L ỜI NÓI ĐẦU
3.1. Đặc tính sinh vật hóa học
3.1.1. Đặc tính sinh vật
Đặc tính sinh vật của các loài vi khuẩn khác nhau và đặc trưng cho mỗi
loài, vì vậy có thể căn cứ vào đặc tính sinh vật để bước đầu phân biệt với các
loài vi khuẩn khác.
P. multocida gây bệnh phổ biến ở gia súc, gia cầm nên cũng đã có
nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn, các đặc tính đặc trưng cho vi khuẩn được qui định thành tiêu chuẩn, ví dụ như AVID Đức (1992) bao gồm các chỉ tiêu để kiểm tra đặc tính sinh vật hóa học củaP. multocida.
Để xác định vi khuẩn P. multocida, bước dầu tiên chúng tôi tiến hành thực hiện các kiểm tra đặc tính sinh vật trên tất cả các chủng nghiên cứu. Kết
quả được thể hiện trong bảng 1:
Bảng3.1: Các đặc tính sinh vật củaP. multocida
STT Ký hiệu
chủng
Đặc điểm hình thái Đặc điểm khuẩn
lạc trên BHI
Đặc điểm khuẩn lạc
trên thạch máu
1 Ga1, Ga2, Ga3, Ga4
Gram âm, cầu trực
khuẩn, riêng rẽ, đôi
hoặc chuỗi.
Trắng (ngà vàng),
hơi lồi, rìa gọn,
nhầy, ướt.
Trắng xám, tròn, hơi
lồi, ướt, nhẵn, rìa gọn,
không dung huyết
2 Tb1, Tb2, Tb3
Gram âm, cầu
trực khuẩn, riêng rẽ, đôi hoặc chuỗi.
Trắng ngà vàng, tròn, rìa gọn, lồi,
ráo, nhẵn.
Trắng xám, nhẵn, tròn, lồi, rìa đều, không
dung huyết.
3 L1, L2, L3 Gram âm, cầu trực
khuẩn, riêng rẽ, đôi
hoặc chuỗi.
Ngà vàng, tròn, rìa gọn, lồi, nhẵn.
Trắng xám, tròn, lồi,
rìa đều, không dung
huyết.
4 De1, De2 Gram âm, cầu trực
khuẩn, riêng rẽ, đôi
hoặc chuỗi.
Trắng sữa, ngà vàng, tròn, lồi, rìa gọn, nhẵn
Trắng xám, tròn, lồi,
rìa đều, không dung
Trong quá trình tiến hành nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy các chủng
phân lập từ một nguồn gốc có hình thái khuẩn lạc tương đối giống nhau nên
được thể hiện vào một nhóm, giữa các nhóm cũng có đặc điểm khác nhau.
Nhóm 1 có khuẩn lạc ướt, nhầy, 3 nhóm còn lại ráo hơn. Theo De Alwis (1999) [7], Hagan và Bruner (1988) [9], khi quan sát khuẩn lạc P. multocida,
tác giả nhận thấy chỉ có những chủng type A lớn nhất, nhầy, ướt do lớp vỏ có thành phần acid hyaloronic. Các chủng vi khuẩn thuộc type D cũng sinh vỏ
nhầy, các chủng vi khuẩn type B thì vỏ ráo hơn.
Các chủng nghiên cứu đều thể hiện đặc tính sinh vật của P. multocida:
khuẩn lạc bắt màu Gram âm, là cầu trực khuẩn, mọc riêng rẽ và thành từng đôi hoặc chuỗi ngắn, khuẩn lạc tròn, rìa gọn, lồi, nhẵn, không dung huyết trên
môi trường thạch máu. Kết quả thu được phù hợp với miêu tả vi khuẩn P.
multocida của nhiều tác giả.
Hình 3.1: Hình thái vi khuẩn
P. multocida.
(tiêu bản nhuộm Gram, độ phóng đại
1000).
Hình 3.2: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn P. multocida trên môi trường thạch máu..
3.1.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hóa
Để tiến hành xác định 12 chủng nghiên cứu là vi khuẩn P. multocida
chúng tôi tiến hành thử nghiệm đặc tính oxiadase, thử nghiệm các đặc tính sinh hóa trên môi trường 3 ống nghiệm của Lassen, và khả năng lên men một
số loại đường đặc trưng. Kết quả thu được được thể hiện qua một số hình ảnh sau:
1) Các chủng kiểm tra đều cho kết quả dương tính khi tiến hành phản ứng
oxidase, tức là xuất hiện màu xanh dương sau một phút kiểm tra.
