- Cỡ cá thí nghiệm: Chiều dài thân trung bình: 18,5 (1,34)cm; cân nặng 76,7 (22,9)g
- Số lô bố trí thí nghiệm: 5 lô - Số cá mỗi lô: 6 con
- Nồng độ vi khuẩn tiêm mỗi lô:
+ Lô 1: 1×106 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 2: 1×105 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 3: 1×104 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 4: 1×103 CFU/g trọng lượng cơ thể cá
+ Lô 5 : Lô đối chứng, tiêm bằng nước muối sinh lý (0,85% NaCl). Kết quả thí nghiệm cho thấy:
Lô 1: Những ngày đầu vết tiêm tấy đỏ và sưng phồng lên, đến ngày thứ 3 cá có dấu hiệu tróc vảy ở vết tiêm và vết tiêm bị loét ngày càng lan rộng ra. Sau 96 giờ tiêm (4 ngày) thì cá chết 100%.
Lô 2: Những ngày đầu vết tiêm tấy đỏ, sau đó vết tiêm sưng phồng thành vết loét và vết loét lan rộng ra, cùng với đó là hiện tượng tróc vảy ở quanh vết loét. Sau 144 giờ (6 ngày) thì cá thí nghiệm chết 100%.
Lô 3 và lô 4: Trong 3 ngày đầu sau khi tiêm thì vết tiêm tấy đỏ và ngày càng lan rộng thành các vết loét, đến ngày thứ 4, vết loét lan rộng, có hiện tượng tróc vảy 2 bên sườn và lưng, vết loét lan dần từ sườn bên này sang sườn bên kia của cá, những ngày tiếp theo cá yếu dần. Đến ngày thứ 10 thí nghiệm cảm nhiễm thì lô 3 chết 66,33% con và lô 4 chết 33,32 %.
Lô 5: Cá vẫn khỏe mạnh và hoạt động bình thường từ đầu cho đến khi kết thúc thí nghiệm.
Kết thúc đợt thí nghiệm thứ nhất cho thấy: Khi tiêm vi khuẩn vào cá khỏe, cá có các dấu hiệu bệnh giống với dấu hiệu cá bị bệnh ngoài tự nhiên là sau 4 ngày với sự lở loét và tróc vảy bên ngoài, cá hoạt động yếu. Giải phẩu bên trong cho thấy gan và thận cá sẫm màu. Khi phân lập trở lại cá thí nghiệm cảm nhiễm đã thu được
chủng V. alginolyticus, là chủng đã tiêm cảm nhiễm ban đầu.
Tỷ lệ chết của cá chẽm cảm nhiễm chủng V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN)
lần 1 được thể hiện qua biểu đồ 3.3 sau.
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian cảm nhiễm (giờ)
T ỷ l ệ c h ế t tí c h l ũ y ( %) Nồng độ 1000 CFU/g Nồng độ 10000 CFU/g Nồng độ 100000 CFU/g Nồng độ 1000000 CFU/g
Biểu đồ 3.3. Tỷ lệ chết của cá chẽm cảm nhiễm chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus (CH3G-TCBSVN) lần 1.
3.4.2. Cảm nhiễm lần 2 (lặp lại)
- Cỡ cá thí nghiệm: Chiều dài trung bình thân 20,6 ( 1,52) cm; cân nặng trung bình 106,8 (20,2)g
- Số lô bố trí thí nghiệm: 5 lô - Số cá mỗi lô: 6 con
- Nồng độ vi khuẩn tiêm mỗi lô:
+ Lô 1: 1×106 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 2: 1×105 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 3: 1×104 CFU/g trọng lượng cơ thể cá + Lô 4: 1× 103 CFU/g trọng lượng cơ thể cá
+ Lô 5 : Lô đối chứng, tiêm bằng nước muối sinh lý (0,85% NaCl). Kết quả thí nghiệm cho thấy
Lô 1: Sau 24 giờ đầu tiên không có con cá nào chết, tuy nhiên cũng giống như lần thí nghiệm trước là các vết tiêm đỏ tấy, sang ngày thứ 2 thì cá đã bị chết và đến ngày thứ 5 thì 100% cá chết.
