xác định type vi khuẩn pasturella multocida bằng kỹ thuật pcr

multocida chúng tôi tiến hành thử nghiệm đặc tính oxiadase, thử nghiệm các đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm của Lassen, và khả năng lên men một số loại đường đặc trưng.. Kh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

XÁC ĐỊNH TYP E

VI KHUẨN PASTURELLA MULTOCIDA BẰNG

KỸ THUẬT PCR

Giáo viê n hướng dẫn: TS VŨ NGỌC BỘI

Sinh viê n thực hiệ n: NGUYỄN THỊ DUYÊN

NHA TRANG, 2009

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp này, trước tiên em xin gửi tới Ban giám

hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và

Môi trường, phòng Đào tạo Đại học và Sau đại học lòng biết ơn, niềm tự hàođược học tập tại trường trong những năm qua

Lòng biết ơn sâu sắc xin được giành cho thầy TS Vũ Ngọc Bội – Phó

Giám đốc Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, TS Lê Lập – Trưởng bộ

môn Nghiên cứu vi trùng Phân viện Thú y miền Trung, Ths Đào Duy Hưng,Bác sĩ Đặng Thanh Hiền, Bác sĩ Trương Công Thôi – Bộ môn nghiên cứu vitrùng Phân viện Thú y miền Trung

Xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Đức Tân – Viện trưởng Phân việnThý y miền Trung, cùng toàn thể các cán bộ tại Phân viện Thú y miền Trung

đã tạo điều kiện giúp đỡ trong thời gian thực tập vừa qua

Xin chân thành cảm ơn PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa – Giám đốc ViệnCông nghệ sinh học và Môi trường, Ths Khúc Thị An – Quyền trưởng bộmôn Công nghệ sinh học, cùng toàn thể quí thầy cô trong Bộ môn Công nghệsinh học đã giảng dạy, tạo điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập vừaqua

Em xin được bày tỏ lòng biết ơn cha mẹ và bạn bè đã ủng hộ, độngviên, giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đồ án tôt nghiệp này

Nha Trang, ngày tháng năm 2009

Sinh viên thực hiệnNguyễn Thị Duyên

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

MỤC LỤC ii

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC CÁC HÌNH vi

LỜI NÓI ĐẦU i

PHẦN I: TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 3

1.1.1 Các nghiên cứu trong nước 3

1.1.2 Các nghiên cứu ngoài nước 4

1.2.Vi khuẩn P multocida 6

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn 6

1.2.1.1 Phân loại vi khuẩn 6

1.2.1.2 Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn 7

1.2.2 Đặc tính nuôi cấy 8

1.2.2.1 Trong môi trường nước thịt 8

1.2.2.2 Trên môi trường thạch thường 8

1.2.2.3 Trên môi trường thạch máu 9

1.2.2.3 Trên môi trường thạch huyết thanh 9

1.2.2.4 Trên môi trường thạch MacConkey 10

1.2.3 Đặc tính sinh hóa của P multocida 11

1.3 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P multocida 12

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P multocida 12

1.3.2 Phân loại kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô 13

1.3.2.1 Phân loại kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ) 14

1.3.2.2 Kháng nguyên thân 15

1.3.3 Đặc điểm kháng nguyên giáp mô và kháng nguyên thân của P multocida 16

1.3.3.1 Type A 16

1.3.3.2 Type B 17

1.3.3.3 Type D của vi khuẩn P multocida 17

1.4 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn P multocida 18

1.4.1 Đối tượng gây bệnh 18

1.4.2 Sức đề kháng của vi khuẩn 20

1.4.3 Cơ chế gây bệnh của P multocida 21

1.4.3 Dịch tễ của bệnh do P multocida 22

1.4.4 Các con đường lây nhiễm 23

1.4.5 Triệu chứng và bệnh tích 24

1.4.5.1 P multocida gây bệnh trên đối tượng trâu, bò 24

1.4.5.2 P multocida gây bệnh trên đối tượng gà 25

1.4.5.3 Bệnh trên đối tượng lợn 26

1.4.6 Điều trị và phòng bệnh 26

1.4.6.1.Biện pháp phòng bệnh 26

1.4.6.2 Biện pháp điều trị bệnh 27

1.5 Một số phương pháp định type vi khuẩn 27

1.4.1 Phương pháp phản ứng ngưng kết gián tiếp hồng cầu 28

1.4.2 Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) 28

1.4.2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR 28

1.4.2.2 Các bước của phản ứng PCR 29

PHẦN II: NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Nội dung nghiên cứu 31

2.2 Đối tượng nghiên cứu 31

2.3 Nguyên liệu, vật liệu dùng tron nghiên cứu 31

2.3.1 Nguyên liệu để tiến hành các phản ứng xác định đặc tính sinh vật: 31

2.3.2 Nguyên liệu để tiến hành các phản ứng xác định đặc tính sinh hóa: 31

2.3.3 Nguyên liệu để tiến hành phản ứng PCR 32

2.4 Phương pháp nghiên cứu 32

2.4.1 Xác định đặc tính sinh vật 32

2.4.1.1 Phương pháp nhuộm Gram 32

2.4.1 2 Kiểm tra đặc tính sinh trưởng của vi khuẩn trên các môi trường

thạch 33

2.4.2 Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn 33

2.4.2.1 Thử nghiệm oxidase 33

2.4.2.2 Kiểm tra đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm 34

2.4.2.3 Kiểm tra khả năng lên men một số loại đường đơn khác 35

2.4.2.4 Phản ứng O-F 35

2.4.3 Phản ứng PCR 37

2.4.3.1 Bước tách chiết DNA 37

2.4.2 Bước tiến hành phản ứng PCR 38

2.4.3 Bước điện di 39

PHẦN III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1 Đặc tính sinh vật hóa học 40

3.1.1 Đặc tính sinh vật 40

3.1.2 Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa 42

Để tiến hành xác định 12 chủng nghiên cứu là vi khuẩn P multocida chúng tôi tiến hành thử nghiệm đặc tính oxiadase, thử nghiệm các đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm của Lassen, và khả năng lên men một số loại đường đặc trưng Kết quả thu được được thể hiện qua một số hình ảnh sau: 42

3.2 Phản ứng PCR 46

3.3 Xác định type của vi khuẩn P multocida 47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50

1 Kết luận 50

2 Đề nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Hệ thống định type và các type huyết thanh của vi khuẩn P multocida

hiện nay 16

Bảng 1.2: Các serotype gây bệnh chủ yếu trên động vật 20

Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng để tiến hành phản ứng đối với P multocida 32 Bảng 2.2 : Thành phần các chất tham gia phản ứng O-F 36

Bảng 2.3: Tỷ lệ các thành phần tham gia phản ứng PCR 38

Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 38

Bảng 3.1: Các đặc tính sinh vật của P multocida 40

Bảng 3.2: Kết quả đặc tính sinh hóa của vi khuẩn P multocida 44

Bảng 3.3: Kết quả định type vi khuẩn P multocida bằng kỹ thuật PCR 48

của vi khuẩn P multocida 49

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn P multocida 41

Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn P multocida trên môi trường thạch máu 41

Hình 3.3: Đặc tính sinh hóa của P multocida .42

Hình 3.4: Phản ứng O-F của P multocida .43

Hình 3.5: Kết quả PCR xác định vi khuẩn P.multocida 46

Hình 3.6: Kết quả đọc điện di gene mã hóa cho type A, type B 49

LỜI NÓI ĐẦU

Chăn nuôi gia súc gia cầm đóng vai trò quan trọng trong nền kinh tế

của Việt Nam Riêng năm 2008 ước tính tổng sản lượng thịt trâu, bò khoảnggần 300 nghìn tấn, sản lượng sữa khoảng 262, 2 nghìn tấn, sản lượng thịt lợnkhoảng 2,5 triệu tấn, và sản lượng thịt gia cầm khoảng 417 nghìn tấn Trong 4

tháng đầu năm 2009, tình hình chăn nuôi gia súc gia cầm ổn định Đàn bò cảnước ước tính tăng từ 1% đến 2% so với cùng kỳ năm trước, đàn lợn tăng 3%

