L ỜI NÓI ĐẦU
2.4.Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Xác định đặc tính sinh vật 2.4.1.1. Phương pháp nhuộm Gram
Mục đích tiến hành nhuộm là quan sát hình thái của vi khuẩn, phân biệt
tính bắt màu của vi khuẩn.Sau khi nhuộm Gram, tiến hành soi kính ở vật kính
dầu (100x) theo Quinn và cộng sự mô tả như sau:
Dùng que cấy vòng lấy một giọt canh khuẩn, dàn đều lên bề mặt lam kính. Để khô tự nhiên, hơ lam kính 2-3 lần trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó
nhuộm:
1) Phủ lên tiêu bản dung dịch Crytal violet trong một phút, rửa nhẹ bằng nước.
2) Phủ lên tiêu bản dung dịch Lugol trong một phút, rửa nhẹ bằng nước.
4) Phủ lên tiêu bản dung dịch Fuchsin trong 1 phút, rửa lại bằng nước, để
khô, tiến hành quan sát dưới kính hiển vi. Quan sát ở độ phóng đại
1000, và quan sát giọt dầu.
2.4.1. 2. Kiểm tra đặc tính sinh trưởng của vi khuẩn trên các môi trường
thạch
Môi trường thạch để thực hiện thí nghiệm gồm: Thạch thường, thạch
máu, thạch MacConkey.
Thạch thường: Môi trường BHI(bổ sung agar) được hấp ở 1210C, trong
15 phút, để nguội xuống 450C đến 500C, đổ đĩa, để đĩa thạch đông lại,
bao gói và nên giữ trong tủ ấm khoảng 1 ngày trước khi sử dụng. Lấy
canh khuẩn và tiến hành cấy ria trên môi trường thạch, ủ ở nhiệt độ
370C trong tủ ấm, quan sát sau khoảng 18 giờ đến 24 giờ.
Thạch máu: Cân môi trường BHI (bổ sung agar), hấp khử trùng rồi để
nguội xuống khoảng 500C, bổ sung 7% đến 10% máu cừu hoặc máu bò (hoặc máu thỏ). Đổ đĩa và tiến hành cấy tương tự thạch thường, ủ trong
tủ ấm và quan sát sau 18 giờ đến 24 giờ.
Trên môi trường thạch MacConkey tiến hành như đối với môi trường
BHI agar.
2.4.2. Kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn
2.4.2.1. Thử nghiệmoxidase
Tiến hành như sau: thấm ướt giấy lọc bằng dung dịch Tetramethyl-p- phenylenediamine dihydrochloride 1%, dùng que cấy vòng lấy sinh khối vi
khuẩn, dàn đều trên giấy lọc, quan sát sự xuất hiện màu xanh dương trong 1 phút.
Đọc kết quả: Kết quả là dương tính khi xuất hiện màu xanh, và không xuất hiện màu xanh là kết quả âm tính.
2.4.2.2. Kiểm tra đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm
Tiến hành kiểm tra các đặc tính sinh hóa của vi khuẩnP.multocida trên
môi trường 3 ống nghiệm theo Lassen (1975), đã sử dụng hệ thống 3 ống
nghiệm như sau:
Kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA: dùng que cấy vô trùng lấy
khuẩn lạc cần kiểm tra ria đều trên mặt thạch nghiêng, sau đó cấy chích
sâu xuống phần thạch đứng, để tủ ấm 370C, sau 18 giờ đến 24 giờ đọc
kết quả. Trong môi trường KIA này cho phép xác định 4 tính chất sau:
khả năng lên men đường glucose, đường lactose, sinh hơi, sinh H2S: Nếu phần thạch đứng chuyển sang màu vàng, phần thạch nghiêng
vẫn giữ màu đỏ thì vi khuẩn chỉ có khả năng lên men Glucose. Nếu cả hai phần thạch đứng và thạch nghiêng chuyển sang màu
vàng thì vi khuẩn có khả năng lên men cả Glucose và Lactose.
