 - 50 tế bào/ml (mùa khô)[16]. Theo Nguyễn Hữu Thọ và ctv (2009, 2010), ở khu vực Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa, mật độ vi khuẩn Vibrio tổng số dao động trong khoảng từ 10 - 140 CFU/ml [18],[19]. Võ Hải Thi và ctv (2003), khi nghiên cứu về biến động số lượng Vibrio theo mùa trong các khu vực nuôi tôm tại 2 tỉnh Cà Mau và Trà Vinh cho thấy, mật độ Vibrio trong nước khu vực nuôi tôm ở 2 tỉnh này dao động động từ 1 - 178 tế bào/ml[17]. Một nghiên cứu khác của Nguyễn Hữu Huân và ctv (2006), Vibrio tổng số tại đầm Thị Nại (Bình Định) dao động từ 1 - 5 tế bào/ml (vào mùa khô) và 2 - 48 tế bào/ml (vào mùa mưa)[7].
+Kết quả định lượng vi khuẩn hiếu khí tổng số: Vi khuẩn hiếu khí tổng số qua các đợt thu mẫu dao động từ 800 - 1520 CFU/ml, kết quả nghiên cứu này cao hơn so với các nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thọ và ctv (năm 2008, 2009) tại cùng khu vực Vũng Ngán. Bởi theo báo cáo nhiệm vụ quan trắc thường xuyên của Nguyễn Hữu Thọ và ctv tại khu vực Vũng Ngán, mật độ vi khuẩn hiếu khí dao động từ 360 - 1270 CFU/ml (năm 2008) và 110 – 840 CFU/ml (năm 2009) [18], [19].
Như vậy, ở khu vực nuôi cá chẽm bị bệnh, mặc dù vi khuẩn hiếu khí tổng số không cao hơn nhiều so với các nghiên cứu khác nhưng Vibrio tổng số lại cao hơn rất nhiều lần so với các nghiên cứu trước đây [cao hơn gấp khoảng 6 lần so với nghiên cứu của Võ Hải Thi và ctv (2001) và gấp hơn 2 lần so với nghiên cứu của Nguyễn Hữu Thọ và ctv (năm 2008, 2009)]. Qua kết quả phân tích này, đề tài nhận thấy vi khuẩn thuộc giống Vibrio có khả năng là nguyên nhân gây bệnh lở loét cho cá.
Biểu đồ 3.1. Vi khuẩn hiếu khí tổng số và Vibrio tổng số trong nước nuôi cá chẽm qua các đợt thu mẫu.
150 270 60 300 320 1200 910 800 1520 1300 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Đợt 1 Đợt 2 Đợt 3 Đợt 4 Đợt 5 Đợt t hu mẫu C FU/ m l Vibrio tổng số Vi khuẩn HK tổng số
3.2. Kết quả phân tích tác nhân gây bệnh
3.2.1. Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn trên cá chẽm bị bệnh lở loét Từ 19 mẫu cá chẽm bị bệnh, đề tài đã phân lập được 6 loài vi khuẩn. Bằng Từ 19 mẫu cá chẽm bị bệnh, đề tài đã phân lập được 6 loài vi khuẩn. Bằng việc thực hiện các phản ứng sinh hóa theo bộ kit định danh API 20E, định danh theo phần mềm định danh API 20E của hãng Biomerieux (Pháp) kết hợp với tài liệu định danh vi khuẩn “Bergey’s manual of determinative bacteriology” của Jonhn G. Holt và ctv (1994)[40], đề tài đã xác định cấp độ loài của 6 chủng vi khuẩn phân lập được như sau:
Vibrio alginolyticus: Gram (-), hình que ngắn, di động, trên môi trường
TCBS khuẩn lạc có màu vàng, bờ không đều. Trên môi trường TSA, khuẩn lạc có màu trắng sữa, dễ mọc loang. Có thể phát triển tốt ở các nồng độ muối 3, 7, 10%, nhưng không mọc được trong môi trường muối 0%, nhạy với vibriostat 0/129, oxidase (+), catalase (+), ONPG (-)....