đến 4%, đàn gia cầm tăng 6% đến 7% Nhưng dịch bệnh như lở mồm long

móng ở trâu bò, heo tai xanh, cúm gia cầm vẫn xảy ra Riêng tụ huyết trùng

do Pasteurella multocida (P multocida) trên trâu bò, lợn vẫn xảy ra rải rác tại

một số tỉnh: Cao Bằng, Bắc Cạn, Tuyên Quang, Nghệ An, Quảng Trị, TâyNinh, Kon Tum, Bạc Liêu…[2]

Bệnh tụ huyết trùng thể bại huyết xuất huyết là một bệnh truyền nhiễm

cấp tính ở trâu bò Bệnh do vi khuẩn P multocida serotype B:2 gây ra (chủ

yếu lưu hành ở Châu Á) và serotype E:2 (lưu hành ở Châu Phi) (theo De

Alwis, 1999), P multocida serotype B:2 liên quan đến bệnh tụ huyết trùng ở

lợn cũng đã được một số tác giả báo cáo (Gamage và cộng sự, 1995; Verma,

1991; Towsend và cộng sự, 1998) P multocida serotype A:1 được xác định

là gây bệnh tụ huyết trùng ở gà tại Việt Nam (K A Brogden, 2001)

Với mục đích xác định vi khuẩn P multocida nhằm phục vụ công tác

phòng và chống dịch bệnh có hiệu quả, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Xác định type vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phản ứng PCR” với

nội dung như sau:

1) Xác định vi khuẩn P multocida thông qua một số đặc tính sinh vật,

sinh hóa của vi khuẩn

2) Xác định vi khuẩn P multocida bằng kỹ thuật PCR.

3) Định type A, B, D của vi khuẩn P multocida bằng kỹ thuật PCR.

Do thời gian nghiên cứu có hạn nên báo cáo này chắc chắn sẽ còn hạn chế.

Em kính mong nhận được sự góp ý của quí thầy cô và bạn bè để nghiêncứu thêm hoàn thiện

Em xin chân thành cảm ơn

PHẦN I:

TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 1.1.1 Các nghiên cứu trong nước

Theo Phan Thanh Phượng và cộng sự (2000), khi tiến hành định type

trên 17 chủng P multocida phân lập được từ trâu, bò tại miền Trung và 11 chủng P.multocida phân lập được từ trâu, bò tại miền Bắc, trong đó ứng dụng

kỹ thuật PCR là kỹ thuật sinh học phân tử có độ nhạy cao để định type vikhuẩn Kết quả chỉ có một chủng trong số 17 chủng phân lập từ miền Trungkhông cho hình ảnh PCR đặc hiệu của type B gây bại huyết xuất huyết, tất cảcác chủng còn lại đều cho hình rất đặc trưng của type B Bằng kỹ thuậtWestern blot với các kháng huyết thanh đặc hiệu, tác giả cũng đã xác định

được chủng còn lại thuộc type D

Theo Trần Xuân Hạnh và cộng sự (2002)[1], đã tiến hành thí nghiệm

PCR với hai cặp mồi HSB và CAPB trên đối tượng vi khuẩn P multocida

phân lập từ lợn tại Việt Nam, trong đó cặp mồi HSB được K.M.Townsend vàcộng sự công bố vào năm 1998, và cặp mồi CAPB cũng do chính tác giả

thông báo vào năm 2001 Hai cặp mồi này đặc hiệu cho các chủng P.

multocida thuộc serotype B:2, B:5 hoặc B:2,5 Trong 32 chủng P multocida

thực hiện phản ứng PCR có 19 chủng đã dương tính với HSB (HSB-PCR),tuy nhiên, trong số này lại chỉ có 8 chủng dương tính với CAPB (CAPB-

PCR) Những chủng P multocida dương tính với HSB-PCR mà âm tính với

CAPB-PCR đều cho kết quả dương tính với lactose Bằng phản ứng vớiAcriflavine (Carter và Subronto, 1973) và kỹ thuật PCR với cặp mồi là CAPD

(cặp mồi đặc hiệu cho P multocida type D), các chủng này đã được xác định

thuộc type D Vì hiện tượng dương tính khi chạy HSB-PCR với một số chủng

P multocida type D, nên để xác định vi khuẩn P multocida type B cần chạy

với cả hai cặp mồi HSB và CAPB

Khi nghiên cứu về đặc tính và type huyết thanh học của vi khuẩn tụhuyết trùng trâu, bò phân lập được ở một số tỉnh phía Bắc, bước đầu Trương

Văn Dung và cộng sự (1998)[3], đã đưa ra những kết luận sau:

 Ở trâu bò nghi tụ huyết trùng thì khi lấy mẫu để phân lập có thể lấy từ

tủy xương, gan, thận, lá lách, phổi, tim

 Phân lập vi khuẩn P multocida từ dịch đường hô hấp trên có thể ria

trực tiếp trên thạch máu ở địa điểm lấy mẫu và vận chuyển nhanh vềphòng thí nghiệm

 Những vi khuẩn P multocida phân lập được mang các đặc tính sau:

Không mọc trên môi trường MacConkey, không dung huyết, sinh

Indol, lên men đường Mannitol, Xylose, Dextrose, không lên menđường Lactose, Inositol…

 Vi khuẩn tụ huyết trùng ở trâu, bò phía Bắc Việt Nam có mặt đủ 3 loạiserotype A, B, D hướng liên serotype là đáng lưu ý

1.1.2 Các nghiên cứu ngoài nước

P multocida là vi khuẩn gram âm gây bệnh trên nhiều đối tượng gia

súc tại nhiều nơi trên thế giới Vì thế đã có nhiều nghiên cứu của các nhà khoahọc trên thế giới về hình thái, đặc tính sinh hóa và khả năng cũng như đặc tínhgây bệnh của vi khuẩn này đối với gia súc

Theo hệ thống định type của Carter và Heddleston thì ở châu Á chủ yếu

là serotype B:2 và châu Phi là serotype E:2 gây bệnh tụ huyết trùng trâu, bò

Còn theo hệ thống định type của Namioka – Carter thì 6:B, 6:E lại là serotypegây bệnh chủ yếu Ở động vật hoang dã khi tiến hành phân lập vi khuẩn từbệnh phẩm kết quả thu được thường là serotype B:2,5 Theo De – Alwis

(1990), tại Ấn Độ các serotype A:1, A:3 cũng đã được báo cáo là tìm thấy ởtrâu, bò.

Theo Kirsty.M Townsend và cộng sự (1998)[18], khi dùng kỹ thuật

phân tử để xác định gene mã hóa cho vi khuẩn P multocida và gene mã hóa

các type A, B, D, E, F cho thấy phản ứng PCR có độ đặc trưng cao, và cho kếtquả phù hợp với kết quả xác định type thông thường (bằng các phương pháp

thông thường như ngưng kết hồng cầu gián tiếp) (ngoại trừ những chủng có

type F không cho kết quả phù hợp) Các nghiên cứu sử dụng các phương pháp

thông thường để định type cho vi khuẩn trước đó đã thu được những kết quả

không rõ ràng và đang gây nhiều tranh cãi giữa các nhà nghiên cứu,Kirst.M.Townsend thực hiện thí nghiệm bằng phương pháp PCR đã xác định

được chính xác các chủng P multocida cho kết quả nghi ngờ thuộc type A.