Lô 2: Đến ngày thí nghiệm thứ 3 cá bắt đầu chết và chết 100% sau 8 ngày thí nghiệm.
Lô 3: Những ngày đầu mới tiêm thì vết tiêm bị tấy đỏ, sau đó thành vết loét và cá có hiện tượng tróc vảy, cá bắt đầu chết từ ngày thứ 5 và sau 10 ngày thí nghiệm thì tỷ lệ cá chết là 50%.
Lô 4: Các dấu hiệu cũng tương tự như ở lô 3 nhưng đến ngày thứ 6 mới có 1 con chết (16,66%) và đây là con chết duy nhất của lô 4 trong đợt thí nghiệm này..
Lô 5: Trong suốt thời gian thí nghiệm cá vẫn khỏe và hoạt động, ăn bình thường.
Kết thúc đợt thí nghiệm cho thấy: Sau khi tiêm cảm nhiễm với tác nhân V. alginolyticus (CH3G-TCBS-VN), sau khoảng 4 ngày thì cá có các dấu hiệu giống
như cá bị bệnh lở loét ngoài tự nhiên, tức là vết loét lan rộng ra, có sự xuất huyết và tróc vảy. Giải phẫu bên trong thấy gan cá sẫm màu, vi khuẩn phân lập lại được từ
gan cá chính là vi khuẩn V. alginolyticus.
Qua 2 đợt thí nghiệm cảm nhiễm cùng một chủng vi khuẩn V. alginolyticus
(CH3G-TCBSVN) cho thấy, cá có các dấu hiệu giống nhau và giống với dấu hiệu
của cá bị bệnh ngoài tự nhiên. Từ kết quả này có thể kết luận V. alginolyticus là tác
nhân chính gây nên bệnh lở loét trên cá chẽm nuôi tại Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa trong đợt dịch lở loét vừa qua với liều gây chết LD50 sau 10 ngày là 1×104 CFU/g. Tuy nhiên, trong lần thí nghiệm thứ 2 thì cá chết chậm hơn điều này có thể là do ở lần thí nghiệm thứ 2 đề tài đã dùng cá có kích thước lớn hơn để tiêm cảm nhiễm, có thể cá có kích thước và trọng lượng lớn hơn nên sức đề kháng của cá có thể cao hơn so với các cá sử dụng để làm thí nghiệm cảm nhiễm lần đầu.
-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240
Thời gian cảm nhiễm (giờ)
T ỷ l ệ ch ết t íc h l ũ y (%) Nồng độ 1000 CFU/g Nồng độ 10000 CFU/g Nồng độ 100000 CFU/g Nồng độ 1000000 CFU/g
Biểu đồ 3.4. Tỷ lệ chết của cá chẽm cảm nhiễm chủng vi khuẩn Vibrio alginolyticus (CH3G-TCBSVN) lần 2.
Hình 3.8. Cá chẽm bị bệnh lở loét trong điều kiện thí nghiệm. Hình 3.7. Cá chẽm bị bệnh lở loét trong tự nhiên.
3.5. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ chủng Vibrio alginolyticus (CH3G-
TCBSVN) phân lập từ cá chẽm bị bệnh lở loét
Sau khi xác định được V. alginolyticus là tác nhân chính gây bệnh lở loét
trên cá chẽm, đề tài đã tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ đối với 10 loại kháng sinh là tetracyclin (Tet), kanamycin (K), nofloxacin (Nor), streptomycin (S), erythromycin (Er), nalidixic acid (Ng), ciprofloxacin (Ci), gentamycin (Ge), cephalexin (Cp), ampicillin (Am) nhằm tìm ra kháng sinh phù hợp để điều trị bệnh cho cá. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ cho thấy có 2 loại kháng sinh nhạy cảm
cao với V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN) là tetracyclin, nalidixic acid; 4 loại
kháng sinh nhạy cảm ở mức trung bình là nofloxacin, streptomycin, ciprofloxacin và gentamycin; 4 loại kháng sinh bị kháng là kanamycin, erythromycin, cephalexin và ampicicllin. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ được trình bày cụ thể qua hình 3.9 và bảng 3.3.
