Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống
1
/ 20 trang
THÔNG TIN TÀI LIỆU
Nội dung
- 1 -
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuẩn đoánvi khuẩn Pasteurella
multocida bằngkỹthuật gen.
Giáo viên phụ trách: TS. Nguyễn Ngọc Hải.
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Tuyến.
MSSV: 06126179
Khoa: Công Nghệ Sinh Học
- 2 -
I. ĐẶT VẤN ĐỀ.
Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở
mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với
các ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh.
Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các
hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại
giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách
thức điều hòa các mối tương tác này.
Sinh học phân tử là một bộ môn khoa học còn rất non trẻ nhưng đã
có nhiều bước tiến vượt bậc và tác động toàn diện đến nhiều ngành
khoa học, đến sản xuất và đời sống.
Ngành kinh tế chăn nuôi hiện nay đang gặp nhiều nguy cơ đe dọa
quá trình phát triển. Trong đó, dịch bệnh đã ảnh hưởng rất lớn về lợi
nhuận, quá trình sản xuất, tình hình chăn nuôi gia cầm trên thế giới.
Vì vậy, việc ứng dụng những kỹthuật sinh học phân tử vào việc
chẩn đoán, điều trị bệnh trên vật nuôi hiện nay là một tất yếu.
Ngày 02 tháng 10 năm 2009.
- 3 -
II. TỔNG QUAN.
II.1. Bệnh tụ huyết trùng.
Tụ huyết trùng là bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do
vi khuẩnPasteurellamultocida gây ra. Bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn huyết. Vi
khuẩn tấn công vào cơ quan tiêu hoá, các hạch và nhất là cơ quan hô hấp. Bệnh
lưu hành ở từng địa phương, hoặc thành dịch lớn ở trâu, bò, dê, cừu, thỏ, gia
cầm. Bệnh ở gia cầm còn gọi là hoắc loạn gà. Bệnh ở trâu, bò, lợn còn gọi là
nhiễ
m khuẩn huyết xuất huyết. Bệnh ở trâu còn gọi là bacbon (barbone). Bệnh
thường xảy ra khi thời tiết thay đổi, thường phát vào mùa nóng ẩm ở những vùng
ẩm thấp, cơ thể thú nuôi giảm sức đề kháng, bệnh thường lây qua đường hô hấp,
tiêu hoá, vết thương ngoài da hoặc tiếp xúc với nguồn bệnh.
II.2. Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng.
II.2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới.
Năm 1875, Bollinger là người đầu tiên phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở
bò tại Đức.
Năm 1879, Tousain phát hiên bệnh tụ huyết trùng ở gà.
Gà bị bệnh do vikhuẩn Pasteurell amultocida
- 4 -
Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp đã phát hiện được
vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà (Fowl cholera)
Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và đặt tên là bệnh bại huyết
(Septicaemia disease).
Năm 1886, Loeffer phát hiện bệnh ở lợn.
Hueppe, nhà giải phẫu bệnh lý học người Đức phát hiện thấy sự tương
đồng về triệu chứng, bệnh tích ở gà, bò và thỏ mắc bệnh tụ huyết trùng.
Năm 1887, Oroste và Armani phát hiện ra bệnh ở trâu và đặt tên là
Barbone.
Bò chết do bệnh tụ huyết trùng.
Trevissan đã đề nghị đặt tên chung cho nhóm vikhuẩn gây bệnh tụ huyết
trùng là Pasteurella để tưởng nhớ đến nhà bác học Louis Pasteur, người đầu tiên
phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở gà. Từ đó người ta căn cứ vào đặc tính sinh
bệnh của từng loài vất, chia Pasteurella thành các loài khác nhau:
Pasteurella gây bệnh cho bò là: P. boviseptica
Pasteurella gây bệnh cho trâu là: P. bubaliseptica
Pasteurella gây bệnh cho lợn là: P. suiseptica
Pasteurella gây bệnh cho gia cầm là: P. aviseptica
N
ăm 1939, Rosenbusch và Merchant đã đề nghị đặt tên chung cho vikhuẩn
gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurellamultocida để thể hiện khả năng gây bệnh
cho nhiều loài vật của vikhuẩn này.