Multiplex PCR cũng giúp phân biệt giữa type A và F

Cũng theo tác giả Kirsty.M.Townsend (1998), cặp mồi KMT1T7 (KMT1SP6: 5’ -GCTGTAACGAACTCGCCAC- 3’và KMT1T7: 5’-ATCCGCTAATTTCCCAGTGG- 3’) tạo sản phẩm khuếch đại có khoảng

KMT1SP6-460 bp từ tất cả các chủng P.multocida (vì thế cặp mồi này đặc trưng cho loài

P multocida).

Cặp mồi KTSP61-KTT72 (KTSP61: 5’

-ATCCGCTAACACACTCTC-3’ và KTT72: 5’ -AGGCTCGTTTGGATTATGAAG- 3’ ) khuếch đại một sảnphẩm đặc trưng khoảng 590 bp, đoạn gene tương ứng chính là gene mã hóatype B gây bệnh tụ huyết trùng ở gia súc, đặc hiệu cho serotype B:2, B:5 hoặcB:2,5 Townsend ký hiệu cặp mồi KTSP61-KTT72 là HSB trong quá trìnhtiến hành nghiên cứu

Gần đây từ vùng gene tổng hợp kháng nguyên vỏ nhầy các cặp mồi

khác đã được thiết kế ký hiệu CAPB (Kirsty.M.Townsend và cộng sự,

2001)[17]:

CAPB-FWD: 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC- 3’CAPB-REV: 5’-GCCCGAGAGAGTTTCAATCC- 3’

Cả hai cặp mồi HSB và CAPB đều được dùng để xác định nhữngchủng thuộc serotype B

1.2.Vi khuẩn P multocida

1.2.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn

1.2.1.1 Phân loại vi khuẩn

Vi khuẩn P multocida được tìm thấy đầu tiên vào năm 1878 ở gà bị bệnh toi (tụ huyết trùng), nhưng đến năm 1880, vi khuẩn P multocida mới

được Louis Pasteur phân lập, vì vậy vi khuẩn này được đặt tên theo tên củaông Năm 1885, Kit đã phân lập được vi khuẩn này từ trâu, bò bị bệnh, và đã

đặt tên cho vi khuẩn là Bacterium bipolarmulticidium, vào năm 1886, Hueppe

đã đặt lại tên là Bacterium septicemia haemorrhagica, tên được ông đặt theo

tên bệnh do vi khuẩn này gây ra phổ biến ở trâu, bò là Haemorrhagic

septicemia Lignieres (1900) đặt tên vi khuẩn theo vật chủ: chủng phân lập từ

trâu, bò: Pasteurella boviseptica; chủng vi khuẩn phân lập từ lợn: Pasteurella

suiseptica; vi khuẩn phân lập từ gia cầm: Pasteurella aviseptica Topley và Winsol (1929), đã đặt lại tên vi khuẩn thành Pasteurella septica, sau đó Rosenbach và Merchant (1939) đổi tên thành Pasteurella multocida [27].

Theo Bergey (1994)[12] các đơn vị phân loại loài của vi khuẩn P.

multocida như sau :

Loài: Pasteurella multocida.

Theo Mutters và cộng sự (1985)[20], P multocida chia thành 3 nhóm

dưới loài : P multocida multocida (P m multocida), P multocida septica (P.

m septica), P multocida gallicida (P m gallacida) Có thể phân biệt các

chủng dưới loài thông qua khả năng lên men đường, hai đường được Mutters

chọn để phân biệt chủ yếu là Sorbitol và Dulcitol P multocida multocida

được chia nhỏ hơn thành hai chủng ký hiệu là a và b.

1.2.1.2 Đặc điểm về hình thái của vi khuẩn

Theo Smith (1959)[14], kích thước và hình thái của vi khuẩn có sự thayđổi phụ thuộc nguồn gốc của chúng Vi khuẩn phân lập từ bò có kích thướcđồng nhất từ 0,5µm đến 1,2µm Vi khuẩn phân lập từ lợn thì có kích thước

tròn hơn khoảng 0,8 µm - 1,0 µm

Hagan và Brunner (1988)[15], P multocida là cầu trực khuẩn : có chiều

rộng khoảng 0,3 µm, có chiều dài khoảng từ 0,4 µm đến 0,8 µm

Theo Malcolm De Alwis (M.C.L.De Alwis hoặc gọi tắt là De Alwis)

(1999)[27], P multocida là vi khuẩn không di động, không sinh bào tử, tồn tại

ở dạng trực khuẩn hoặc hình cầu Vi khuẩn có kích thước 0,2 μm - 0,4 μm chođến 0,6 μm - 2,5 μm Khi cấy chuyển nhiều lần, hoặc nuôi cấy vi khuẩn trongđiều kiện bất lợi, vi khuẩn tồn tại dạng đa hình thái, có chiều dài tăng, đôi khi

tồn tại cả dạng sợi Trong môi trường mới phân lập, trong mô của vật chủ,

hoặc là trong dịch nhầy P multocida tồn tại ở dạng cầu khuẩn, bắt màu hai

cực, đặc biệt là nhuộm với Leishman hoặc Methylene blue

Carter (1967)[10], cho rằng vi khuẩn P multocida khi tồn tại trong máu

động vật thường chỉ có một hình dạng nhất định, còn trong môi trường nhân

tạo vi khuẩn nuôi cấy thường đa hình dạng: có vi khuẩn hình trứng, có vikhuẩn hình cầu Trong một canh khuẩn nuôi cấy có thể thấy một số vi khuẩnhình que, một số hình trứng hoặc hình cầu cùng tồn tại Tác giả còn nhận thấy

khi nuôi cấy nhiều lần trên môi trường nhân tạo thì chiều dài của vi khuẩn

tăng lên

Theo Nguyễn Bá Hiên (2005)[6], vi khuẩn P multocida phân lập từ

trâu, bò là cầu trực khuẩn nhỏ, có hình trứng hoặc hình bầu dục, hai đầu tròn,

kích thước khoảng 0,25 µm - 0,4 µm x 0,4 µm - 1,5 µm

Theo Rosenbush và Merchart (1939)[23], khi nuôi cấy trong môi

trường có thêm carbon, vi khuẩn thường phát triển thành chuỗi

1.2.2 Đặc tính nuôi cấy

P multocida là loại vi khuẩn hiếu khí nhưng trong môi trường ít oxy vi

khuẩn vẫn tồn tại được, phát triển tốt trong nhiều loại môi trường thông

thường P multocida cũng phát triển tốt trên các môi trường thạch có bổ sung

dextrose thủy phân từ tinh bột, môi trường CSY (casein – sucrose – yeast)(theo De Alwis, 1999)[27]

1.2.2.1 Trong môi trường nước thịt

Theo Carter (1952), trong môi trường nước thịt vi khuẩn P multocida

mọc tốt, làm đục môi trường, tạo mùi đặc trưng Mùi tanh đặc trưng thể hiện

rõ nét nhất ở pha phát triển nhanh Sau khi nuôi cấy vi khuẩn lâu thì mùi tanhmất dần

Theo Hudson (1954)[16], nhiệt độ thích hợp nhất cho P multocida phát

triển là 370C, với độ pH là 7,2 - 7,6 Vi khuẩn phát triển kém ở nhiệt độ phòng

và pH nhỏ hơn 6 hoặc lớn hơn 8,5 Tác giả cũng xác định vi khuẩn mọc tốt

hơn nếu cho 5% - 10% huyết thanh động vật

1.2.2.2 Trên môi trường thạch thường

Khuẩn lạc của P multocida trên môi trường thạch thường có đặc điểm:

nhẵn, lồi, đường kính khoảng 1 mm đến 2 mm, mùi hơi ngọt (sweetish)