Hình 3.3: Phản ứng Oxidase của vi khuẩn P. multocida.
2) Kết quả trên môi trường 3 ống nghiệm của Lassen
3) Hìnhảnh P. multocida tham gia phản ứng O-F.
Kết quả kiểm tra sinh hóa của các chủng vi khuẩn được trình bày trong bảng 3.2:
Bảng 3.2: Kết quả đặc tính sinh hóa của vi khuẩn P. multocida
STT Đặc tính sinh hóa n n+ n- Kết luận
1 Glucose 12 12 0 100% lên men Glucose
2 Lactose 12 0 12 100% không lên men Lactose
3 Mannitol 12 12 0 100% lên men Mannitol
4 Urease 12 0 12 100% không sinh Urease
5 Indol 12 12 0 100% sinh Indol
6 O-F 12 12 0 100% dương tính cả hai ống.
7 Saccharose 12 12 0 100% lên men Saccharide
8 Trehalose 12 0 12 100% không lên men Trehalose
9 Dulcitol 12 0 12 100% lên men Dulcitol
10 L-Arabinose 12 12 0 100% lên men L-Arabinose
11 D-Sorbitol 12 8 4 66,67% lên men Sorbitol
12 Oxidase 12 12 0 100% dương tính.
Ghi chú: n: Tổng số chủng kiểm tra; n+: Số chủng dương tính; n- : Số chủng
âm tính
Nhận xét:
Từ các kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số nhận xét sau: Kết quả phản ứng sinh hóa của 12 chủng vi khuẩn nghiên cứu phù hợp
với kết quả của Carter (1990), và kết quả của Sharah O. Ekundayo
(2008) về vi khuẩn P. multocida: 100% vi khuẩn sử dụng Glucose,
không sử dụng Lactose, không sinh hơi, dương tính với Oxidase, sinh Indol.
Kết quả phản ứng O-F là 100% dương tính ở cả hai ống nghiệm, nghĩa
là chủngP. multocida có khả năng lên men trong cả điều kiện giàu Oxi
và trong điều kiện lượng Oxi rất ít. Vi khuẩn P. multocida là vi khuẩn
hiếu khí tùy tiện.
Từ tất cả kết quả nghiên cứu trên cho phép chúng tôi khẳng định các
chủng vi khuẩn nghiên cứu là P. multocida.
Theo Mutters và cộng sự (1995), có thể xác định các chủng dưới loài do sự khác nhau bởi khả năng lên men các loại đường, đặc biệt là
đường Sorbitol và Dulcitol. Trong đó vi khuẩn P.multocida multocida
âm tính với đường Dulcitol, dương tính với đường Sorbitol;
P.multocida septica âm tính với cả Dulcitol và Sorbitol; P.multocida
gallicida dương tính với cả Dulcitol và Sorbitol. Theo nghiên cứu của
Sarah O. Ekundayo (2008), khả năng sinh Indol cũng là một tiêu chuẩn để phân biệt các chủng dưới loài: Tất cả các chủng thuộc P. multocida
multocida và P.multocida septica cho kết quả dương tính với Indol,
các chủngP.multocida gallicida không sinh Indol.
Từ những cơ sở trên chúng tôi nhận định về kết qủa thí nghiệm như
sau: có 66,67% chủng lên men đường D-Sorbitol, thuộc P.multocdia
multocida. 33,33% chủng thuộc P.multocida septica. Kết quả 66,67%
chủng thuộc P.multocida multocida thu được trên nhiều đối tượng nghiên cứu: trâu, bò, dê, cừu, lợn. Như vậy chủng P.multocida
multocida gây bệnh trên nhiều đối tượng. Kết quả này phù hợp với
3.2. Phản ứng PCR
Sau khi tiến hành tách chiết DNA từ 12 chủng vi khuẩn nghiên cứu,
tiến hành chạy PCR nhằm xác định KMT1 đặc trưng của vi khuẩn P.
multocida, kết quả cho thấy tất cả các chủng đều cho hình ảnh PCR đặc hiệu
của cặp mồi KMT1SP6-KMT1T7 (theo thiết kế của Towsend và cộng sự,
1998).
Cặp mồi được thiết kế nhằm khuếch đại đoạn gene mong muốn cho kết
quả điện di như sau:
Hình 3.5: Kết quả PCR xác định vi khuẩnP.multocida.