- 5 -
Vi khuẩnPasteurellamultocida dưới kính hiển vi.
II.2.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Viêt Nam.
Ở Việt Nam, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò được phát hiện lần đầu tiên năm
1798. Từ đó, bệnh được thấy ở khắp các vùng trong nước.
Năm 1994, Dương Thế Long đánh giá hiệu quả những biện pháp phòng trị
bệnh tụ huyết trùng ở Sơn La trong giai đoạn 1990-1993, khảng định: tiêm
phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu.
Tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng
hàng đầu.
Năm 1995, Nguyễn Ngã nghiên cứu tính kháng nguyên và độc lực vikhuẩn
gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở khu vực miền trung nhằm chọn giống vikhuẩn
- 6 -
địa phương thích hợp có khả năng kết hợp với giống vikhuẩn nước ngoài để chế
tạo vắc-xin có hiệu lực cao.
Năm 1996, Hoàng Đạo Phấn nghiên cứu tác động của thực khuẩn thể đặc
hiệu đối với khuẩnPasteurellamultocida phân lập từ gia súc gia cầm.
Năm 1996, Nguyễn Thu Thiên và Nguyễn Ngã đã phân lập và xác định các
type huyết thanh Pasteurellamultocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam.
Nă
m 2000, Đinh Duy Kháng và Lê Văn Phan đã ứng dụng kỹthuật PCR để
định type vikhuẩnPasteurellamultocida phân lập ở miền trung Việt Nam. HB1,
HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi được dung để xác định Pasteurellamultocida
gây bại huyết, xuất huyết.
II.3. VikhuẩnPasteurella multocida.
II.3.1. Đặc tính sinh vật học của vikhuẩnPasteurella multocida.
VikhuẩnPasteurella nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ
Parvobacteriaceae, thuộc giống Pasteurella và chia làm ba loài, trong đó có loài
gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida và
Pasteurella haemolytica.
II.3.2. Đặc tính hình thái của vikhuẩnPasteurella multocida.
Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ, có kích thức 0,25 -0,4 ×
0,4 -1,5 μm. Vikhuẩn có giáp mô, không sinh nha bào, không lông, không di
động.
Trong canh khuẩn thường thấy vikhuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ
hoặc thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già, vikhuẩn suy yếu, biến dạng, thay
đổi hình thái như hình gậy, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường, có
khi dài 2-3 μm hay hơn nữa.
Vi khuẩnPasteurellamultocida
- 7 -
II.3.3. Tính bắt màu của vikhuẩnPasteurella multocida.
Pasteurellamultocida bắt màu Gram âm với thuốc nhuộm gram, vikhuẩn
thường dễ bắt màu với thuốc nhuộm aniline, tốt nhất là Methylen blue, đỏ
Fucsin, có thể thấy khi dùng phương pháp nhuộm Giemsa và Wright. Các chủng
có hình thành giáp mô thì có thể dùng phương pháp nhuộm Hiss và Zilnelson.
Trong cơ thể gia súc mắc bệnh (máu và phủ tạng) và trong môi trường mới
nuôi cấy, vikhuẩnPasteurella khi nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai
đầu, còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt h
ơn so với hai đầu, nên người
ta gọi Pasteurella là vikhuẩn lưỡng cực. Năm 1919, Manninger giải thích tính
lưỡng cực của vikhuẩn là do tế bào vikhuẩn đang trong giai đoạn phân chia, vi
khuẩn tăng lên về kích thước, độc lực và nguyên sinh chất, khi đó nguyên sinh
chất dung giải dồn về hai đầu của tế bào.
II.3.4. Đặc tính sinh hóa của vikhuẩnPasteurella multocida.
Đặc tính sinh hóa của vikhuẩnPasteurellamultocida đã được các nhà
nghiên cứu khảo sát dựa trên nguyên lý: vikhuẩn là một tế bào sống nên khi
được nuôi trong các môi trường dinh dưỡng, quá trình trao đổi chất diễn ra trong
tế bào vikhuẩn sẽ tạo ra các sản phẩm có thể làm thay đổi pH của môi trường.