Những chủng vỏ dày sinh khuẩn lạc nhầy hoặc ướt (theo Hagan và Brunner,1988)[15]

1.2.2.3 Trên môi trường thạch máu

Theo De Alwis (1999)[27], khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu vàCSY có bổ sung 5% máu bò hoặc cừu, vi khuẩn phát triển thành những khuẩnlạc riêng rẽ, hình tròn, mặt lồi, có màu từ trắng đến xám, và có đường kínhkhoảng từ 1 mm đến 3 mm Những loài tạo giáp mô khó khăn thường sinhkhuẩn lạc nhầy Khi mới phân lập từ các mẫu bệnh phẩm nhiều chủng vi

khuẩn P multocida có khả năng tạo giáp mô Nhưng tính chất này mất dần đi

qua những lần cấy chuyền tiếp theo

Cũng theo De Alwis (1999), các chủng vi khuẩn P multocida hình

thành các dạng khuẩn lạc khác nhau, vi khuẩn thuộc type A sinh khuẩn lạclớn nhất, khuẩn lạc có màu từ trắng đến hơi xám, nhầy Khuẩn lạc có dạngtròn, lồi, mọc riêng rẽ, và thường ướt Khuẩn lạc thuộc type D thường nhầy

Hình thái của khuẩn lạc của type B, type E cũng phụ thuộc vào lớp vỏ, có

kích thước không đồng nhất, và có màu xám hơn khuẩn lạc khác

Theo nhiều tác giả thì trên môi trường thạch máu vi khuẩn không gâydung huyết (De Alwis, 1999; Hagan và Bruner, 2001; Trương Văn Dung vàcộng sự, 1998)

1.2.2.3 Trên môi trường thạch huyết thanh

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch huyết thanh, quan sát độ phóng đạithấp giáp mô của khuẩn lạc, De Alwis (1999)[27] đã kết luận:

 Các khuẩn lạc thuộc type D, type F, và những khuẩn lạc tròn thuộc type

A có nhiều màu giống như ngọc trai

 Các khuẩn lạc của vi khuẩn type B, type E trong môi trường thạchhuyết thanh có kích thước nhỏ hơn, màu hơi vàng hoặc hơi xanh, cũngnhiều màu như ngọc trai

Vi khuẩn P multocida miêu tả bởi Malcolm De Alwis là khuẩn lạc có

dung quang sắc cầu vồng (Irrodescent), những khuẩn lạc này tạo giáp mô và

Theo Carter (1955); Namioka và Murata (1961), P multocida phát

triển trên môi trường thạch có 3 dạng khuẩn lạc cơ bản: dạng nhầy M mucoid), dạng nhẵn bóng S (S-smooth) và dạng xù xì R (R-rough) Khuẩn lạcdạng nhầy có kích thước to nhất, màu trắng trong và có rìa nhẵn, bề mặtkhuẩn lạc ẩm ướt và có dung quang yếu Khuẩn lạc dạng S có kích thước nhỏ

(M-hơn dạng M, rìa nhẵn, mặt lồi và có dung quang mạnh Vi khuẩn dạng nàythường tạo lớp giác mô nhiều hơn loại khuẩn lạc xù xì Dạng khuẩn lạc Rthường dẹt và rìa xù xì Khuẩn lạc R có thể tạo thành trong môi trường nuôi

cấy lâu ngày (De Alwis, 1999)

1.2.2.4 Trên môi trường thạch MacConkey

Khi cấy vi khuẩn P multocida phân lập từ mẫu bệnh phẩm của bò

trong môi trường thạch MacConkey thì vi khuẩn không phát triển được Ở gà,

vi khuẩn có thể được phân lập từ phân gà bị tiêu chảy, nên nuôi cấy vi khuẩn

trên môi trường MacConkey được coi là một đặc tính sinh hoá để phân biệt

giữa P multocida với các vi khuẩn đường ruột gram âm khác Vì trong môi

trường có thành phần muối mật, muối này hầu như ức chế vi khuẩn gramdương và chỉ cho phép một số vi khuẩn đường ruột gram âm phát triển (ví dụnhư E.coli) [25]

Trên môi trường Gelatin thì vi khuẩn cũng không làm phân hủy Gelatin

để tạo thành cơ chất

1.2.3 Đặc tính sinh hóa của P multocida

Khi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường 3 ốngnghiệm để kiểm tra đặc tính sinh hóa, rồi đem ủ ở nhiệt độ 370C, ta có thể đọckết quả sau 18 giờ đến 24 giờ

Khi nuôi cấy nếu vi khuẩn sử dụng đường để phát triển sẽ sinh acid, do

đó làm biến đổi pH môi trường, Nghiên cứu đầu tiên của Lignieres (1900) về

tính chất sinh hóa của vi khuẩn cho thấy vi khuẩn làm tan chảy Gelatin, không

lên men đường Lactose, không sinh Urease, nhưng sinh Indol Tác giả đã chia

Carter (1955), cho rằng các chủng P multocida type A lên men đường

Arabinose và Dulose, không lên men đường Xylose Các chủng thuộc type B

và C lên men đường Xylose nhưng không lên men đường Arabinose vàDulcitol Chúng còn lên men đường Glucose, Maltose, Inositol, Dextrin vàtinh bột Một số chủng lên men đường yếu Sorbitol, Glycorol và Fructose tạothành Acid

Vi khuẩn P multocida còn có các đặc tính sinh hóa như sau: dương

tính với phản ứng Oxidase, dương tính với phản ứng Catalase, dương tính vớiDecarboxylase Ornithine, âm tính với Urease, khử Indole và sinh H2S trong

môi trường TSI, khử Nitrat thành Nitrit (Carter 1990)[24]

1.3 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P multocida

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn P multocida

Những kỹ thuật chẩn đoán quan trọng như sử dụng kính hiển vi điện tử,

sử dụng các phương pháp phân tích DNA của vi khuẩn đã làm sáng tỏ những

tác nhân gây độc của P multocida Các yếu tố gây độc chủ yếu của vi khuẩn

P multocida là: Polysaccharide vỏ, Endotoxin hoặc Lipopolysaccharide,

Protein ngoài màng (OMP-Outermembraine Proteins), tiêm mao và tiên mao(fimbria and adhesins), Exotoxines và các Enzym ngoại bào (extracellular)(Ragy S Seleim, 2005)[30]

Lớp vỏ P multocida đóng vai trò chủ yếu trong việc định type vi

khuẩn Thành phần chính của lớp vỏ là polysaccharides, một số vi khuẩn có

cả lipoproteins Nhưng vỏ của vi khuẩn type A còn có thành phần acidhyaluronic và cả những đường đa khác (thành phần đường đa này bị thuỷphân bởi enzym hyaluronidase) (Carter, 1953) Type F có thành phần

choadroitin và được tìm thấy chủ yếu ở gà tây ( Champlin và cộng sự, 2002;

De-Angelis và cộng sự, 2002)[30]

Tiêm mao: Bằng kính hiển vi điện tử có thể quan sát được tiêm mao

của P multocida phân lập từ lợn, thỏ, trâu bò Khả năng dính bám của tiêm

mao vi khuẩn vào bề mặt tế bào vật chủ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, môi

trường acid Tiêm mao vi khuẩn đóng vai trò giúp vi khuẩn xâm nhập vào tế

bào vật chủ Kháng thể kháng tiêm mao của tế bào vật chủ có thể ức chế khả

năng dính bám của vi khuẩn lên bề mặt tế bào (Seleim, 1993; Esslinger và

cộng sự, 1994)