Hình 3.9. Kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ chủng V. alginilyticus (CH3G- TCBSVN) phân lập được từ cá chẽm bị bệnh lở loét. Ng: Nalidixic acid; Ge: Gentamycin;
Am: Ampicillin; Ci: Ciprofloxacin; Cp: Cephalexin; Te: Tetracyclin; Er: Erythromycin; S: Streptomycin; Nor: Nofloxacin; K: Kanamycin.
Te Er Nor S Ng K Ci Ge Am Cp
3.6. Đề xuất phương pháp phòng trị bệnh cho cá chẽm bị bệnh lở loét
Việc chữa bệnh cho cá nói riêng và các động vật thủy sản khác nói chung là rất khó khăn. Bởi cá sống dưới nước nên các triệu chứng bệnh ban đầu rất khó phát hiện, chỉ khi cá bị bệnh nặng mới có các biểu hiện ra bên ngoài. Mặt khác, khi phát hiện cá bị bệnh, thường là cá bỏ ăn hoặc chán ăn, nên chữa bệnh cho cá bằng các biện pháp cho ăn là rất khó khăn. Dùng phương pháp tắm thì phải bắt cá, điều này sẽ dễ làm cho cá bị các tổn thương bên ngoài da, tạo cơ hội cho các tác nhân gây
Ghi chú: R (Resistant): đề kháng; I (Intermediate): nhạy cảm vừa; S (Susceptible): nhạy cảm
Độ nhạy chuẩn (mm) Loại kháng sinh R I S Đường kính vòng vô khuẩn đo được (mm) Kết luận Tetracyclin (30µg/đĩa) 14 15-18 19 25 S Kanamycin (30µg/đĩa) ≥ 13 - - 12 R Nofloxacin (10µg/đĩa) 12 13-20 21 18 I Streptomycin (10µg/đĩa) ≥11 - - 14 I Erythromycin (15µg/đĩa) 13 14-22 23 16 I
Nalidixic acid (30µg/đĩa) 13 14-18 19 21 S
Ciprofloxacin (5µg/đĩa) 18 19-22 23 19 I
Gentamycin (10µg/đĩa) 12 13-14 15 14 I
Cephalexin (30µg/đĩa) ≥ 13 - - 10 R
Ampicillin (10µg/đĩa) 10 11-17 18 8 R
Bảng 3.3. Tính nhạy cảm của V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN) phân lập được từ cá chẽm bị bệnh lở loét đối với các loại kháng sinh.
bệnh khác xâm nhập và tiếp tục gây bệnh cho cá… Chính vì vậy mà phòng bệnh cho cá là rất quan trọng. Từ việc chọn con giống tốt, khỏe mạnh, sạch bệnh đến chọn địa điểm nuôi cá có nguồn nước ít bị ô nhiễm và không chịu tác động nhiều từ các hoạt động của con người, quản lý và chăm sóc cá nuôi tốt, thường xuyên theo dõi hoạt động của cá. Tuy nhiên, khi cá đã bị bệnh, nếu phát hiện sớm và chữa đúng cách thì hiệu quả trị bệnh của cá cũng khá cao, đặc biệt đối với cá bị nhiễm vi khuẩn. Qua tìm hiểu tài liệu của các tác giả trên thế giới và kết quả kháng sinh đồ, đề tài đã tổng hợp và đề xuất cách trị bệnh cho cá bằng kháng sinh tetracycline và nalidixic acid như sau:
3.6.1. Xử lý bằng tetracyclin
Tác dụng chính của tetracyclin là bám vào tiểu phần ribosome 30S, làm ức chế quá trình tổng hợp protein của vi khuẩn[31]. Tetracyclin có hiệu lực chống lại rất nhiều loài vi khuẩn và nó hoạt động tốt khi trộn chung với thức ăn. Trong nước nặng (nhiều ion Ca2+ và Mg2+) thì tetracyclin sẽ bị gắn bởi các ion này và làm mất hoạt tính. Điều này có nghĩa là với độ cứng của nước tăng thì cần tăng liều tetracyclin khi tắm cho cá. Tetracyclin bị bất hoạt khi tắm cho cá nước mặn[31],[58]. Tetracyclin nhạy với ánh sáng và chúng có màu nâu khi phân hủy. Điều này sẽ làm cho nước bẩn và có thể gây hại đến cá. Vì vậy nên sau khi tắm xong, cần phải thay nước ngay lập tức. Do lạm dụng thuốc mà hiện nay có rất nhiều loài vi khuẩn đã kháng với tetracyclin[31].