Nhận xét:
Theo Towsend và cộng sự (2001), cặp mồi KMT1SP6-KMT1T7 có thể
khuếch đại các đoạn gene đặc hiệu tách chiết từ các chủng P. multocida
(P.multocida multocida, P.multocida gallicida, P.multocida septica), và cả
chủngP. canis type sinh học2 (một chủng được phân lập từ bệnh viêm phổi ở
N: đối chứng âm; M: marker; 1: đối chứng dương
bê, nghé). Khi so sánh trình tự rRNA 16S có thể phân biệt được hai chủng
này. Loài vi khuẩn P. canis mới chỉ được tìm thấy ở các trường hợp viêm phổi trâu, bò và lợn. Chính vì vậy nếu vi khuẩn phân lập từ các trường hợp
gia súc, gia cầm mắc bệnh tụ huyết trùng thì phương pháp sinh học phân tử (trong đó sử dụng cặp mồi KMT1SP6-KMT1T7) vẫn được coi là chính xác,
nhanh, có độ đặc hiệu cao, và dễ tiến hành.
Trong quá trình phòng và điều trị bệnh, phát hiện gia súc gia cầm bị
bệnh sớm đóng vai trò quan trọng, để từ đó đưa ra hướng xử lý kịp thời nhằm
giảm thiểu thiệt hại.
Theo nhiều tác giả nghiên cứu, trường hợp bệnh tụ huyết trùng do vi
khuẩnP. multocidaở gà xảy ra nhanh, con vật có thể chết mà không xuất hiện
triệu chứng lâm sàng, giữa các con vật trong cùng một đàn và giữa các đàn có thể lây lan và bùng phát thành dịch bệnh. Vì vậy chẩn đoán bệnh nhanh và hiệu quả là cần thiết. Phương pháp PCR có thể đáp ứng yêu cầu của chúng ta.
Từ kết quả điện di, chúng tôi khẳng định các chủng nghiên cứu là vi
khuẩnP. multocida.
3.3. Xác định typecủavi khuẩnP. multocida
Carter (1955)[7], sử dụng phương pháp ngưng kết hồng cầu gián tiếp đãđịnh type vi khuẩn P. multocida gồm type A, type B, type D, type E (riêng type F thì do Rimler và Rhoades, 1987). Tuy nhiên, ngày nay với sự phát triển
của khoa học kỹ thuật, chúng tôi tiến hành định type vi khuẩn bằng kỹ thuật
PCR cho kết quả nhanh, độ đặc hiệu cao, các thao tác đơn giản.
Tất cả các chủng đều được tiến hành chạy PCR để định type, Kết quả
thể hiện trong bảng 4:
Kết quả của chúng tôi ở bảng 4 cho thấy:
Cặp mồi CAPA-FWD, CAPA-REV được thiết kế để khuếch đại đoạn gene đặc hiệu cho type A của vi khuẩn P. multocida (Kirsty. M.
Townsend và cộng sự, 2001). Theo kết quả điện di, có 33,33% chủng
cho hình ảnh đặc hiệu của phản ứng PCR và khuếch đại đoạn gene
khoảng 1044 bp, kết quả xác định được phù hợp với đoạn gene mà Townsend thiết kế. Các chủng này đều được phân lập từ gà mắc bệnh
tụ huyết trùng.
67,67% chủng cho hình ảnh đặc hiệu PCR với các chủng P. multocida
thuộc type B, gây bệnh tụ huyết trùng ở trâu, bò. Sản phẩm PCR khi
dùng cặp mồi CAPB-FWD, CAPB-REV khoảng 760 bp, phù hợp với
chiều dài đoạn gene mà Townsend thiết kế. Các chủng này đều được
phân lập từ trâu, bò, dê, cừu và lợn mắc bệnh tụ huyết trùng.
Kết quả định type bằng kỹ thuật PCR cũng phù hợp với kết quả sinh
hóa: các chủng phân lập từ gà cho vỏ nhầy, ướt đều cho hìnhảnh PCR đặc hiệu thuộc type A.
Không có chủng vi khuẩn cho hìnhảnh đặc hiệu PCR của P. multocida
type D.