Protein màng ngoài: P multocida phân lập từ các trường hợp tụ huyết

trùng trâu, bò có khoảng hơn 40 chuỗi protein ngoài màng Protein liên kết

được với hemoglobin là một protein ngoài màng gây độc chủ yếu (chuỗi

protein này đóng vai trò như một thụ thể đặc hiệu của hemoglobin) (Johnson

và cộng sự, 1991, Seleim, 1993; Seleim, 1996; Bosch và cộng sự, 2002) Từ

các trường hợp lợn mắc bệnh viêm teo mũi đã xác định được 3 chuỗi protein

màng ký hiệu là I, II, III Những chuỗi protein I, II, III có trọng lượng phân tửtrong khoảng 28 kDa đến 40 kDa, và có thể phân biệt do trọng lượng khác

nhau của các chuỗi protein Protein H của P multocida giống với protein của

Enterobacteriaceae về khả năng kháng trypsine, kháng dung dịch SDS, liênkết với peptidoglucane Tuy nhiên, protein H tạo một phức hệ miễn dịch với

polysaccharide Mặt khác protein màng được tách từ P multocida gây bệnh

trên gà có trọng lượng phân tử khoảng 50 kDa có thể ức chế hoạt động của

đại thực bào (Seleim, 1995)[7]

Lipopolysaccharide endotoxines: LPS là yếu tố gây độc chính đối với

bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò LPS của P multocida cũng tương tự với LPS

của Enterobacteriae LPS là thành phần của các kháng nguyên thân, có trọng

lượng phân tử thấp LPS của P multocida ngắn hơn LPS của các

Enterobacteriae (ví dụ như E.coli, S typhimurium) (Horadagoda và cộng sự,

2001)[30]

Exotoxin: Là ngoại độc tố sản sinh bởi vi khuẩn P multocida Những

chủng vi khuẩn type D sẽ tạo độc tố gây hoại tử da (dermonecrotic DNT) DNT là một phân tử protein có trọng lượng phân tử trong khoảng 112

toxin-kDa đến 160 toxin-kDa (thành phần protein DNT tăng cường nội độc tố của tế bào,

gây hoại tử da và và làm teo xương) (Chanter and Rutter, 1989; Ghoshal vàNiyo, 1993; Lichtenster và cộng sự, 1996)

1.3.2 Phân loại kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô

Kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô là hai kháng nguyên

được nghiên cứu nhiều của P multocida (Seleim, 1995).

1.3.2.1 Phân loại kháng nguyên giáp mô (kháng nguyên vỏ)

Phân loại kháng nguyên vi khuẩn P multocida được thực hiện đầu tiên

bởi Cornelius (1929), Yusef (1935), Little và Lyon (1943) Roberts (1947) đã

sử dụng kháng huyết thanh lấy từ thỏ tiêm cho chuột, giúp chuột kháng lại vớimột phổ rộng các chủng vi khuẩn Trên cơ sở thí nghiệm này, tác giả đã phân

loại vi khuẩn P multocida thuộc 4 type, đặt tên lần lượt là I, II, III, IV Sự phân loại của Roberts đối với P multocida ban đầu chưa được nhiều người

đồng quan điểm Nhưng khi tất cả các chủng gây bệnh tụ huyết trùng đượcxác định thuộc Roberts type I, hệ thống phân loại này mới được công bố và sử

dụng rộng rãi

Các type huyết thanh I, II, III, IV có vai trò nhất định tới việc gây rabệnh ở vật nuôi Ví dụ như bệnh tụ huyết trùng chỉ do type 1 và type nàykhông xuất hiện ở Mỹ, cũng như không phổ biến ở Bắc Mỹ (Theo Kyaw,1942) Type 1 có thể phân lập được ở Châu Á, nhất là Nam Á, còn type 2 chủyếu gây bệnh cho gia súc ở Châu Âu và Tây bán cầu Hudson (1954), tiếnhành nghiên cứu 58 chủng phân lập từ trâu, bò tại Ấn Độ, Pakistan, Thái Lan,

Kenya đều thuộc type 1

Carter (1955) [9], định type vi khuẩn P multocida bằng phương pháp

ngưng kết hồng cầu gián tiếp (Indirect haemagglutination) đã xác định được 4

type vi khuẩn P multocida Carter đã ký hiệu các type bằng chữ (4 type tương

ứng là A, B, C, D)

Sau đó, Carter xác định được chủng P multocida gây bệnh tụ huyết

trùng ở trâu, bò tại Châu Phi không thuộc vào type nào trong số các type đã

được phân loại, mặc dù tác giả cho rằng chủng vi khuẩn P multocida gây

bệnh tại Châu Phi có mối liên hệ với type B Vì vậy chủng vi khuẩn được kýhiệu tên mới: type E (Carter, 1961) Tuy nhiên, cũng chính Carter đã nhậnthấy rằng type C không tồn tại cố định và tác giả đã bỏ đi type C trong hệ

thống định type P multocida (Carter, 1963) Hệ thống phân loại kháng nguyên của Carter đối với P multocida được sử dụng cho đến ngày nay [27].

P multocida type F được xác định bởi Rimler và Rhoades (1987), tên được đặt theo phân loại của Carter Như vậy P multocida có 5 loại kháng

nguyên giáp mô, ký hiệu là A, B, D, F, E (theo phân loại của Carter, 1957)

1.3.2.2 Kháng nguyên thân

Theo Namioka và Murata (1961)[27], đã miêu tả phương pháp địnhtype kháng nguyên vỏ bằng phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính Tácgiả sử dụng môi trường nuôi cấy mẫu tươi để ngưng kết với kháng huyếtthanh tối miễn dịch của thỏ Namioka và Murata (1964) và Namioka vàBrunner (1963) cũng đã miêu tả phương pháp xác định kháng nguyên thân

trên cơ sở phản ứng ngưng kết nhanh giữa tế bào vi khuẩn P multocida được

xử lý bằng HCl với kháng huyết thanh của thỏ Bằng phương pháp này, tácgiả đã xác định được 11 type kháng nguyên thân

Heddleston và cộng sự (1972)[27], sử dụng phương pháp phản ứng kếttủa trên thạch để phát hiện kháng nguyên thân Vi khuẩn đun ở 100 0C trong 1giờ, ly tâm để tách lấy phần dịch nổi chứa kháng nguyên Kháng huyết thanh

được lấy từ gà bằng cách gây miễn dịch với kháng nguyên thân Heddleston

xác định được các kháng nguyên thân khác nhau của P multocida ký hiệu từ

1 đến 16 Phương pháp này được sử dụng để định type kháng nguyên thân

đầu tiên ở chủng vi khuẩn gây bệnh trên gà Nhưng ngày nay phương phápđược dùng định type cho tất cả các vi khuẩn từ các vật chủ khác, và kết hợp

các loại kháng nguyên này có thể phân các vi khuẩn này thành các dạng huyếtthanh khác nhau

Bảng 1.1: Hệ thống định type và các type huyết thanh của vi khuẩn P.

multocida hiện nay

nguyênCarter, 1955 Ngưng kết hồng cầu

gián tiếp (IHA)

A, B, C, D

Namioka và Murata, 1961 Ngưng kết nhanh

kháng nguyên trênphiến kính

A, B, D, E

KhángNguyênVỏ

Rimler và Rhoades, 1987 IHA FNamioka và Murata, 1961

Namioka và Brunner,1963

Namioka và Murata, 1964

Phản ứng ngưng kếtnhanh của khángnguyên xử lý HCltrên phiến kính

1 – 11Kháng

NguyênThân

Heddleston và cộng sự,1972

Phản ứng kết tủa trênthạch

1 – 16

Màng ngoài và toàn bộ thành phần protein của P multocida là cơ sở để

định type vi khuẩn (Dabo và cộng sự, 1999; Davies và cộng sự, 2003)