Cách sử dụng tetracyclin: tetracyclin có thể sử dụng để trị bệnh cho cá bằng phương pháp trộn với thức ăn hoặc tiêm: Theo Edward J. Noga và ctv (2010), có thể sự dụng kháng sinh bằng phương pháp cho ăn: trộn 55 - 83 mg oxytetracyclin vào thức ăn/kg trọng lượng cơ thể cá/ ngày, cho ăn liên tục trong 10 ngày. Đối với phương pháp tiêm thì có thể tiêm cơ hoặc tiêm bụng với liều tiêm: 25 - 50 mg oxytetracyclin/kg trọng lượng cơ thể cá. Chỉ tiêm 1 lần bằng phương pháp tiêm cơ hoặc tiêm trong màng bụng. Hoặc có thể tiêm 10 mg oxytetracyclin/kg trọng lượng
cơ thể cá bằng phương pháp tiêm cơ ở cá khỏe có thể ngăn chặn sự xâm nhiễm khuẩn[35].
3.6.2. Xử lý bằng nalidixic acid
Nalidixic acid là kháng sinh được sử dụng rộng rãi, có hoạt tính chống lại rất nhiều loài vi khuẩn. Kháng sinh này hoạt động tốt nhất ở pH = 6,9 hoặc thấp hơn và bị ức chế bởi nước cứng. Mặc dù kháng sinh này cho tác dụng tốt cả bằng phương pháp tắm và trộn với thức ăn nhưng một số cá có thể chìm xuống đáy và xuất hiện hôn mê khi tắm. Nalidixic acid có tác dụng làm ức chế enzyme DNA gyrase của vi khuẩn từ đó sẽ làm ức chế tác động ngăn chặn sự xoắn vặn của nhiễm sắc thể vi khuẩn[35],[61].
Cách sử dụng nalidixic acid: Theo Edward J. Noga và ctv (2010), nalidixic acid có thể sử dụng bằng phương pháp tắm và trộn vào thức ăn. Phương pháp tắm, cho 13 mg nalidixic acid/l nước, tắm trong 1 - 4 giờ, lặp lại nếu cần; Phương pháp trộn với thức ăn, trộn vào thức ăn liều 20mg nalidixic acid/1kg trọng lượng cơ thể
cá/ngày để trị các bệnh nhiễm khuẩn thuộc giống Vibrio. Hoặc theo hướng dẫn của
Roy P.E. Yanong (2006), có thể sử dụng nalidixic bằng phương pháp tắm và phương pháp cho ăn với liều như sau[61]. Phương pháp tắm, tương tự với phương pháp trích dẫn của Theo Edward J. Noga và ctv (2010); Phương pháp trộn với thức ăn, trộn 1 mg kháng sinh/1,5 g thức ăn /ngày, cho ăn liên tục trong 10 ngày[35].
Hiện nay, để phòng bệnh nhiễm khuẩn trên cá chẽm và cá nói chung, hướng tiếp cận nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đã cho thấy hiệu quả khả quan. Cụ thể,
theo báo cáo của Nurul H. Idris và ctv (2009), sử dụng vaccine V. alginolyticus
nhược độc và gây nhiễm theo đường ăn cho cá chẽm, sau 30 ngày thí nghiệm và so sánh với cá đối chứng cho thấy cá được ăn vaccin lớn nhanh hơn, kháng thể đặc hiệu kháng nguyên được tìm thấy, tỷ lệ sống cao hơn đáng kể so với lô đối chứng ở thí nghiệm cảm nhiễm với tác nhân gây bệnh[55]. Như vậy, trong tương lai, nghiên cứu và phát triển vaccine để phòng bệnh cho cá sẽ là định hướng cần tập trung triển khai.