Kiểm tra sinh hóa trên môi trường Mannitol – Motility: dùng que cấy
vô trùng lấy khuẩn lạc và cấy một đường thẳng chích sâu vào thạch,
gần xuống đáy, rồi để ở tủ ấm, sau 18 giờ đến 24 giờ đọc kết quả. Môi trường này cho phép đọc 2 tính chất là: khả năng lên men đường
mannitol, khả năng di động:
Nếu môi trường chuyển sang màu vàng thì vi khuẩn có khả năng lên men Mannitol, nếu môi trường không chuyển màu thì kết quả là âm tính.
Quan sát thấy vi khuẩn phát triển lan ra khỏi đường cấy thì vi khuẩn
có khả năng di động.
Kiểm tra sinh hóa trên môi trường Urea - Indol: môi trường lỏng, cấy
khuẩn lạc vào rồi lắc đều, ủ trong tủ ấm sau 18 giờ đến 24 giờ thì đọc
kết quả. Môi trường này cho phép xác định hai tính chất: vi khuẩn sinh
nghiệmthuốc thử Kovac, nếu thấy xuất hiện màu hồng cánh sen thì kết
quả là dương tính. Kết quả là âm tính nếu không xuất hiện màu hồng
cánh sen khi nhỏ thuốcthử.
2.4.2.3. Kiểm tra khả năng lên men một số loại đường đơn khác
Các loại đường sử dụng trong thí nghiệm gồm: Trehalose, L-Arabinose, D-sorbitol, Dulcitol, Saccharose. Tiến hành phản ứng trên tất cả các chủng
giống. Theo Trần Linh Thước (2007)[22], thửnghiệm này nhằm xác định khả năng sử dụng nguồn carbon nhất định của vi khuẩn để tăng trưởng.
Thành phần của môi trường được cân theo tỉ lệ (tính cho 100 ml môi trường):
Pepton: 1 g; NaCl: 0,5 g; Phenol red 2o/oo: 1,25 ml; Agar: 0,25 g; Nước cất (DW: Distilled water): 100 ml.
Môi trường có thành phần phenol đỏ, khi vi khuẩn sử dụng nguồn
carbon để sinh trưởng sẽ sinh acid làm giảm pH của môi trường, màu đỏ của
phenol đỏ sẽ chuyển thành màu vàng khi pH của môi trường dưới 6,8.
Chia môi trường vào 25 ống nghiệm, sau đó cho 1 g mỗi loại đường
vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1000C, trong khoảng thời gian 30 phút. Để môi trường nguội, và giữ trong tủ ấm ít nhất một ngày trước khi dùng.
Tiến hành: Khử trùng que cấy, để nguội, lấy một ít khuẩn lạc cấy vào
môi trường. Để trong tủ ấm và đọc kết quả sau 18 giờ đến 24 giờ.
Đọc kết quả: Nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho kết quả dương tính, còn môi trường không đổi màu thì kết quả là âm tính.
2.4.2.4. Phản ứng O-F
Chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng lên men và khả năng oxi hóa
bằng phản ứng O-F. Môi trường có các thành phần và cách pha như sau (tính cho 1000 ml môi trường):
- Thành phần: Bảng 2.2: Thành phần các chất tham gia phản ứng O-F Tryptone : 10 g Yeast extract : 1 g NaCl : 5 g Bromocresol purple : 0,001 g Distilled water : 1.000 ml Glucose : 10 g Mannitol : 10 g - Cách pha:
Cân các thành phần Tryptone, nấm men, muối cho vào bình tam giác có khoảng 80 ml nước cất, sau đó bổ sung Bromocresol. Chia ra các ống
nghiệm. Một nửa số ống nghiệm đổ thêm một lớp dầu Parafin mỏng. Sau đó đem hấp ở 1210C trong 15 phút. Để nguội xuống khoảng 500C.
Cân Glucose, Mannitol cho vào bình tam giác chứa 20 ml nước cất, lắc đều cho tan, hấp ở 1000C trong 30 phút.