Khi đó dựa vào các chất chỉ thị màu thì người ta có thể xác định đặc tính sinh
hóa của chúng.
- 8 -
II.3.5. Đặc tính kháng nguyên của vikhuẩnPasteurella multocida.
Đặc tính kháng nguyên của Pasteurellamultocida rất phức tạp và cấu trúc
từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Kháng nguyên của Pasteurella
multocida có 2 loại chính là kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên thân O. Việc
tìm hiểu cấu trúc kháng nguyên của vikhuẩnPasteurellamultocida có vai trò rất
quan trọng không những trong phân loại vikhuẩnPasteurellamultocida mà cả
trong nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch của chúng và khả năng chế tạo vắc-xin
phòng bệnh. Một vắc-xin có hiệu lực tốt phải bao gồm các kháng nguyên t
ương
ứng với các serotype của các chủng phân lập được trong từng vùng hay khu vực.
Pasteurellamultocida có tính kháng nguyên giao hỗ (tương đồng kháng
nguyên) tức là có khả năng miễn dịch chéo giũa các chủng, tính chất này nhiều
hay ít phụ thuộc vào từng chủng.
II.3.5.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen).
Kháng nguyên vỏ K bao xung quanh thân vi khuẩn, che chở cho kháng
nguyên O khỏi bị thực bào tác động. Đồng thời kháng nguyên K ngăn cản sự tiếp
xúc giữa kháng nguyên O với kháng thể O. Do đó, muốn phát hiện kháng
nguyên O phải phá hủy kháng nguyên K.
Kháng nguyên K chỉ có ở vikhuẩn P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S,
không có ở vikhuẩn tạo khuẩn lạc dạng nhầy (M) và xù xì (R). Có 5 type kháng
nguyên thân là A, B, D, E và F
II.3.5.2. Kháng nguyên thân O (Somatic antigen).
Kháng nguyên O có hai nhóm, đặc hiệu và không đặc hiệu. Các chủng vi
khuẩn khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên O. Chỉ có serotype B là hầu như
đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên O.
Kháng nguyên O có hai hệ thống phân loại:
+ Phân loại của Namioka và Murata (1961) kháng nguyên O có 12 yếu tố.
+ Phân loại của Heddleston (1972) kháng nguyên O có 16 yếu tố, được
đánh dấu từ 1-16.
Do tầm quan trọng của vikhuẩnPasteurellamultocida trong bệnh học thú
y, người ta đã giải trình tự và xác định được 104 gene có liên quan đến kh
ả năng
gây bệnh của Pasteurella multocida, chiếm khoảng 7% bộ gene. Đại diện trong
số đó là nhóm gene pfh (Pasteurella filamentous hemagglutinin, pfh). Nhóm
- 9 -
gene này có kích thước 24 kb, bao gồm 2 gene liên quan đến khả năng gây bệnh
của Pasteurellamultocida đó là gene pfhB1 (tổng hợp protein 2615aa) và pfhB2
(3919aa). Nhóm gene này có những đặc điểm quan trọng sau:
- Đầu amino của 2 gene pfhB1 và pfhB2 theo mô hình N(P/Q)NG(I/M),
mô hình này liên quan đến tiến trình tiền phiên mả va tính hiệu ngoại
bào.
- Vùng trung tâm có chứa một vùng quy định khà năng bám dính của vi
khuẩn vào bề mặt của tế bào. Điều này giúp vikhuẩn có thể tấn công vô
tế bào và gây bệnh cho vật chủ.
-
Đầu carboxy chứa vùng có cấu trúc tương tự như protein kháng huyết
thanh p76 của Haemophilus somnus (có 66% amino acid tương tự). Khả
năng này giúp cho Pasteurellamultocida tăng khả năng sống sót trong
cơ thể vật chủ từ đó tăng cường khả năng gây bệnh của vi khuẩn.
II.3.5.3. Xác định type kháng nguyên của vikhuẩnPasteurella
multocida.