Hình 3.1. Hình thái vi khuẩn V. alginolyticus trên môi trường TCBS và đặc điểm sinh hóa trên test kit API - 20E.
Vibrio parahaemolyticus: Gram (-), hình que, trên môi trường TCBS khuẩn
lạc có màu xanh, phát triển tốt ở môi trường có nồng độ muối 3 và 7% nhưng không phát triển được ở nồng độ muối 0 và 10%, nhạy với vibriostat 0/129, oxidase (+), catalase (+), ONPG (-)…
Vibrio anguillarum: Gram (-), hình que, trên môi trường TCBS khuẩn lạc có
màu vàng, oxidase (+), catalase (+), ONPG (+), phát triển tốt ở muôi trường có nồng độ muối 3 và 7%, không phát triển trong muôi trường 0 và 10% muối, nhạy với vibriostat 0/129…
Vibro vulnificus: Gram (-), hình que, trên môi trường TCBS có màu xanh,
oxidase (+), catalase (+), ONPG (+), phát triển tốt trong môi trường có nồng độ
muối 3 và 7%, không phát triển trong môi trường có nồng độ muối 0% và 10%... Photobacterium damselae: Gram (-), hình que ngắn, không di động, khuẩn lạc trên môi trường TSA lồi, bờ đều, có màu trắng, oxidase (+), manitol (-)...
Pseudomonas sp.: Gram (-), hình que dài, di động. Trên môi trường CA
khuẩn lạc có dạng tròn, lồi, trắng sữa. Thử nghiệm catalase (+), oxidase (+),… Đặc điểm sinh hóa các chủng vi khuẩn phân lập được từ cá chẽm bị bệnh lở loét được mô tả cụ thể qua bảng 3.2.
Bảng 3.2. Các đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập được từ cá chẽm bị bệnh lở loét.
Tên loài vi khuẩn đề nghị
Các đặc điểm sinh hóa Vib rio a lg in o ly tic us Vib rio pa raha emo ly tic u s Vib rio angu il lar u m Vib rio vul n ific u s Ph ot obac terium da mselae Pseu dom ona s sp . Gram - - - - - - ONPG - - + + - + ADH - - + - + + LDC + + - + - - ODC - + - + - - CIT + + + + - + H2S - - - - - - Ure - - - - + - TDA - - - - - - IND + + + + - - VP - - + - - + GEL - + - + - + GLU + + + + + - MAN + + + + - - INO - - - + - - SOR + - + - - - RHA - - - - - - SAC + - + - + - MEL - - - - - - AMY + - - + - - ARA - - + - - - NO2 + + + + - - McC + + + + + + Oxidase + + + + + + Catalase + + + + + + O/F +/+ +/+ +/+ +/+ +/+ +/- Di động + + + + - + O/129 + + + + + -
+Tần số bắt gặp các loài vi khuẩn trên cá chẽm bị bệnh lở loét
Trong 6 loài vi khuẩn phân lập được thì Vibrio alginolyticus có tần số bắt
gặp (TSBG) cao nhất là 100% (19/19 trường hợp), và cũng là loài có số lượng khuẩn lạc xuất hiện nhiều nhất khi cấy trên các môi trường TSA và TCBS. Đồng thời cũng bắt gặp trên tất cả các cơ quan phân tích (gan, thận, vết loét). Các loài vi
khuẩn còn lại là V. parahaemolyticus, V. anguillarum, V. vulnificus, Photobacterium damselae và Pseudomonas sp. đều phân lập được ở vết loét. Ở gan phân lập được loài V. parahaemolyticus, Photobacterium damselae và Pseudomonas sp.. Trên thận không phân lập được loài nào khác ngoài V. anginolyticus. Kết quả được biểu diễn qua biểu đồ 3.2.
Vibrio alginolyticus: Xuất hiện ở tất cả các cơ quan phân tích. Theo mô tả