Bảng3.3: Kết quả định type vi khuẩnP. multocida bằng kỹ thuật PCR
STT Type vi khuẩn Tổng số chủng kiểm tra Số chủng dương tính Tỷ lệ dương tính 1 A 12 4 33,33% 2 B 12 8 67,67% 3 D 12 0 0%
Hình 3.6: Kết quả đọc điện di gene mã hóa cho type A, type B của vi khuẩnP. multocida.
Nhận xét:
Theo nhiều tác giả, các type huyết thanh của vi khuẩn khác nhau gây
bệnh khác nhau ở động vật: Type A thường gây bệnh tụ huyết trùng ở gà và viêm phổi ở lợn, trâu, bò (đặc biệt là bê nghé); type B thường gây bệnh tụ
huyết trùngở trâu, bò, dê, cừu, lợn. Và type D gây bệnh viêm teo mũi ở lợn.
N M P1 P2 1 2 3 4 5 6 7
1044bp 760bp
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu đạt được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
- Tất cả 12 chủng vi khuẩn được giám định bằng các phản ứng sinh hóa
truyền thống đềulà P. multocida.
- Tất cả 12 chủng đều được phát hiện gen KMT1 đặc trưng của P.
multocida bằng phản ứng PCR.
- Có 33,33% chủng thuộc type A, các chủng này đều phân lập từ gà mắc bệnh tụ huyết trùng.
- Có 67,67% chủng thuộc type B, các chủng này đều phân lập từ trâu, bò, dê, cừu và lợn mắc bệnh tụ huyết trùng.
- Chưaphát hiện đượcchủng vi khuẩnP. multocida thuộc type D.
2. Đề nghị.
Tiếp tục nghiên cứu đặc tính các vi khuẩn P. multocida để đưa ra
những kết luận khoa học chắc chắn về sự khác biệt giữa các chủng vi
khuẩn có nguồn gốc khác nhau (phân lập từ trâu bò, lợn, gà, dê, cừu…).
Tiếp tục xác định vi khuẩn P. multocida type D về khả năng gây bệnh
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Trần Xuân Hạnh, K. M. Towsend, Ian Wlkie, Alan J. Frost, Tô Thị
Phấn, Nguyễn Tiến Trung(2002),”Giám định vi khuẩn Pasteurella
multocida serotype B:2 bằng kỹ thuật PCR”,Tạp chí KHKT Thú y, Tập
IX. Số 3-2002, tr.12-17.
2. Trần Linh Thước(2007),Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước,
thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Giáo dục, tr. 94-110.
3. Trương Văn Dung, Hoàng Xuân Nghinh, Nguyễn Thị Khanh, Nguyễn
Lại Hoàn, Đỗ Tuấn Cương, Đặng Vũ Hoàng và cộng sự(1998), Nghiên
cứu đặc tính và định type huyết thanh học vi khuẩn tụ huyết trùng ở
trâu bò phân lập được ở một số tỉnh phía Bắc, Báo cáo Khoa học Chăn
nuôi– Thú y 1998-2001, Nhà xuất bản Nông nghiệp I Hà Nội, tr.32-37.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương(1997), Sinh học phân tử, NXB Giáo dục thành phố Hồ Chí Minh.
5. Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan(2002), Cơ sở di truyền và công nghệ
gen, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr.157-171.
6. Nguyễn Bá Hiên(2005), Giáo trình vi sinh vật truyền nhiễm, trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội.
Tiếng Anh
7. Bain, R.V.S, M.C.L. De Alwis, G.R. Carter, and B.K. Gupta (1982),
FAO, Animal Production Health, p.13-14.
8. Bisgaard, M. Houghton, Mutters, R. Stenzel, 1991, A. Reclassification
of German, British and Dutch isolates oF so-called Pasteurella mutocida obtained from pneumonic calf lungs. Vet Microbiol.
9. Carter, G.R. (1955), “Studies on Pasteurella multocida. A haemagglutination test for the identification of serologycal types”,
American Journal of Veterinary Research, p.479-481.
10. Carter, G. R(1967), Pasteurellosis: Pasteurella multocida and
Pasteurella haemolytica, Adv. Vet. Sci. p.321-379.
11. Dabo, S.M, A.W. Cofer, and G.L. Murphy (1997), “Outer membrain
proteins of bovine Pasteurella multocida Serogroups A Isolates”,
Veterinary Microbiology, p.167-183.
12.David Hendricks Bergey, John G. Holt, 1994, Bergey’s mannual of
determinative bacteriolog, xuất bản bởi Lippincott Williams and
Wilkins, p.375-378.
