Tụ huyết trùng là bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra.. Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp đã phát hiện được vi
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella
multocida bằng kỹ thuật gen
Giáo viên phụ trách: TS Nguyễn Ngọc Hải
Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Tuyến
Khoa: Công Nghệ Sinh Học
Trang 2I ĐẶT VẤN ĐỀ
Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với các ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các
hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này
Sinh học phân tử là một bộ môn khoa học còn rất non trẻ nhưng đã
có nhiều bước tiến vượt bậc và tác động toàn diện đến nhiều ngành khoa học, đến sản xuất và đời sống
Ngành kinh tế chăn nuôi hiện nay đang gặp nhiều nguy cơ đe dọa quá trình phát triển Trong đó, dịch bệnh đã ảnh hưởng rất lớn về lợi nhuận, quá trình sản xuất, tình hình chăn nuôi gia cầm trên thế giới
Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh trên vật nuôi hiện nay là một tất yếu
Trang 3II TỔNG QUAN
II.1 Bệnh tụ huyết trùng
Tụ huyết trùng là bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do
vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra Bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn huyết Vi
khuẩn tấn công vào cơ quan tiêu hoá, các hạch và nhất là cơ quan hô hấp Bệnh lưu hành ở từng địa phương, hoặc thành dịch lớn ở trâu, bò, dê, cừu, thỏ, gia cầm Bệnh ở gia cầm còn gọi là hoắc loạn gà Bệnh ở trâu, bò, lợn còn gọi là nhiễm khuẩn huyết xuất huyết Bệnh ở trâu còn gọi là bacbon (barbone) Bệnh thường xảy ra khi thời tiết thay đổi, thường phát vào mùa nóng ẩm ở những vùng
ẩm thấp, cơ thể thú nuôi giảm sức đề kháng, bệnh thường lây qua đường hô hấp, tiêu hoá, vết thương ngoài da hoặc tiếp xúc với nguồn bệnh
II.2 Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng
II.2.1 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới
Năm 1875, Bollinger là người đầu tiên phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở
bò tại Đức
Năm 1879, Tousain phát hiên bệnh tụ huyết trùng ở gà
Gà bị bệnh do vi khuẩn Pasteurell amultocida
Trang 4Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp đã phát hiện được
vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà (Fowl cholera)
Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và đặt tên là bệnh bại huyết
(Septicaemia disease)
Năm 1886, Loeffer phát hiện bệnh ở lợn
Hueppe, nhà giải phẫu bệnh lý học người Đức phát hiện thấy sự tương đồng về triệu chứng, bệnh tích ở gà, bò và thỏ mắc bệnh tụ huyết trùng
Năm 1887, Oroste và Armani phát hiện ra bệnh ở trâu và đặt tên là
Barbone
Bò chết do bệnh tụ huyết trùng
trùng là Pasteurella để tưởng nhớ đến nhà bác học Louis Pasteur, người đầu tiên
phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở gà Từ đó người ta căn cứ vào đặc tính sinh
bệnh của từng loài vất, chia Pasteurella thành các loài khác nhau:
Năm 1939, Rosenbusch và Merchant đã đề nghị đặt tên chung cho vi khuẩn
gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurella multocida để thể hiện khả năng gây bệnh
cho nhiều loài vật của vi khuẩn này
Trang 5Vi khuẩn Pasteurella multocida dưới kính hiển vi
II.2.2 Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Viêt Nam
Ở Việt Nam, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò được phát hiện lần đầu tiên năm
1798 Từ đó, bệnh được thấy ở khắp các vùng trong nước
Năm 1994, Dương Thế Long đánh giá hiệu quả những biện pháp phòng trị bệnh tụ huyết trùng ở Sơn La trong giai đoạn 1990-1993, khảng định: tiêm
phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu
Tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng
hàng đầu
Năm 1995, Nguyễn Ngã nghiên cứu tính kháng nguyên và độc lực vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở khu vực miền trung nhằm chọn giống vi khuẩn