Chương 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
- Các thông số môi trường nước nuôi tại thời điểm cá bị bệnh đã được phân tích và hầu như thuộc ngưỡng cho phép, ngoại trừ chỉ tiêu sulfide (S2-) và phosphate (PO43--P) vượt giới hạn so với các tiêu chuẩn về chất lượng nước nhưng không đáng kể, chỉ tiêu Vibrio tổng số trong môi trường nước nuôi qua các đợt thu mẫu dao động từ 60 -320 CFU/ml, chỉ tiêu vi khuẩn hiếu khí tổng số dao động từ 800 - 1520 CFU/ml.
- Đã phân lập được 6 loài vi khuẩn trên cá chẽm bị bệnh lở loét là V. alginolyticus (TSBG 100%), V. parahaemolyticus (TSBG 26,3%), V. anguillarum (TSBG 15,7%), V. vulnificus (10,5%), Photobacterium damselae (TSBG 15,7%), Pseudomonas sp. (TSBG 15,7%); Phân lập được 2 loài ký sinh trùng trên cá chẽm bệnh là Pseudorhabdosynochus sp. (TSBG 52,6%) và Zeylanicobdella sp. (TSBG 10,5%); Phân lập được 1 loài nấm là Aspergillus sp. (TSBG 5,3%).
- Kiểm tra mô học cá cho thấy cá bị nhiễm khuẩn, các tế bào gan, thận, và cơ bị phá hủy đáng kể.
- Thí nghiệm cảm nhiễm cho thấy chủng V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN)
gây bệnh lở loét trong điều kiện thí nghiệm, và các dấu hiệu lở loét của cá giống với cá bị bệnh ngoài tự nhiên. Với liều gây chết LD50 là 104 CFU/g trọng lượng cơ thể cá sau 10 ngày thí nghiệm.
- Thử nghiệm ức chế V. alginolyticus (CH3G-TCBSVN) phân lập từ cá chẽm bị bệnh bằng kháng sinh (dựa trên kết quả kháng sinh đồ) cho thấy V. alginolyticus
(CH3G-TCBSVN) nhạy cảm với tetracyclin và nalidixic acid. 4.2. Kiến nghị
- Cần tiếp tục nghiên cứu tiếp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)
- Bố trí thí nghiệm thực tế để xác định liều lượng kháng sinh sử dụng điều trị bệnh cá tối ưu nhất.
- Cần tiến hành thí nghiệm cảm nhiễm đồng thời V. alginolyticus với các đối
tượng vi sinh khác đã được phát hiện từ cá bệnh để đánh giá mức độ gây bệnh cộng hợp trên cá chẽm.
- Hiện nay, khu vực nuôi cá chẽm ở Vũng Ngán – Nha Trang – Khánh Hòa là không phân cách với khu vực nuôi tôm hùm, cá mú, cá hồng, cá giò…Vì vậy, cần có các nghiên cứu xác định nguồn gốc các đối tượng gây bệnh và đặc tính xâm nhiễm gây hại chuyên biệt vật chủ để có quy hoạch vùng nuôi của từng đối tượng thủy sản nuôi.
PHỤ LỤC
1. Bảng chiều dài, trọng lượng và các dấu hiệu bệnh của các mẫu cá thu được.
Ngày thu mẫu
STT Ký hiệu mẫu Chiều dài (cm) Cân nặng (g) Biểu hiện bệnh 1 CH1 15 50
Thân lở loét, tróc vảy, đuôi bị ăn mòn, gan bầm, dạ dày rỗng, ruột chứa dịch vàng, cá hoạt động yếu.
2 CH2 14,4 40
Lở loét hai bên thân và đầu, gan sẫm màu, dạ dày rỗng.
3 CH3 13 30
Lở loét một bên thân, đuôi bị ăn mòn, gan sẫm màu, ruột chứa dịch vàng.
23/07/2009
4 CH4 16 60
Lở loét hai bên thân, đuôi và vây bị ăn mòn, cá yếu. gan sẫm màu, có các đốm trắng trong gan.
5 CH5 20,5 110
Lở loét hai bên thân, vết loét ăn sâu, dạ dày rỗng, gan có các đốm trắng.
6 CH6 19 90
Lở loét một bên thân, đuôi bị ăn mòn, gan sẫm màu.
7 CH7 17 50