13.David Straus, William L. Jolley and Charles W. Purdy(1996),
“Characterization of Neuraminidases Produced by Various Serotypes of
Pasteurella multocida”, Infection and Immunity, p.1446-1449.
14. Glen C. Weiser, Walter J. De Long, Julia L. Paz, Bahman Shafii, William J. Price, and Alton C. S. Ward(2003), “Characterization of
Pasteurella multocida Associated with pneumonia in bighorn sheep”,
Journal of Wildlife Diseases, p.536-544.
15.Hagan and Brunner(1988), Hagan and Brunner’s Microbiology and
Infetiouse Disease of Domestic Animals, Cornell University, p.104-109.
16. Hudson, J.R. (1954), “Typing oF strains of Pasteurella Septica and a
note on a living attenuated vaccine”, Bulletin of International Epizootics, p.267-277.
17. Kayoko Ishiguro, Takashi Kitajima, Sei Kubota, Katsuhiko Amimoto, Kenji ODA, Shinichi Fukuyama and Yukio Shimizu(2005),
“Experimental Infection of Calves with Pasteurella multocida Serovar A:3 Isolated in Japan”, J. Vet. Med. Sci, p.817-819.
18.Kirsty M. Towsend, John D. Boyce, Jing Y. Chung, Alan J. Frost, and Ben Adler (2000), “Genetic Organization of Pasteurella multocida cap
Loci and Development of a Multiplex Capsular PCR Typing System”,
J. Clin. Microbiology, p.924-929.
19.Kirsty M. Towsend, Alan J. Frost, Chiang W. Lee, Jonhn M.
papadimitriou, and Hugh J.S. Dawkins(1998), “Development of PCR
Assays for Species and Type – Specific Identification of Pasteurella
multocida Isolates”, J. Clin. Microbiology, p.1096-1100.
20. M. Numan, M. Iqbal, K. Aqil, M. Habib and M.S. Yousaf (2008),
“Polypeptide Mapping oF Different Isolates of Pasteurella multocida
Bovine Origin”,J. Vet. Anim. Sci, vol 1, p.37-39
21. Mutters R, Ihm P, Pohl S, Frederiksen W, Mannheim W(1985),
Reclassification of the genus Pasteurella Trevisan 1887 on the basis of
deoxyribonucleic acid homology, with proposals for the new species
Pasteurella dagmatis, Pasteurella canis, Pasteurella stomatis, Pasteurella anatis, and Pasteurella langaa. Int. J. Syst. Bacteriol,
p.309-322.
22. Rhoades K.R., Rimler R.B. (1987), "Capsular groups of Pasteurella multocida isolated from avian hosts– Avian Diseases, p.895-898. 23. Rosenbusch, C. T., and I. A. Merchant(1939), A stydy of the
hemorrhagic septicemia Pasteurella, Journal of Bacteriology, p.69-89. 24.Sarah O. Ekundayo, Moses O. Odugbo, Atanda O. Olabode and Philip
A. Okewole(2008), “Phenotypic variability among strains of
Pasteurella multocida isolated from avian, bovine, caprine, leporine
and ovine origin”, African Journal of Biotechnology Vol.7, p.1347-
25.Quinn P.J, Carter M.E, Markey B. DNA Carter G. R(1994), Pasteurella
multocida, Clinical verternary microbiolog,Wolfe Publishing, Mosby –
Year Book Europe Limited, London, p.254-258.
26.Waheed ullah, Muhammad Abubakar, Muhammad Javed Arshed, Syed Muhammad Jamal, Najma Ayub and Qurban Ali(2009), Differentation
of closely related Vaccinal Strains of Pasteurella mutocida using
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Các trang web tham khảo:
27.www.aciar.gov.au/system/files/node/2144/MNO57 + part + 2.pdf. 28.www.Pfizeranimalhealth.com.au/diseases/125/pneumonia---bovine-
respiratory disease-brd.apsx.
29.www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=414577. 30.Priory.com/vet/pasteurella.htm.
PHỤ LỤC
Môi trường nuôi cấy
Môi trường BHI broth (Brain Heart Infusion):
Brain Heart Infusion From (Solids) : 6,0g Peptic Digest of animal Tissue : 6,0g
Sodium chloride : 5,0g
Dextrose : 3,0g
Pancreatic Digest of Gelatin :14,5g
Disodium Phosphate : 2,5g
Môi trường thạch máu (1000ml)
Môi trường BHI dạng bột : 37 g