1.3.3 Đặc điểm kháng nguyên giáp mô và kháng nguyên thân của P.

multocida

1.3.3.1 Type A

Cho đến nay, mới chỉ có lớp vỏ của các vi khuẩn P multocida thuộc

type A là được xác định khá đầy đủ về thành phần cấu tạo Vỏ của chủng type

A có thành phần acid hyaluronic (hyaluronan)(Carter và cộng sự, 1953,1985) Hyaluronic acid là thành phần polysaccharide quan trọng của lớp vỏ

(Rosner và cộng sự, 1992) Hyaluronic acid Type A của P multocida không

có tác động vào hoạt động ức chế thực bào vì nó không có vai trò trong hệ

thống miễn dịch, nhưng việc tách vỏ của P multocida type A thì lại có liên

quan tới một yếu tố protein (khoảng 300kDa), mà protein này lại làm ức chếhoạt động thực bào ở bò (Selein, 1993) Các phân tử protein tham gia vào cấutrúc của type A của bò là giống nhau ở tất cả các vi khuẩn phân lập được(Seleim, 1996; Gadliero và cộng sự, 1998)

1.3.3.2 Type B

Type B có bản chất chủ yếu là Lipopolysaccharide (LPS), chính thànhphần này là nguyên nhân chủ yếu gây nên bệnh tụ huyết trùng LPS được cho

là có tác động kích thích TNF (Tumor necrosis factor – đây là một cytokine

có vai trò ức chế các tế bào u, được tạo ra từ các đại thực bào của bò) và giảiphóng interleukines-cũng là một cytokine (Beinhoff và cộng sự, 1992;

Horadagoda và cộng sự, 2001; Lax và Thomas 2002) [30]

Khi phân tích thành phần đường của lớp vỏ P multocida type B, kết

quả cho thấy mỗi chuỗi polysaccharide gồm Arabinose, Mannose vàGalactose với tỉ lệ 0,5 :2,0 :0,8 (N Muniandy, J Edgar, J B Woolcock và T

K S Mukkur, Int Workshop Pasteurellosis Prod Anim, 1992)

Theo Rimler và Rhoader (1989), mới chỉ một vài lần P multocida type

B được xác định là sinh độc tố protein (DNT), song không nêu rõ đặc tính

1.3.3.3 Type D của vi khuẩn P multocida

Cấu tạo lớp vỏ của P multocida type D, F được xác định đầu tiên thông

qua thành phần mucosaccharides Khi loại bỏ lớp vỏ bằng enzym, kết quả chothấy vỏ vi khuẩn có thành phần heparin và chondroitin (theo Rimler và cộng

sự, 1994) [18]

Các protein I, II, III thuộc thành phần cấu tạo của type D, trong đóchủng OMP type I sinh độc tố mạnh hơn hai OMP type II, III Các proteinnày là nguyên nhân gây nên bệnh viêm teo mũi cấp tính ở lợn (cả 3 protein

đều tham gia vào thành phần của DNT) (Seleim, 1995)[30]

1.4 Đặc tính gây bệnh của vi khuẩn P multocida

1.4.1 Đối tượng gây bệnh

Mặc dù việc ứng dụng những kỹ thuật chẩn đoán và những nghiên cứu

về bệnh ở cả động vật và vi khuẩn dễ dàng, nhưng việc nhiễm P multocida

vẫn diễn ra ở các loài vật nuôi (ở hầu hết các động vật có vú, chim), thậm chí

vi khuẩn còn sinh độc tố gây độc cho chính con người (Adlam và Rutter,

1989) Đối tượng gây bệnh của P multocida là rất rộng và các type của vi

khuẩn P multocida gây bệnh đặc trưng cho một vật chủ nhất định (Quinn và

cộng sự, 1994; Boyce và cộng sự, 2000)

 Type A, D được tìm thấy trong hầu hết các loài vật nuôi trong gia đình

(Confer, 1993; Quinn và cộng sự, 1994)

 Trong khi đó Type B, E chủ yếu tìm thấy ở các loài vật nuôi sinh sống

ở khu vực nhiệt đới, gây bệnh tụ huyết trùng ở gia súc và động vật

hoang dã (Carter, 1961; Penn và Nagy, 1976; Townsend và cộng sự,

1997) Bệnh do P multocida có thể xuất hiện nhiều ở các địa phương

có khí hậu nóng ẩm như châu Phi, châu Á, Ấn Độ (Carter và cộng sự,

1989)[3] P multocida type B gây nên bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò

(Bain và cộng sự, 1982)

 Các chủng type A có thể được phân lập từ phổi của lợn mắc bệnh viêmphổi (Baekbo, 1988), trong khi đó thì type D được phân lập từ phổi ít

hơn mà chủ yếu là từ mũi lợn

1949), từ chó (Rogers và Elder, 1967), từ ngựa và lừa (Pavri và Apte,1967)[9]

 Type F lần đầu tiên được phân lập từ gà tây ở Mỹ (Rimler và Rhoades,1987), và chim ở khu vực Bắc Mỹ (Rhoades và Rimler, 1987; Wilson

và cộng sự, 1993) Type F hầu như không tìm thấy ở các chủng vi

khuẩn P multocida phân lập được từ động vật sinh sống ở các khu vực

khác trên thế giới (Hinz và Luders 1991; Jonas và cộng sự 2001)

 Type F gây bệnh tả ở gà Tuy nhiên, trong thời gian gần đây type Fcũng đã được xác định ở vài loài động vật có vú thuộc các khu vựckhác trên thế giới (Moreno và cộng sự, 2003; Davies và cộng sự, 2003

và 2004; Jaglic và cộng sự, 2004; Catry và cộng sự, 2005)[14]

Mỗi chủng dưới loài cũng gây bệnh ở những đối tượng nhất định, mộtvài chủng là tác nhân gây bệnh quan trọng (Christensen và Bisgaard, 2000)

 Chủng dưới loài P m gallicida chủ yếu gây bệnh ở chim (Hirsh và

cộng sự, 1990), ở gia cầm (Fegan và cộng sự, 1995), ở lợn (Cameron

và cộng sự, 1996) P m septica và P m multocida thường gây bệnh nghiêm trọng hơn P m galllicida P.m multocida có thể gây bệnh ở chó và mèo, trong khi p m septica thì chủ yếu ở mèo (Biberstein và

cộng sự, 1990; Holst và cộng sự, 1992) [24]

 Ngày nay hầu hết các tác giả nghiên cứu đều kết hợp hai hệ thống phânloại kháng nguyên vỏ của Carter và hệ thống phân loại kháng nguyênthân của Heddleston để định type vi khuẩn Theo phương pháp này đã

xác định được serotype B gây bệnh tụ huyết trùng chủ yếu trên trâu, bò

là: B:2, B:5, và B:2,5 tại châu Á; E:2 tại châu Phi Nhưng trong những

năm gần đây thì cũng đã phát hiện các serotype B khác có liên quan

đến bệnh như chủng P multocida phân lập từ dịch bệnh tụ huyết trùng

của bò tại Bắc Mỹ đã được chứng minh là ngoài B:2 gây bệnh còn cóB:3,4 gây bệnh (Rimler và Rhoades, 1989) Tuy nhiên, theo KirstyM.Townsend và cộng sự (1998)[3] cặp mồi KTSP61-KTT72 sử dụngkhông thể khuếch đại đoạn gene đặc trưng của B:3,4 Ở châu Á, hầu

như các chủng gây bệnh tụ huyết trùng là B:2, B:5, gọi chung là B:2,5

 Theo hệ thống phân loại của Namioka – Carter, P multocida gây bệnh

tụ huyết trùng trên trâu, bò ở Australian là 11:B [27]