Trang 6địa phương thích hợp có khả năng kết hợp với giống vi khuẩn nước ngoài để chế tạo vắc-xin có hiệu lực cao
Năm 1996, Hoàng Đạo Phấn nghiên cứu tác động của thực khuẩn thể đặc
hiệu đối với khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ gia súc gia cầm
Năm 1996, Nguyễn Thu Thiên và Nguyễn Ngã đã phân lập và xác định các
type huyết thanh Pasteurella multocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam
Năm 2000, Đinh Duy Kháng và Lê Văn Phan đã ứng dụng kỹ thuật PCR để
định type vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập ở miền trung Việt Nam HB1, HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi được dung để xác định Pasteurella multocida
gây bại huyết, xuất huyết
II.3 Vi khuẩn Pasteurella multocida
II.3.1 Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida
Parvobacteriaceae, thuộc giống Pasteurella và chia làm ba loài, trong đó có loài
gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida và
Pasteurella haemolytica
II.3.2 Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida
Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ, có kích thức 0,25 -0,4 ×
0,4 -1,5 μm Vi khuẩn có giáp mô, không sinh nha bào, không lông, không di động
Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Trong canh khuẩn già, vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay đổi hình thái như hình gậy, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường, có khi dài 2-3 μm hay hơn nữa
Vi khuẩn Pasteurella multocida
Trang 7II.3.3 Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida.
Pasteurella multocida bắt màu Gram âm với thuốc nhuộm gram, vi khuẩn
thường dễ bắt màu với thuốc nhuộm aniline, tốt nhất là Methylen blue, đỏ
Fucsin, có thể thấy khi dùng phương pháp nhuộm Giemsa và Wright Các chủng
có hình thành giáp mô thì có thể dùng phương pháp nhuộm Hiss và Zilnelson
nuôi cấy, vi khuẩn Pasteurella khi nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai
đầu, còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai đầu, nên người
ta gọi Pasteurella là vi khuẩn lưỡng cực Năm 1919, Manninger giải thích tính
lưỡng cực của vi khuẩn là do tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn phân chia, vi khuẩn tăng lên về kích thước, độc lực và nguyên sinh chất, khi đó nguyên sinh chất dung giải dồn về hai đầu của tế bào
II.3.4 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida
Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida đã được các nhà
nghiên cứu khảo sát dựa trên nguyên lý: vi khuẩn là một tế bào sống nên khi được nuôi trong các môi trường dinh dưỡng, quá trình trao đổi chất diễn ra trong
tế bào vi khuẩn sẽ tạo ra các sản phẩm có thể làm thay đổi pH của môi trường Khi đó dựa vào các chất chỉ thị màu thì người ta có thể xác định đặc tính sinh hóa của chúng
Trang 8II.3.5 Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida
Đặc tính kháng nguyên của Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi Kháng nguyên của Pasteurella
multocida có 2 loại chính là kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên thân O Việc
tìm hiểu cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida có vai trò rất quan trọng không những trong phân loại vi khuẩn Pasteurella multocida mà cả
trong nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch của chúng và khả năng chế tạo vắc-xin phòng bệnh Một vắc-xin có hiệu lực tốt phải bao gồm các kháng nguyên tương ứng với các serotype của các chủng phân lập được trong từng vùng hay khu vực
Pasteurella multocida có tính kháng nguyên giao hỗ (tương đồng kháng
nguyên) tức là có khả năng miễn dịch chéo giũa các chủng, tính chất này nhiều hay ít phụ thuộc vào từng chủng
II.3.5.1 Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen)
nguyên O khỏi bị thực bào tác động Đồng thời kháng nguyên K ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O với kháng thể O Do đó, muốn phát hiện kháng
nguyên O phải phá hủy kháng nguyên K
