Tài liệu TIỂU LUẬN:CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG ppt

Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 1 - BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Seminar : Chẩn đoán bệnh CHẨN ĐOÁN VIRUS CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY PHÔI TRỨNG. Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải Hồ Bảo Quốc 06126117 DH06SH Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 1 Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 2 - A. Đặt vấn đề Virus cúm và đại dịch cúm gia cầm gây thiệt hại rất lớn về kinh tế của mọi quốc gia trên thế giới và chúng là một thách thức lớn cho ngành y tế trong những năm qua. Việt Nam là một trong những quốc gia chịu ảnh hưởng nhiều nhất của đại dịch này. Mặc dù chúng ta đã có nhiều biện pháp và nỗ lực trong việc phòng chống nhưng vẫn chưa mang lại hi ệu quả như mong muốn. Trong công tác phòng chống việc chẩn đoán để xác định chính xác virus gây bệnh là một khâu hết sức quan trọng. Một trong những kỹ thuật chẩn đoán virus cúm gia cầm có độ chính xác cao đó là kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 3 - B. Tổng quan I. Thông tin chung về cúm gia cầm 1. Cúm gia cầm là gì ? Cúm gia cầm, còn được gọi là cúm gà, là bệnh truyền nhiễm trên động vật, chủ yếu là loài chim, đôi khi cũng thấy trên lợn do vi- rút cúm gia cầm týp A gây ra. Chủng vi-rút cúm này có độc tính cao, đôi khi vượt qua hàng rào bảo vệ lây nhiễm cho con người. Dựa trên kháng nguyên, người ta chia cúm gia cầm thành 16 phân nhóm H (Haemagglutinin: H1-H16) và 9 phân nhóm N (Neuraminidase: N1-N9), trong đó phân nhóm H5 và H7 có độc tính cao. Hiện nay chỉ có 2 vi-rút H 1 N 1 và H 3 N 2 đang lưu hành và gây bệnh ở người. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 4 - Vi-rút cúm gây dịch cúm gia cầm hiện nay là H5N1 và được chia làm 2 nhóm: - Vi-rút cúm gia cầm có độc tính thấp (Low pathogenic avian virus: LPAV): thường lưu hành trong loài chim hoang dã, không gây bệnh hay gây bệnh nhẹ: xù lông, giảm sản lượng trứng và thường không được phát hiện. - Vi-rút cúm gia cầm có độc tính cao (Highly pathogenic avian virus: HPAV): rất nguy hiểm. Chúng lan truyền rất nhanh trong đàn gia cầm, gây bệnh nặng ảnh hưởng đến nhiều cơ quan và cuối cùng gây tử vong gần 100% trong vòng 48 giờ kể từ khi nhiễm bệnh. Bệnh lý LPAI ( low pathogenic avian influenza virus ) Những thương t ổn thay đổi với giống, loài virus và tuổi của kí chủ. Thông thường, chỉ những gà tây và những con gà biểu lộ một vài sự thay đổi đặc biệt lớn và cực kỳ nhỏ với những giống đã thích nghi với ký chủ ( Capua và Mutinelli 2001). Trong gà tây, bệnh viêm xoang, viêm khí quản và airsacculitis đã được phát hiện, mặc dầu sự tiêm nhiễm vi khuẩn sơ cấp có thể góp phần không có hại gì.Tuỵ của gà tây đã được mô tả. v ới những con gà bình thường, sự bọc nhẹ của đường hô hấp thì thường được thấy. Thêm vào, những tổn thương tập trung trên những cơ quan sinh sản của những con gà đẻ trứng ( buồng trứng, vòi trứng, viêm màng noãn hoàn.) HPAI (hightly pathogenic avian influentza viruses ) Những thay đổi lớn về bệnh lý và mô bệnh học của HPAI bộc lộ sự phụ thuộc giống nhau để ghi vào danh sách cho sự hiện diện của triệu chứng lâm sàn. Bố n loại thay đổi của tác nhân gây bệnh đã được thăm dò nguyên lí cơ bản ( Perkins and Swayne 2003): (i) Có lẽ (chết trong khoảng thời gian 24- 36 hours tiêm nhiễm, phần lơn trông thấy trong loài galliforme) và