Môi trường đường sau khi hấp xong, chia vào các ống nghiệm trên
trong điều kiện vô trùng, mỗi ống từ 3ml đến 4 ml (gồm cả môi trường đường và môi trường Tryptone).
- Tiến hành:
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cấy vào môi trường đường, để tủ ấm 370C. Nuôi cấy 18 giờ đến 24 giờ và đọc kết quả.
- Đọc kết quả:
Vi khuẩn có khả năng oxi hóa: chỉ sinh axit ở các ống hiếu khí (vàngở
các ống hiếu khí, tím xanh ở các ống kỵ khí).
Vi khuẩn có khả năng lên men đường: sẽ sinh axit ở cả 2 ống (cả 2 ống
Vi khuẩn không có khả năng lên men và không oxi hóa: sẽ không sinh
axit (màu tím xanhở ống hiếu khí, màu tímở ống kỵ khí)
2.4.3. Phản ứng PCR
2.4.3.1. Bước tách chiết DNA
P. multocida phân lập từ các vật chủ được cấy chuyển trên thạch máu
để thu khuẩn lạc thuần, tiến hành tách chiết DNA từ khuẩn lạc thuần. Thực
hiện phản ứng trên tất cảcác chủng vi khuẩn nghiên cứu.
Lấy khoảng 200 µl nước siêu sạch vàoống eppendorf.
Thu khuẩn lạc thuần vàoống eppendorf trên, lấy một lượng vừa phải.
Vortex để trộn đều khuẩn lạc.
Để ống eppendorf vào giá, đun ở 1000C trong 10 phút để phá vỡ tế bào vi khuẩn.
Ly tâmở 4 nghìn vòng / phút. Trong quá trình ly tâm, do nhiệt độ trong
máy ly tâm lạnh, có sự chênh lệch với nhiệt độ của ống eppendorf vừa
bị đun nên tế bào vi khuẩn không thích ứng kịp, màng tế bào bị vỡ giải
phóng DNA. Lực ly tâm lớn cũng làm cho tế bào bị tác động mạnh và vỡ ra.
Đồng thời quá trình ly tâm cũng làm cho thành phần vỏ và tế bào nặng hơn bị lắng xuống. Hút dịch nổi phía trên để thuDNA.
2.4.2. Bước tiến hành phản ứng PCR
Tỉ lệ các thành phần tham gia phản ứng PCR như sau:
Bảng 2.3:Tỷ lệ các thành phần tham gia phản ứng PCR
Thành phần x 1mấu x 2 mẫu x 12 mẫu
H2O 11,7 23,4 140,4 Buffer x 10 2,5 5 30 MgCl225mM 1,5 3 18 dNTPs 10mM 2 4 24 Qx5 1 2 12 CAP A 1 10 pmol 0,5 1 6 CAP A 2 10 pmol 0,5 1 6 CAP B 1 10 pmol 0,5 1 6 CAP B 2 10 pmol 0,5 1 6 CAP D 10 pmol 0,5 1 6 CAP D 10 pmol 0,5 1 6 Taq DNA 0,3 0,6 3,6 Chu trình PCR như sau:
Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút) Giai đoạn 1 1 94 5 94 1 62 1 35 72 1,5 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 1 72 10
2.4.3. Bước điện di
Đổ gel điện di: gel sử dụng là Agarose, tỉ lệ đổ gel khoảng từ 15% đến
20%. Cân 0,4 g Agarose. Hòa tan agar bằng nước TBE (thể tích nước
lấy khoảng 25 ml). Đun agar trong lò vi sóng để làm tan Agarose, khi
đun thấy agar sôi lấy ra lắc cho gel tan đều rồi đun sôi trở lại là được. Để nguội agar xuống còn khoảng 500C, bổ sung Ethidium Brommide (ETB)(khoảng 6 µl ETB/100 ml gel).
Tiến hành tra mẫu và chạy điện di: lấy khoảng 10 µl đến 12 µl mẫu vào mỗi giếng. Riêng Maker tùy theo tỉ lệ pha mà có thể lấy khoảng 5 µl đến 9 µl.