Kháng nguyên K chỉ có ở vi khuẩn P multocida tạo khuẩn lạc dạng S,
không có ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng nhầy (M) và xù xì (R) Có 5 type kháng nguyên thân là A, B, D, E và F
Kháng nguyên O có hai nhóm, đặc hiệu và không đặc hiệu Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên O Chỉ có serotype B là hầu như đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên O
Kháng nguyên O có hai hệ thống phân loại:
+ Phân loại của Namioka và Murata (1961) kháng nguyên O có 12 yếu tố + Phân loại của Heddleston (1972) kháng nguyên O có 16 yếu tố, được đánh dấu từ 1-16
y, người ta đã giải trình tự và xác định được 104 gene có liên quan đến khả năng
gây bệnh của Pasteurella multocida, chiếm khoảng 7% bộ gene Đại diện trong
số đó là nhóm gene pfh (Pasteurella filamentous hemagglutinin, pfh) Nhóm
Trang 9gene này có kích thước 24 kb, bao gồm 2 gene liên quan đến khả năng gây bệnh
của Pasteurella multocida đó là gene pfhB1 (tổng hợp protein 2615aa) và pfhB2
(3919aa) Nhóm gene này có những đặc điểm quan trọng sau:
- Đầu amino của 2 gene pfhB1 và pfhB2 theo mô hình N(P/Q)NG(I/M),
mô hình này liên quan đến tiến trình tiền phiên mả va tính hiệu ngoại bào
- Vùng trung tâm có chứa một vùng quy định khà năng bám dính của vi khuẩn vào bề mặt của tế bào Điều này giúp vi khuẩn có thể tấn công vô
tế bào và gây bệnh cho vật chủ
- Đầu carboxy chứa vùng có cấu trúc tương tự như protein kháng huyết
thanh p76 của Haemophilus somnus (có 66% amino acid tương tự) Khả năng này giúp cho Pasteurella multocida tăng khả năng sống sót trong
cơ thể vật chủ từ đó tăng cường khả năng gây bệnh của vi khuẩn
multocida
vì vậy việc chuẩn đoán vi khuẩn không có khó khăn gì đặc biệt Tuy nhiên để xác định chính xác type kháng nguyên của vi khuẩn đó thì lại khá phức tạp khi
sử dụng các kỹ thuật thông thường
Việc xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida chủ
yếu được thực hiện bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính, ngưng kết trong ống nghiệm, kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch (agar gel
precipitation test, AGP) và bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu
của các kỹ thuật phân tử như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật RT-PCR, kỹ thuật phân tích thành phần protein của vi khuẩn trên bản gel…
III PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU
III.1 Giám định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B
bằng kỹ thuật PCR
Trong quy trình chuẩn đoán này người ta sử dụng 2 cặp mồi
- Cặp mồi HSB
Trang 10KTT72 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’
- Cặp mồi B capsule type (CAPB)
CAPB-FWD 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’
CAPB-REV 5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’
Với 2 cặp mồi HSB và CAPB sản phẩm DNA tương ứng được tạo ra có kích thước tương ứng là 620 bp và 720 bp (Townsend và cs., 2001) Với cặp mồi
HSB có thể nhận diện được hầu hết các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida, trong đó cặp mồi CAPB cho phép phân biệt các chủng Pasteurella multocida serotype B (B:2, B:5, B:2,5) Ngoài ra để xác định vi khuẩn Pasteurella
multocida serotype D người ta sử dụng cặp mồi CAPD (đặc hiệu cho vi khuẩn P
multocida serogroup D) (Townsend và cs., 2001) Do các chủng Pasteurella
multocida có thể dương tính cùng lúc với cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB và
CAPD, nên để xác định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B hoặc
serotype D cần thiết phải sử dụng đồng thời 2 cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB
và CAPD
Kết quả PCR có tính chính xác cao và rất nhanh chóng, vì thế có thể sử dụng
chúng trong chuẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ bệnh do Pasteurella multocida
trên gia súc gia cầm
III.2 Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida
bằng phương pháp nested-PCR