A:2 là một phân tử protein có trọng lượng phân tử khoảng 69.000 Da

(Kajikawa và Matsumoto, 1984)[24] Theo tác giả có thể kháng nguyêntype A có bản chất là Glycoprotein

Đối với các serotype của P multocida gây bệnh có thể tóm tắt trong bảng

1 (theo Namioka và Brunner, 1963; và Carter, 1967)[16]

Bảng 1.2: Các serotype gây bệnh chủ yếu trên động vật

Trâu, bò A:7; B:6; E:6; Bệnh tụ huyết trùng

1.4.2 Sức đề kháng của vi khuẩn

Vi khuẩn có sức đề kháng không cao nên thường không tồn tại lâu

ngoài cơ thể vật nuôi; chúng không tồn tại được sau 24 giờ trong đất ẩm và

thiếu ánh sáng, trong giếng và ao bẩn có nhiều chất hữu cơ, trong chuồng trại(theo Bain, 1963), có thể tồn tại ở xác thối từ 1 tháng đến 3 tháng

Theo Nguyễn Bá Hiên (2005)[6], vi khuẩn P multocida dễ bị diệt bằng

nước nóng 580C trong 20 phút, 800C sau 10 phút, 1000C chết ngay, ánh sángmặt trời trong 12 giờ, nước vôi 10%, Focmol 1%, Acid Fenic 5% đều diệt

được trong thời gian từ 1 phút đến 3 phút Các chất sát trùng thông thường

cũng có thể tiêu diệt được vi khuẩn

Khi thống kê trên một vật nuôi từng xảy ra bệnh thì có đến hơn 40%

trâu, bò khỏe mạnh vẫn mang vi khuẩn P multocida, trong khi trong đàn

không có bệnh thì tỉ lệ đó là 3,8% - 5,5% và âm tính (Mustfa và cộng sự,1978)

1.4.3 Cơ chế gây bệnh của P multocida

Vi khuẩn P multocida có thể tìm thấy trong vật nuôi mắc bệnh và ngay

cả vật nuôi lành bệnh Chúng tồn tại trong dịch của mũi, họng và các phầnkhác của cơ quan hô hấp Bình thường thì vi khuẩn bị chính những kháng thểcủa cơ thể vật nuôi tiêu diệt, vì vậy tỉ lệ tìm thấy vi khuẩn ở vật nuôi khỏemạnh tuy có nhưng rất ít Có tới 80% trâu bò mang vi khuẩn tụ huyết trùng

nhưng không gây bệnh, giữa vi khuẩn và súc vật có sự cân bằng sinh học Khi

con vật gặp điều kiện bất lợi như: bị lạnh, đói, chuồng ẩm ướt,…lúc đó sứckhỏe vật bị suy yếu, thế cân bằng bị phá vỡ và vi khuẩn trở nên cường độcgây bệnh (Nguyễn Bá Hiên, 2005)

Đặc biệt là vi khuẩn P multocida thường không gây bệnh một mình,

mà có sự kết hợp với vi khuẩn khác như Pasteurella heamolytica gây bệnh về

đường hô hấp cho trâu, bò; hay kết hợp với những virut khác gây bệnh như

IBR (Infectious Bovine Rhinotracheitis), PI-3 (Parainfluenza Virus 3), BVD(Bovine Viral Diarrhoea Virus), BRSV (Bovine Respiratory Syncytial Virus)làm cho bệnh trở nên trầm trọng hơn (các virut này thường kết hợp để gâybệnh ở đường hô hấp trên của trâu, bò) (Kayoko Ishiguro và cộng sự,2005)[17]

Độc tố của vi khuẩn là nguyên nhân gây nên những triệu chứng bệnh

trên vật nuôi, nhưng việc lan truyền độc tố gây nên bệnh tổng thể ở đường hôhấp lại là do virut đã nhiễm vào bò đảm nhiệm Vì thông thường khi bám dính

vào một vị trí nào đó vi khuẩn có thể sinh độc tố, nhưng nếu vị trí đó đã bịvirut làm tổn thương thì sẽ dễ dàng cho độc tố tác động vào cơ thể hơn Ngoài

ra các yếu tố ngoại cảnh góp phần làm cho vi khuẩn trở nên cường độc [8]

P multocida cũng có thể tác động cùng với Pasteurella haemolytica

(P haemolytica) gây bệnh cho gia súc (có thể gọi chung là Pasteurellosis).

Chẳng hạn như bệnh viêm phổi ở trâu, bò có thể do nhiễm P haemolytica type A serotype 1 (A:1) và P multocida type A gây ra Trong đó P.

haemolytica có khuynh hướng gây viêm thùy phổi bò, P multocida có

khuynh hướng gây viêm cuống phổi Mặc dù vậy các điểm hoại tử xuất hiện

trên phổi bò thường do độc tố của P haemolytica (PAH - Pfizer Animal

Health Australia)[28]

Vi khuẩn P multocida cũng có thể kết hợp với vi khuẩn Bordetella

bronchiseptica (B bronchiseptica) gây bệnh viêm teo mũi ở lợn Trực khuẩn

B bronchiseptica gây khởi phát bệnh này ở lợn con nhờ khả năng dính bám

vào niêm mạc xoang mũi, gây viêm, tạo điều kiện cho P multocida sinh độc

tố hoại tử da (Dermonecrotoxin-DNT) không chịu nhiệt kết bám và sản sinh

độc tố làm tế bào xương xoang mũi teo viêm mãn tính tiến triển, đôi khi bệnh

này kết hợp với bệnh viêm phổi - phế quản (Phạm Hồng Sơn, 2002)[20]

Theo De Jong (1983)[19], có khoảng 10% đến 15% lợn nuôi tại nhà bị

nhiễm vi khuẩn P multocida, và lợn con có thể dễ dàng bị nhiễm trong vòng

một tuần sau khi sinh Mức độ nghiêm trọng của các tổn thương do vi khuẩn

gây ra phụ thuộc độ tuổi mà lợn bị nhiễm P multocida Ở những con lợn già

yếu thì tổn thương thường lớn hơn Hiện tượng teo turbinate cũng đã xuấthiện ở lợn 16 tuần tuổi bị nhiễm vi khuẩn Theo Rutter và cộng sự, 1984 thấy

rằng những con lợn nhiễm P multocida trong khoảng 12 tuần đến 16 tuần

tuổi có những tổn thương ở cuống phổi Bệnh cũng được quan sát ở những

con lợn 3 tháng tuổi (Nielsen và cộng sự, 1976) Khi tiêm độc tố P multocida

(với lượng 125µg/kg thể trọng) thấy có biểu hiện teo mũi ở lợn 10 tuần tuổi(Rutter, 1985)

Theo Keith R Gooderham (2001)[17], P multocida gây bệnh và có

mức độ nhiễm cao ở tất cả các loài gia cầm (kể cả các loài chim hoang dã)

Bệnh xuất hiện phổ biến ở nhiều nước gây thiệt hại nghiêm trọng đến nềnkinh tế Tất cả loài gia cầm đều có thể mắc bệnh, nhưng ở gà tây thì tỉ lệ cao

hơn gà, vịt, ngan

1.4.4 Các con đường lây nhiễm

 Con vật không mắc bệnh hít phải không khí do con mắc bệnh thải ra,hoặc do ăn thức ăn hoặc uống nước có chứa mầm bệnh hoặc lây trựctiếp do có sự tiếp xúc giữa con vật khỏe mạnh và con vật mang bệnh

Vi khuẩn có thể dễ dàng lây lan giữa các con vật với nhau, đặc biệt

trong điều kiện vận chuyển hay điều kiện sống đông đúc Theo một số

tác giả khác thì ngay cả việc trong đàn có bệnh mà chúng ta tiến hànhchẩn đoán lâm sàng, nếu không cẩn thận có thể cũng làm lây nhiễmbệnh sang vật nuôi khỏe mạnh (Macadam, 1962)[24]