Tiến hành chạy điện di. Trong quá trình điện di, do DNA tích điện âm
nên sẽ di chuyển từ cực âm sang cực dương.
Đọc kết quả điện dibằng hệ thống máy đọc kết nối máy tính và máy in.
2.5. Phương pháp xử lý số liệu.
Các thí nghiệm đều tiến hành từ 3 lần trở lên, kết quả là trung bình giữa
PHẦN III:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc tính sinh vật hóa học3.1.1. Đặc tính sinh vật 3.1.1. Đặc tính sinh vật
Đặc tính sinh vật của các loài vi khuẩn khác nhau và đặc trưng cho mỗi
loài, vì vậy có thể căn cứ vào đặc tính sinh vật để bước đầu phân biệt với các
loài vi khuẩn khác.
P. multocida gây bệnh phổ biến ở gia súc, gia cầm nên cũng đã có
nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn, các đặc tính đặc trưng cho vi khuẩn được qui định thành tiêu chuẩn, ví dụ như AVID Đức (1992) bao gồm các chỉ tiêu để kiểm tra đặc tính sinh vật hóa học củaP. multocida.
Để xác định vi khuẩn P. multocida, bước dầu tiên chúng tôi tiến hành thực hiện các kiểm tra đặc tính sinh vật trên tất cả các chủng nghiên cứu. Kết
quả được thể hiện trong bảng 1:
Bảng3.1: Các đặc tính sinh vật củaP. multocida
STT Ký hiệu
chủng
Đặc điểm hình thái Đặc điểm khuẩn
lạc trên BHI
Đặc điểm khuẩn lạc
trên thạch máu
1 Ga1, Ga2, Ga3, Ga4
Gram âm, cầu trực
khuẩn, riêng rẽ, đôi
hoặc chuỗi.
Trắng (ngà vàng),
hơi lồi, rìa gọn,
nhầy, ướt.
Trắng xám, tròn, hơi
lồi, ướt, nhẵn, rìa gọn,
không dung huyết
2 Tb1, Tb2, Tb3
Gram âm, cầu
trực khuẩn, riêng rẽ, đôi hoặc chuỗi.
Trắng ngà vàng, tròn, rìa gọn, lồi,
ráo, nhẵn.
Trắng xám, nhẵn, tròn, lồi, rìa đều, không
dung huyết.
3 L1, L2, L3 Gram âm, cầu trực
khuẩn, riêng rẽ, đôi
hoặc chuỗi.
Ngà vàng, tròn, rìa gọn, lồi, nhẵn.
Trắng xám, tròn, lồi,
rìa đều, không dung
huyết.
4 De1, De2 Gram âm, cầu trực
khuẩn, riêng rẽ, đôi
hoặc chuỗi.
Trắng sữa, ngà vàng, tròn, lồi, rìa gọn, nhẵn
Trắng xám, tròn, lồi,
rìa đều, không dung
Trong quá trình tiến hành nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy các chủng
phân lập từ một nguồn gốc có hình thái khuẩn lạc tương đối giống nhau nên
được thể hiện vào một nhóm, giữa các nhóm cũng có đặc điểm khác nhau.
Nhóm 1 có khuẩn lạc ướt, nhầy, 3 nhóm còn lại ráo hơn. Theo De Alwis (1999) [7], Hagan và Bruner (1988) [9], khi quan sát khuẩn lạc P. multocida,
tác giả nhận thấy chỉ có những chủng type A lớn nhất, nhầy, ướt do lớp vỏ có thành phần acid hyaloronic. Các chủng vi khuẩn thuộc type D cũng sinh vỏ
nhầy, các chủng vi khuẩn type B thì vỏ ráo hơn.
Các chủng nghiên cứu đều thể hiện đặc tính sinh vật của P. multocida:
khuẩn lạc bắt màu Gram âm, là cầu trực khuẩn, mọc riêng rẽ và thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn, khuẩn lạc tròn, rìa gọn, lồi, nhẵn, không dung huyết trên
môi trường thạch máu. Kết quả thu được phù hợp với miêu tả vi khuẩn P.
multocida của nhiều tác giả.
Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn
P. multocida.
(tiêu bản nhuộm Gram, độ phóng đại
1000).
Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn P. multocida trên môi trường thạch máu..
3.1.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa
Để tiến hành xác định 12 chủng nghiên cứu là vi khuẩn P. multocida
chúng tôi tiến hành thử nghiệm đặc tính oxiadase, thử nghiệm các đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm của Lassen, và khả năng lên men một
số loại đường đặc trưng. Kết quả thu được được thể hiện qua một số hình ảnh sau:
1) Các chủng kiểm tra đều cho kết quả dương tính khi tiến hành phản ứng
oxidase, tức là xuất hiện màu xanh dương sau một phút kiểm tra.
Hình 3.3: Phản ứng Oxidase của vi khuẩn P. multocida.
2) Kết quả trên môi trường 3 ống nghiệm của Lassen
3) Hìnhảnh P. multocida tham gia phản ứng O-F.
Kết quả kiểm tra sinh hóa của các chủng vi khuẩn được trình bày trong bảng 3.2:
Bảng 3.2: Kết quả đặc tính sinh hóa của vi khuẩn P. multocida
STT Đặc tính sinh hóa n n+ n- Kết luận
1 Glucose 12 12 0 100% lên men Glucose
2 Lactose 12 0 12 100% không lên men Lactose
3 Mannitol 12 12 0 100% lên men Mannitol
4 Urease 12 0 12 100% không sinh Urease
5 Indol 12 12 0 100% sinh Indol
6 O-F 12 12 0 100% dương tính cả hai ống.
7 Saccharose 12 12 0 100% lên men Saccharide
8 Trehalose 12 0 12 100% không lên men Trehalose
9 Dulcitol 12 0 12 100% lên men Dulcitol
10 L-Arabinose 12 12 0 100% lên men L-Arabinose
11 D-Sorbitol 12 8 4 66,67% lên men Sorbitol
12 Oxidase 12 12 0 100% dương tính.
Ghi chú: n: Tổng số chủng kiểm tra; n+: Số chủng dương tính; n- : Số chủng
âm tính
Nhận xét:
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau: Kết quả phản ứng sinh hóa của 12 chủng vi khuẩn nghiên cứu phù hợp
với kết quả của Carter (1990), và kết quả của Sharah O. Ekundayo
(2008) về vi khuẩn P. multocida: 100% vi khuẩn sử dụng Glucose,
không sử dụng Lactose, không sinh hơi, dương tính với Oxidase, sinh Indol.
Kết quả phản ứng O-F là 100% dương tính ở cả hai ống nghiệm, nghĩa
là chủngP. multocida có khả năng lên men trong cả điều kiện giàu Oxi
và trong điều kiện lượng Oxi rất ít. Vi khuẩn P. multocida là vi khuẩn
hiếu khí tùy tiện.
Từ tất cả kết quả nghiên cứu trên cho phép chúng tôi khẳng định các
chủng vi khuẩn nghiên cứu là P. multocida.
Theo Mutters và cộng sự (1995), có thể xác định các chủng dưới loài do sự khác nhau bởi khả năng lên men các loại đường, đặc biệt là
đường Sorbitol và Dulcitol. Trong đó vi khuẩn P.multocida multocida
âm tính với đường Dulcitol, dương tính với đường Sorbitol;
P.multocida septica âm tính với cả Dulcitol và Sorbitol; P.multocida
gallicida dương tính với cả Dulcitol và Sorbitol. Theo nghiên cứu của
Sarah O. Ekundayo (2008), khả năng sinh Indol cũng là một tiêu chuẩn để phân biệt các chủng dưới loài: Tất cả các chủng thuộc P. multocida
multocida và P.multocida septica cho kết quả dương tính với Indol,
các chủngP.multocida gallicida không sinh Indol.
Từ những cơ sở trên chúng tôi nhận định về kết qủa thí nghiệm như
sau: có 66,67% chủng lên men đường D-Sorbitol, thuộc P.multocdia