dạng cấp tính của bệnh biểu lộ những thay đổi bệnh tích không đặc thù: một sự hydropericardium rời rạc, sung huyết nhẹ trong ruột và Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 5 - thỉnh thoảng có những đóm xuất huyết trên màng treo và màng ngoài của màng ói được mô tả không nhất quán ( Mutinelly 2003a, Jones and Swayne 2004). Những con gà đã bị tác động bởi dòng H 5 N 1 châu Á đôi lúc biểu hiện xuất huyết từng mảng và tổng lượng chất nhầy đáng kể trong khí quản ( Elbers 2004). Tiết dịch rỉ huyết thanh trong các khoang cơ thể và phù nề ở phổi có thể được trông thấy không có hại gì. Những đóm chảy máu trong màng nhầy của dạ dày tuyến, nó thường được mô tả trong phần chính của sách trong phần trước, chỉ có sự khác biệt được gặp trong gia cầm đã nhi ễm với dòng H 5 N 1 châu Á (Elbers 2004). Những tổn thương mô học khác nhau gắn với kháng nguyên của virus có thể được phát hiện ở các mô khác nhau ( Mo 1997). Virus được trông thấy đầu tiên trong màng trong của những tế bào. Vào một giai đoạn sau đó những tế bào bị nhiễm virus được phát hiện trong cơ tim, tuyến thượng thận và tuỵ tạng. Những tế bàp thần kinh cũng như tế bào thần kinh đệm của bộ não cũng bị nhiễm.Về bệ nh lý, một tiến trình tương tự virus màng trong khác có thể được thừa nhận nơi màng trong và sự hoạt hoá của bạch cầu chỉ dẫn đến một hệ thống và sự phân bào rời rạc phóng thích khả năng dễ mắc bệnh đến tim phổi hoặc nhiều cơ quan hoạt động kém (Feldmann 2000, Klenk 2005). (ii) Ở động vật hữu nhũ chúng thể hiện một sự tấn công kéo dài của nhữ ng triệu chứng bệnh và một tiến trình kéo dài của bệnh, triệu chứng thần kinh và mô học, những tổn thương bộ não gây mưng mủ trội hơn hẳn sự hình dung (Perkins and Swayne 2002a, Kwon 2005). Tuy nhiên, virus cũng có thể được phân lập từ những cơ quan khác. Quá trình được mô tả trong ngỗng, vịt, đà diểu và những loài khác tiêm thí nghiệm với dòng HPAI H 5 N 1 châu Á. Trong những chim cho trứng, chứng viêm của buồng trứng, vòi trứng, và sau đó nang bị vỡ, cái gọi là viêm phúc mạc lòng đỏ trứng, có thể được trông thấy. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 6 - (iii) Ở vịt, mồng biển, chim sẻ, chỉ sự tái bản của virus được tìm thấy. Những loài chim này đã thể hiện viêm phổi nhẹ, viêm khí quản và thỉnh thoảng tế bào bạch cầu và viêm mô cơ tim ( Perkins and Swayne 2002a, 2003). (iv) Trong những thí nghiệm được mô tả bởi Perkins và Swayne (2003), chim bồ câu và chim sáo biển chứng tỏ khả năng kháng lại sự tiêm nhiễm của virus H 5 N 1 . Tuy nhiên, Werner và cộng sự ( công bố) đã có khả năng gây ra bệnh thần kinh, sự thừa hưởng đến viêm não không làm mưng mủ (KlopBesch 2006), trong 5/16 chim bồ câu dùng một chủng H 5 N 1 HPAI phân lập cách đay không lâu. 2. Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào? Loài thủy cầm là nguồn của tất cả các loại vi-rút cúm trong tự nhiên qua hàng thế kỷ, kể cả týp H5 và H7 nhưng thường có độc tính thấp. Tuy nhiên chính các chủng độc tính thấp H5 và H7 này khi truyền cho gia cầm, chúng biến đổi, đột biến gen để trở thành chủng độc tính cao gây nên dịch. Trong thời gian gần đây, người ta ghi nhận một số loài chim di trú có khả năng khuyếch tán vi-rút H5N1 độc tính cao này. 3. Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào? - Dịch cúm gia cầm bắt đầu xảy ra vào giữa năm 2003 tại Đông Nam Á, là dịch cúm gia cầm lớn nhất và nghiêm trọng nhất trong lịch sử loài người, làm chết hàng loạt các loài chim. Tác nhân gây bệnh là vi-rút H5N1 tồn tại dai dẳng, đã giết chết hay khiến con người tiêu hủy ước tính khoản 150 triệu con chim và gia cầm. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 7 - Hiện nay vi-rút này được xem là tác nhân gây dịch tại Indonesia, Việt Nam, một số tỉnh Cambodia, Trung Quốc, Thái Lan và Cộng Hoà Nhân Dân Lào. Ngoài ra từ giữa tháng 12/2003 – đầu tháng 2/2004, cúm gia cầm do H5N1 được báo cáo ở 8 quốc gia Châu Á: Hàn Quốc, Việt Nam, Nhật Bản, Thái Lan, Cambodia, Cộng Hoà Nhân Dân Lào, Indonesia và Trung Quốc. Hầu hết các quốc gia này chưa bao giờ từng xảy ra dịch cúm gia cầm trong lịch sử của họ. - Đầu tháng 8/2004: cúm gia cầm do H5N1 lần đầu tiên bùng nổ tại Malaysia, kế đến là Nga vào cuối tháng 7/2005, một s ố tỉnh Cộng Hoà Kazakhtan và Mông Cổ vào đầu 8/2005. Vào đầu 9/2005 cúm cũng ghi nhận tại Thổ Nhĩ Kỳ và Romania. Hiện nay Nhật Bản, Hàn Quốc và Malaysia được đưa ra khỏi danh sách các quốc gia bị dịch. - Tính đến 24/08/2006 có 59 quốc gia có gia cầm bị nhiễm vi-rút cúm H5N1. 4. Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người như thế nào? (a) Sự lan rộng và tồn tại lâu dài của dịch cúm gia cầm gây ra 2 mối nguy cơ lớn đối với sức khoẻ con người: Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 8 - - Nguy cơ lây nhiễm trực tiếp vi-rút cúm từ gia cầm bị bệnh, gây bệnh rất nặng, trong đó chủng vi-rút H5N1 gây bệnh nghiêm trọng và có tỉ lệ tử vong cao (>50%), chủ yếu là bệnh viêm phổi và suy đa cơ quan. Đa số xảy ra trên những bệnh nhân trước khi mắc bệnh thì hoàn toàn khoẻ mạnh. - Quan trọng hơn, nguy cơ vi-rút bị đột biến, biến đổi gen nên dễ lây truyền từ gia cầm sang người, rồi từ người sang người. Sự biến đổi này là khởi phát đại dịch. (b) Các trường hợp cúm gia cầm H5N1 xảy ra trên con người: - 1997: có 18 trường hợp đầu tiên xảy ra ở Hong Kong, gây tử vong 6 trường hợp (chiếm tỉ lệ 33,33%). - 2003: có 2 trường hợp xảy ra ở Hong Kong trong 1 gia đình có tiền sử đi du lịch Trung Quốc gần đây, gây tử vong 1 trường hợp (chiếm tỉ lệ 50 %). - 2004: tại Thái-lan có 17 ca và tử vong 12 (chiếm tỉ lệ 70,59%), Vi ệt Nam có 29 ca và tử vong 20 (chiếm tỉ lệ 68,97 %). - 2005: có 5 quốc gia có bệnh nhân nhiễm, tổng cộng 95 ca và tử vong 41 (chiếm tỉ lệ 43,16 %) - Tính đến 23/08/2006: các trường hợp nhiễm vi-rút cúm H5N1 được xác định bằng xét nghiệm được báo cáo tại 9 quốc gia với 96 ca bị nhiễm và tử vong 64 (chiếm tỉ lệ 66,67 %) trong đó không có Việt Nam. Tóm lại, dịch cúm A (H5N1) ở người đã ghi nhận tại 10 quốc gia trên thế giới, với 232 trường hợ p mắc bệnh và có tổng cộng 134 trường hợp tử vong (chiếm 57,9%). - Riêng tại Việt Nam, từ ngày 14/11/2005 đến nay gần 9 tháng không ghi nhận trường hợp mắc mới cúm A (H5N1) ở người. Tính từ trường hợp mắc cúm A(H5N1) đầu tiên tại Việt Nam (26/12/2003) đến nay đã ghi nhận 93 trường hợp mắc tại 32 tỉnh/thành phố, trong đó có 42 trường hợp tử vong. (xem chi tiết số liệu bảng 1) (c) Con người bị nhiễm vi-rút cúm H5N1 trong trườ ng hợp nào? - Tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh, tiếp xúc với bề mặt hay vật dụng bị nhiễm phân của gia cầm bị bệnh. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 9 - - Hầu hết các trường hợp xảy ra ở nông thôn, ngoại ô hay nơi có nuôi gia cầm. - Phân và chất tiết của chim nhiễm bệnh thảy ra môi trường chứa nhiểu vi-rút cúm gây bệnh xuống môi trường rất lớn. - Nghiêm trọng hơn cả là người nuôi gia cầm trong vùng dịch tễ thấy gia cầm có triệu chứng nhiễm bệnh là làm thịt, chế biến rồi dùng hay bán ra thị trường. Nguồn tiếp xúc có nguy cơ cao là khi con người giết gia cầ m, nhổ lông và chế biến trước khi đem nấu chín. 5. Triệu chứng của bệnh cúm gia cầm ở người là gì? Dựa trên các yếu tố và triệu chứng sau: (a) Yếu tố dịch tễ: - Tiếp xúc với gia cầm bị bệnh trong vòng 2 tuần trước đó (nuôi, buôn bán, vận chuyển, giết mổ, ăn thịt gia cầm bị bệnh, ăn tiết canh v.v ), hoặc sống ở vùng có dịch cúm gia cầm. - Tiếp xúc gần với người bệnh đã xác định cúm, hoặc người bệnh tử vong vì viêm phổi chưa rõ nguyên nhân. (b) Lâm sàng: Bệnh diễn biến cấp tính và có thể có các biểu hiện sau đây: - Có dấu hiệu nhiễm khuẩn: sốt trên 38 o C, có thể rét run - Các triệu chứng về hô hấp: o Ho, thường ho khan, đau ngực, ít gặp triệu chứng viêm long đường hô hấp trên. o Khó thở, thở nhanh, tím tái, o Ran nổ, ran ẩm khi nghe phổi o Có thể dẫn đến suy hô hấp cấp tiến triển (ARDS). - Triệu chứng tuần hoàn: nhịp tim nhanh, đôi khi có sốc. - Các triệu chứng khác: đau đầu, đau cơ, tiêu chảy, rối loạn ý thức - Suy đa tạng. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 10 - (c) Cận lâm sàng: - X quang phổi: Tổn thương thâm nhiễm lan toả một bên hoặc hai bên, tiến triển nhanh - Xét nghiệm máu: o Công thức máu: số lượng bạch cầu: bình thường hoặc giảm. o Khí máu: giảm oxy máu khi bệnh tiến triển nặng + PaO 2 giảm (< 85 mmHg), có thể giảm nhanh (dưới 60 mmHg). Tỷ lệ PaO 2 /FiO 2 dưới 300 khi có tổn thương phổi cấp (ALI), dưới 200 khi có suy hô hấp cấp tiến triển (ARDS). - Chẩn đoán vi sinh vật: o Làm RT-PCR để xác định vi rút cúm A/H5 o Phân lập vi khuẩn theo thường quy II. Chẩn đoán bệnh trong phòng thí nghiệm 1. Sự thu thập mẫu xét nghiệm Những mẫu xét nghiệm nên dược thu thập từ một vài xác xúc vật chết còn tươi và từ những chim bị bệnh của một ßock. Theo lý tưởng, sự lấy mẫu đầy đủ được nhìn lại bằng phương pháp thống kê và sự chẩn đoán được làm trên một đế ßock. Khi thu thập mẫu nghi nhiễm HPAI, tiêu chuẩn an toàn phải được khảo sát để tránh sự phơi bày của những người sưu tập mẫu đến khả năng của HPAIV (Bridges 2002), Nguyên tắc chỉ đạo được đề nghị bỡi CDC (CDC 2005). Khi xét nghiệm virus, những bông thấm thu được từ lỗ huyệt và vùng hầ u thông thường cho phép một phòng thí nghiệm điều tra đầy đủ và hoàn chỉnh. Vật liệu thu thập trên những mẫu bông nên được trộn vào trong 2-3ml mẫu đại diện của một môi trường vận chuyển đẳng trương vô trùng bao gồm kháng sinh bổ sung và một protein nguồn (e.g. 0,5%[ w/v] albumin huyết thanh bò, 10% huyết thanh bò hoặc một dung dịch pha lấy ở giữa não). [...]... việc phân lập virus và phát hiện virus bằng việc sử dụng những quả trứng gà có phôi) - 21 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng C Kết luận - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng cho kết quả chính xác nhất - Phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng tốn nhiều thời gian - Trong phương pháp chẩn đoán bằng kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng việc đảm... cái lỗ thủng trong những quả trứng bằng một giọt keo dáng Ấp những quả trứng ở nhiệt độ 38-39oC và độ ẩm 60%- 70% thời gian 5 ngày - 17 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 3 khảo sát những quả trứng đã được tiêm chủng Trứng được tiêm chủng được soi đến 5 ngày Ghi nhận những quả trứng bị chết và ghi chép thời gian làm cho phôi chết Những quả trứng chết trong ngày đầu tiên... www.who.int - 22 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng ài liệu tham khảo A Đặt vấn đề 2 B Tổng quan 2 I Thông tin chung về cúm gia cầm 3 1 .Cúm gia cầm là gì? .3 2 Vi-rút cúm khuyếch tán và lây truyền như thế nào? 7 3 Hiện nay dịch cúm gia cầm xảy ra như thế nào? 7 4 Cúm gia cầm ảnh hưởng đến sức khoẻ con người ... Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 2 Sự tiêm chủng cho những quả trứng 1 Đặt những quả trứng với đầu cùng của nó quay lên vào bên trong những cái khay trứng và đánh dấu mỗi quả trứng với một con số nhận dạng đặc biệc ( 3 quả trứng cho một mẫu bệnh phẩm) 2 Lau sạch mặt trên của những quả trứng bằng ethanol 70% và thọc một lỗ nhỏ vào bên trong vỏ xuyên qua túi khí Ba quả trứng. .. kỷ thuật có độ nhạy thấp hơn kỷ thuật phân lập virus hoặc PCR,và do đó có thể gặp khó khăn để chấp nhận cho một phương pháp chẩn đoán hợp lý, đặc biệt của một bảng danh mục ( Davision 1998, Selleck 2003, Cattoli 2004) Ứng dụng của những phương - 14 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng pháp xét nghiệm nhốt trên mắt phẳng trong lĩnh vực thú y thì vẫn còn trong giai đoạn phôi. .. vius cúm gia cầm HA7,5 Nhóm thứ hai tiêm chủng 200 µl - 15 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng PBS 1x cho mẫu đối chứng âm Nhóm cuối cùng tiêm chủng 200 µl thể vẩn bước đầu của nồng độ virus Thể vẩn từ 3 nhóm được li tâm 3000 vòng 30 phút trong máy li tâm lạnh (4oC) để lắng những mảnh mô và hầu hết vi khuẩn, dịch lỏng sạch bên trên được thu thập, sau đó dịch lỏng được lọc bằng. .. sát những quả trứng đã được tiêm chủng 19 4 Sự thu hoạch của những quả trứng gà được tiêm chủng 19 5 Xét nghiệm hemagglutination 20 - 23 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng 6 Đọc kết quả 20 a) Giải thích kết quả .20 b) Xét nghiệm nhanh bằng sử dụng vet smart® test .21 C Kết luận .23 D Tài liệu tham khảo... quả trứng sạch là rất quan trọng - Để khắc phục những nhược điểm của phương pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng cần kết hợp với các phương pháp khác như : sinh học phân tử, huyết thanh học,… D Tài liệu tham khảo: • www.influenzaReport.com • www.adb.org/Documents/Events/2007/HPAI-control-technologyCAREC/Detection-Avian-influe • www.vphcap.org • www.who.int - 22 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm. ..Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng Khi mổ xẻ để phân tích, mang ra ngoài dưới những điều kiện an toàn và tránh phát tán mầm bệnh (xem trọng), những mẫu bệnh phẩm của não, khí quản/phổi, lách và cái gì đó chứa trong ruột không được bảo quản được thu thập cho việc phân lập virus Mục đích của huyết thanh học, những mẫu máu tự nhiên được lấy Một số mẫu đã thu thập nên phát hiện bằng. .. trường hợp, những điều chỉnh an toàn khi vận chuyển (e.g IATA rules) nên được khảo sát kỹ để tránh phát tán mẫu bệnh và sự phơi nhiễm của con người trong suốt quá trình vận chuyển Nó là thích hợp cao để tiếp xúc phòng thí nghiệm được bổ nhiệm - 11 - Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng cho việc chẩn đoán trước khi gửi những mẫu phân tích đến và, lý tưởng, troen tru trước khi thu . Minh Tháng 1 Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 2 - A. Đặt vấn đề Virus cúm và đại dịch cúm gia cầm gây thiệt hại rất. xác cao đó là kỷ thuật nuôi cấy phôi trứng. Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật nuôi cấy phôi trứng - 3 - B.