 Theo Keith R Gooderham (2001)[17], chim mang mầm bệnh, chimmắc bệnh, phân chim, chất thải từ chim chết do mắc bệnh, các loàichim hoang dã (đặc biệt là chim di trú) được cho là nguồn lây nhiễmbệnh cho các loài gia cầm nhà Các con chuột cũng là nguồn lây truyềnbệnh Nhưng nguồn lây nhiễm chính có lẽ là qua nước và thức ăn

Trứng gia cầm thường không bị nhiễm vi khuẩn P multocida do có

lớp màng mỏng bảo vệ Gia cầm bị nhiễm qua mũi, miệng, niêm mạc

và các vết thương

 Theo Nguyễn Bá Hiên (2005), bệnh có thể lây trực tiếp giữa con vật

ốm và con vật khỏe, do thức ăn, dụng cụ chăn nuôi, nước uống bị

nhiễm Mầm bệnh xâm nhập thông qua đường tiêu hóa hoặc các tổn

thương ngoài da, hít phải bụi có mầm bệnh

1.4.5 Triệu chứng và bệnh tích

1.4.5.1 P multocida gây bệnh trên đối tượng trâu, bò

Ở trâu, bò vi khuẩn P multocida type B gây bệnh tụ huyết trùng có

triệu chứng và bệnh tích như sau: đầu tiên là tụ và xuất huyết một sốvùng trên cơ thể, sau đó vào máu gây nhiễm trùng máu, biểu hiện là

xuất huyết bại huyết Trong nước bọt của những con vật bị nhiễm có một lượng lớn P multocida ở giai đoạn đầu của bệnh Và con vật

thường bị chết sau 24 giờ nhiễm phải vi khuẩn P multocida (kể cả

nhiễm bằng con đường tiêu hóa (Bain và cộng sự, 1982)[7]

Bệnh có 3 thể:

 Thể quá cấp: Đột nhiên sốt cao, run rẩy, có triệu chứng thần kinh nhưhung dữ, điên cuồng, đập đầu vào chuồng, chết nhanh trong 24 giờ, íttriệu chứng lâm sàng

 Thể cấp tính: Thời gian nung bệnh chỉ từ 2 ngày đến 3 ngày, biểu hiện

là không nhai lại, mệt nhọc, sốt cao khoảng 400C - 410C; nước mũi

chảy liên tục, các vùng da như niêm mạc mắt, mũi…xuất hiện tụ máu;

hạch lâm ba sưng Nếu bị bệnh ở thể phổi thì thở mạnh và khó do viêmmàng phổi, tràn dịch, tụ huyết, viêm phổi cấp Một số trâu bò còn bịtróc ruột, ỉa chảy dữ dội, phân lẫn máu Nếu nhiễm trùng máu thì thờigian chết nhanh hơn

 Thể mãn tính: nếu gia súc không chết thì sẽ chuyển sang thể mãn tính:

ruột viêm làm thú lúc ỉa chảy, lúc táo bón Viêm khớp dẫn đến thú đilại khập khiễng, khó khăn Viêm phế quản và viêm phổi mãn tính Giasúc có thể khỏi bệnh

P multocida cũng gây bệnh viêm phổi ở bò sữa, gây sốt ở bê mới cai

sữa,… Các triệu chứng như sau: Đầu tiên làm viêm cuống phổi, viêmmàng phổi, kết hợp với sốt, những triệu chứng này xảy ra trong cùngmột thời điểm mắc bệnh nên gọi chung là hội chứng bệnh đường hôhấp ở bò Khi mắc bệnh vật nuôi có thể chết trong vòng từ 34 giờ đến

36 giờ kể từ sau khi xuất hiện các triệu chứng

Nếu bệnh trở thành mãn tính thì không gây chết, nhưng mà gây hại chophổi, lâu ngày làm phổi bị xơ hóa, áp xe

1.4.5.2 P multocida gây bệnh trên đối tượng gà

Theo Keith R Gooderham (2001)[17], khi nghiên cứu về bệnh của giacầm đã đưa ra những kết luận sau:

Gà bị mắc bệnh tụ huyết trùng có thể chia ra thành: dạng quá cấp, cấptính, mãn tính Ở dạng quá cấp thấy nhiều loài gia cầm chết nhưng cơthể không có biểu hiện tổn thương Gia cầm mắc bệnh thể cấp tính cócác biểu hiện như chán ăn, hoạt động chậm chạp, mũi và miệng chảydãi, tím tái, ỉa chảy phân rất hôi Khi con vật không chết thì sẽ chuyển

sang giai đoạn mãn tính

Các triệu chứng lâm sàng xuất hiện ở gà mắc bệnh: ủ rũ, đi lại chậmchạp, viêm màng kết, đi khập khiễng, đầu ngoẹo sang một bên, mào bị

sưng

Gia cầm mắc bệnh ở dạng quá cấp và cấp tính xuất hiện chứng xunghuyết, gan có nhiều điểm bị hoại tử, ở gà mái đang đẻ có thể xuất hiệntrứng không có lòng đỏ Bệnh cấp tính ở thể nhẹ thấy gà bị sưng phổi

(đặc biệt gà tây), viêm phổi và viêm gan Bệnh giai đoạn mãn tính có

biểu hiện: hoại tử da ở chân, mào bị cứng lại, có thể chảy mủ ở taigiữa…

1.4.5.3 Bệnh trên đối tượng lợn

Theo Nguyễn Bá Hiên (2005), triệu chứng và bệnh tích của lợn mắcbệnh tụ huyết trùng như sau:

Thể quá cấp tính: con vật sốt cao 410C đến 420C, thở khó, mệt nhọc,nằm bệt, tím tái ở vùng da bụng, tai, các niêm mạc đỏ xẫm hoặc tímbầm Lợn bị thủy thũng dưới da vùng hầu, mặt làm hầu sưng, cổ cứng,con vật thường chết do ngạt thở và nhiễm trùng huyết

Thể cấp tính: lợn ủ rũ, ăn ít, sốt 410C, xuất hiện triệu chứng hô hấp như

ho ngày càng nặng, viêm niêm mạc mũi, chảy nước mũi nhờn đục, tim

đập nhanh, xuất hiện nhiều vết tím bầm hơn, con vật rối loạn tiêu hóa,lúc đầu đi táo, sau ỉa chảy Phù nề dưới da vùng hầu, cổ và bụng rất

nặng, tích nhiều nước trong xoang ngực, xoang bụng, phổi viêm tụ máutừng đám, có nhiều vùng gan hóa, mô phổi cứng lên, có nhiều ổ hoại

tử Bệnh tiến triển 2 ngày đến 3 ngày, con vật yếu dần rồi chết

Thể mãn tính: con vật ho, khó thở, ỉa chảy liên miên, các khớp xương

bị viêm, sưng, nóng, đau nhất là khớp gối Xác gầy, nhiều vùng phổi bị

xơ hóa và hoại tử, viêm xơ ở màng phổi và màng tim, viêm dính màng

phổi với cơ hoành, viêm khớp có mủ Sau 2 ngày đến 3 ngày con vậtchết do suy nhược

1.4.6 Điều trị và phòng bệnh

1.4.6.1.Biện pháp phòng bệnh

Theo Nguyễn Bá Hiên (2005), biện pháp tốt nhất là áp dụng vệ sinhphòng bệnh: vệ sinh ăn uống, chăm sóc hợp lý, thường xuyên tiêu độc chuồngtrại, không để thú lầy lội, ướt, khi vận chuyển thú đi xa phải tránh vận chuyển