Trong phương pháp này người ta sử dụng 2 cặp mồi: cặp mồi chung cho loài và cặp mồi riêng cho vùng mã hóa chuyên biệt của một serotype nào đó Cặp
Trang 11mồi chung được thiết kế dựa vào vùng bảo tồn của loài Pasteurella multocida,
không chuyên biệt cho serotype nào cả
Và cặp mồi riêng cho một serotype nào đó Dưới đây là cặp mồi cho serotype B:
- KMT1T72: 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’
Đầu tiên với cặp mồi Sp6 promoter và T7 promoter, đoạn gene của vùng bảo tồn sẽ được nhân lên với một số lượng nhất định trong lần chạy PCR thứ nhất Ở lần chạy PCR thứ hai, với cặp mồi KMT1SP61 và KMT1T72, đoạn gene chuyên biệt của serotype B sẽ được khuếch đại cho phép xác định serotype của
vi khuẩn
Trong kỹ thuật này người ta có thể sử dụng 2 cặp mồi sau:
Cặp mồi thứ nhất là cặp mồi chung được thiết kế áp dụng cho vùng bảo tồn
Cặp mồi thứ hai chuyên biệt cho một serotype Pasteurella multocida
Trang 12- KMT1SP6: 5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’
III.3 Phân tích thành phần protein của vi khuẩn
Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn được thực hiện trên gel SDS-PAGE Các chủng vi khuẩn được pha thành dung dịch huyền phù có nồng
Điện di protein vi khuẩn P multocida trên thạch Polyacrylamide 10%
Cột 1 và 8: Trọng lượng protein chuẩn
Cột 1 đến 7: Dịch chiết protein các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida
Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn cho phép ta nhận biết các
chủng Pasteurella multocida
Những nghiên cứu của Lugtenberg và cộng sự (1984) cho thấy có 3 loại protein màng ngoài khác nhau và kí hiệu chúng là I, II, III Các protein này thay đổi trọng lượng phân tử từ 28.000 đến 48.000 daltons Tuy những protein màng
Trang 13ngoài này dường như không có mối liên quan tuyệt đối với các chủng gây bệnh,
nhưng theo tác giả thì những chủng Pasteurella multocida có lớp protein màng
ngoài thuộc loại I sẽ có thể là chủng gây bệnh Trong khi đó nếu thuộc loại II thì
sẽ có thể là những chủng không gây bệnh
III.4 Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán
phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2
Đây là sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình RFLP Kỹ thuật PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP)
là một kỹ thuật mà trong đó trình tự ADN biến thể được xác định bằng cách
khuếch đại thông qua kỹ thuật PCR Tiếp theo đó sản phẩm của quá trình PCR
sẽ được phân cắt bởi một endonuclease hạn chế Các phân đoạn DNA khác nhau
về kích thước và sẽ được phân tách trên gel agarose / gel acrylamide.Việc phân
biệt được các serotype Pasteurella multocida dựa trên sự khác biệt nucleic acid của các serotype Pasteurella multocida
Kiến thức về serotype của Pasteurella multocida tham gia vào một ổ dịch
là điều rất cần thiết để tạo nên các biện pháp kiểm soát hiệu quả Đặc tính kháng
nguyên của Pasteurella multocida được thực hiện bởi serogrouping capsular và
serotyping soma Tuy nhiên những kỹ thuật này lại được thực hiện bởi các phòng thí nghiệm tham khảo Điều này thường dẫn đến sự chậm trễ trong việc xác định các serotype cô lập được Kỹ thuật gene dựa cho sự khác biệt về nucleic acid của serotypes có thể thay thế cho các kỹ thuật thông thường Một kỹ thuật PCR-REA (Polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis) đã được chuẩn hóa để
phân biệt Pasteurella multocida serotype A: 1, A: 3 và B: 2
Vật liệu và phương pháp:
Pasteurella multocida chủng DP1 và FP1 cô lập tại Kerala, Ấn Độ
serotyped là A: 1 do Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp
Pasteurella multocida chủng LKO serotypes A: 3, B: 2 do Viện Nghiên
cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp nhằm hình thành các chủng tham khảo cho nghiên cứu này
Hai oligonucleotides dựa theo trình tự của P multocida X-73 ompH gene, U50907 (Luo et al , 1997) được thiết kế bằng cách sử dụng phần mềm Primer3