VikhuẩnPasteurellamultocida mọc dễ dàng trên các môi trường nhân tạo
vì vậy việc chuẩn đoánvikhuẩn không có khó khăn gì đặc biệt. Tuy nhiên để
xác định chính xác type kháng nguyên của vikhuẩn đó thì lại khá phức tạp khi
sử dụng các kỹthuật thông thường.
Việc xác định type kháng nguyên của vikhuẩnPasteurellamultocida chủ
yếu được thực hiện bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính, ng
ưng
kết trong ống nghiệm, kỹthuật kết tủa khuếch tán trên thạch (agar gel
precipitation test, AGP) và bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu.
Ngày nay, việc giám định vikhuẩn có thể được thực hiện nhờ sự trợ giúp
của các kỹthuật phân tử như: kỹthuật PCR, kỹthuật RT-PCR, kỹthuật phân
tích thành phần protein của vikhuẩn trên bản gel…
III. PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU.
III.1. Giám định vikhuẩnPasteurellamultocida serotype B
bằng kỹthuật PCR.
Trong quy trình chuẩn đoán này người ta sử dụng 2 cặp mồi.
- Cặp mồi HSB
- 10 -
KTT72 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’
KTSP61 5’-ATCCGCTAACACTCTC-3’
(Townsend và cs., 1998)
- Cặp mồi B capsule type (CAPB)
CAPB-FWD 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’
CAPB-REV 5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’
(Townsend và cs., 2001)
Với 2 cặp mồi HSB và CAPB sản phẩm DNA tương ứng được tạo ra có kích
thước tương ứng là 620 bp và 720 bp (Townsend và cs., 2001). Với cặp mồi
HSB có thể nhận diện được hầu hết các chủng vikhuẩnPasteurella multocida,
trong đó cặp mồi CAPB cho phép phân biệt các chủng Pasteurellamultocida
serotype B (B:2, B:5, B:2,5). Ngoài ra để xác định vikhuẩnPasteurella
multocida serotype D người ta sử dụng cặp mồi CAPD (
đặc hiệu cho vikhuẩn P.
multocida serogroup D) (Townsend và cs., 2001). Do các chủng Pasteurella
multocida có thể dương tính cùng lúc với cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB và
CAPD, nên để xác định vikhuẩnPasteurellamultocida serotype B hoặc
serotype D cần thiết phải sử dụng đồng thời 2 cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB
và CAPD.
Kết quả PCR có tính chính xác cao và rất nhanh chóng, vì thế có thể sử dụng
chúng trong chuẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ bệnh do Pasteurellamultocida
trên gia súc gia cầm.
III.2. Xác định serotype vikhuẩnPasteurellamultocida
bằng phương pháp nested-PCR.
Trong phương pháp này người ta sử dụng 2 cặp mồi: cặp mồi chung cho
loài và cặp mồi riêng cho vùng mã hóa chuyên biệt của một serotype nào đó. Cặp
[...]... tụ huyết trùng ở Vi t Nam 7 II.3 VikhuẩnPasteurellamultocida 8 II.3.1 Đặc tính sinh vật học của vikhuẩnPasteurellamultocida 8 II.3.2 Đặc tính hình thái của vikhuẩnPasteurellamultocida 8 II.3.3 Tính bắt màu của vikhuẩnPasteurellamultocida 9 II.3.4 Đặc tính sinh hóa của vikhuẩnPasteurellamultocida 9 II.3.5 Đặc tính kháng nguyên của vikhuẩnPasteurellamultocida 10 II.3.5.1... II.3.5.1 Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen) 10 II.3.5.2 Kháng nguyên thân O (Somatic antigen) 10 II.3.5.3 Xác định type kháng nguyên của vikhuẩnPasteurellamultocida 11 III PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU III.1 Giám định vikhuẩnPasteurellamultocida serotype B bằngkỹthuật PCR 11 - 19 - III.2 Xác định serotype vikhuẩnPasteurellamultocidabằng phương pháp nested-PCR ... trước khi kỹthuật này có thể được đặt để sử dụng thường lệ - 16 - IV KẾT LUẬN Bệnh tụ huyết trùng là một bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do vikhuẩnPasteurellamultocida gây ra Bệnh gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế chăn nuôi trên toàn thế giới Ngày nay với kỹthuật sinh học phân tử hiện đại, đặc biệt là kỹthuật gene đang rất phát triển thì chuẩn đoánvikhuẩn Pasteurella multocida. .. của vi khuẩnVi c phân tích thành phần protein của vikhuẩn được thực hiện trên gel SDS-PAGE Các chủng vikhuẩn được pha thành dung dịch huyền phù có nồng độ khoảng 5x109 cfu/ml, trộn với dung dịch đệm 15% β-mecapthoethanol Điện di protein vikhuẩn P multocida trên thạch Polyacrylamide 10% Cột 1 và 8: Trọng lượng protein chuẩn Cột 1 đến 7: Dịch chiết protein các chủng vikhuẩnPasteurellamultocidaVi c... theo tác giả thì những chủng Pasteurellamultocida có lớp protein màng ngoài thuộc loại I sẽ có thể là chủng gây bệnh Trong khi đó nếu thuộc loại II thì sẽ có thể là những chủng không gây bệnh III.4 Sử dụng kỹthuật PCR-RFLP trong vi c chuẩn đoán phân biệt Pasteurellamultocida serotype A:1, A:3, B:2 Đây là sự kết hợp giữa kỹthuật PCR và kỹthuật cắt phân đoạn đa hình RFLP Kỹthuật PCR-Restriction Fragment... cô lập được Kỹthuật gene dựa cho sự khác biệt về nucleic acid của serotypes có thể thay thế cho các kỹthuật thông thường Một kỹthuật PCR-REA (Polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis) đã được chuẩn hóa để phân biệt Pasteurellamultocida serotype A: 1, A: 3 và B: 2 Vật liệu và phương pháp: Pasteurellamultocida chủng DP1 và FP1 cô lập tại Kerala, Ấn Độ serotyped là A: 1 do Vi n Nghiên... là một kỹthuật mà trong đó trình tự ADN biến thể được xác định bằng cách khuếch đại thông qua kỹthuật PCR Tiếp theo đó sản phẩm của quá trình PCR sẽ được phân cắt bởi một endonuclease hạn chế Các phân đoạn DNA khác nhau về kích thước và sẽ được phân tách trên gel agarose / gel acrylamide .Vi c phân biệt được các serotype Pasteurellamultocida dựa trên sự khác biệt nucleic acid của các serotype Pasteurella. .. với Dra I cung cấp một kỹthuật lý thuyết cho sự khác biệt giữa các serotype của Pasteurellamultocida Nếu mô hình duy nhất cho tất cả các serotypes có thể được xác định một cách tương tự thì chúng ta có thể có một kỹthuật serotyping đơn giản, nhanh chóng và có thể được thực hiện trong bất kỳ phòng thí nghiệm có năng lực để thực hiện PCR Sự phát triển của ADN dựa trên một kỹthuật cho biết sự khác... Pasteurellamultocida Kiến thức về serotype của Pasteurellamultocida tham gia vào một ổ dịch là điều rất cần thiết để tạo nên các biện pháp kiểm soát hiệu quả Đặc tính kháng nguyên của Pasteurellamultocida được thực hiện bởi serogrouping capsular và serotyping soma Tuy nhiên những kỹthuật này lại được thực hiện bởi các phòng thí nghiệm tham khảo Điều này thường dẫn đến sự chậm trễ trong vi c xác định... đại, đặc biệt là kỹthuật gene đang rất phát triển thì chuẩn đoánvikhuẩn Pasteurella multocida (tác nhân gây bệnh tụ cầu huyết) đã không còn là khó khăn nữa Một số kỹthuật gene điển hình được sử dụng trong chuẩn đoánvikhuẩn Pasteurella multocida: - PCR (Polymerase Chain Reaction) - nested-PCR - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism) . nguyên của vi khuẩn Pasteurella
multocida.
Vi khuẩn Pasteurella multocida mọc dễ dàng trên các môi trường nhân tạo
vì vậy vi c chuẩn đoán vi khuẩn không. của vi khuẩn Pasteurella multocida 8
II.3.3. Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida 9
II.3.4. Đặc tính sinh hóa c
ủa vi khuẩn Pasteurella multocida