Tài liệu TIỂU LUẬN: CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA docx

Điều đáng lưu ý là kết quả của biến đổi trôi dạt dẫn đến sự ra đời của chủng virus cúm mới mà kháng thể đối với các chủng virus trước nó không nhận ra được 2 Các biến đổi lớn có tính ch

Bộ giáo dục và đào tạo Trường đại học Nông Lâm TP HCM

Bài tiểu luận

CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA

Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trần Thị Quế

MỤC LỤC

Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 3

Chương 2 TỔNG QUAN 2.1 BỆNH CÚM GIA CẦM 4

2.1.1 LỊCH SỬ BỆNH 4

2.1.2.CĂN BỆNH 4

2.1.2.1 Hình thái và cấu trúc 4

2.1.2.2 Quá trình tái sản của virus 7

2.1.2.3 Sức đề kháng đối với tác nhân vật lý và hóa học 8

2.1.2.4 Độc lực của virus 8

2.1.3 BỆNH DO VIRUS CÚM GIA CẦM GÂY RA 8

2.1.3.1 Đặc điểm dịch tễ 8

a Loài cảm nhiễm 8

b.Đường truyền lây và vật mang mầm bệnh 8

c Cơ chế sinh bệnh 9

2.1.3.3 Triệu chứng và bệnh tích 9

2.1.3.4 Miễn dịch 9

2.1.3.5 Chẩn đoán 9

a.Chẩn đoán lâm sàng 9

b.Chẩn đoán phòng thí nghiệm 9

2.1.3.6 Phòng chống bệnh cúm gia cầm 9

Chương 3: CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA 10

3.2 Giới thiệu chung về kỹ thuật ELISA 10

3.2.1 Lấy mẫu và bảo quản mẫu 10

3.2.2 Phát hiện kháng nguyên 11

3.2.3 Phát hiện kháng thể 12

3.2.4 Một số bộ kit phát hiện kháng thể 14

Chương 4: KẾT LUẬN 16

1968 cùng với những thiệt hại về kinh tế

Do mức độ thiệt hại đáng kể, nhiều biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm đã

và đang được áp dụng nhằm hạn chế sự lây lan và phát tán của mầm bệnh Vì vậy việc phát hiện, chẩn đoán virus cúm gia cầm một cách có hiệu quả, nhanh, chính xác, rẻ tiền là một vấn đề bức thiết

“ Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật ELISA” là một trong những kỹ thuật đáp ứng được những yêu cầu thực tiễn trên và được áp dụng rộng rãi

có thể qua lọc” gây ra, nhưng virus không được định danh là virus cúm cho đến năm 1955

Sau đó người ta thấy bệnh xuất hiện ở các nước Áo, Đức, Bỉ và Pháp Hiện nay, bệnh xuất hiện hầu như ở các nước trên thế giới với các subtyp khác nhau đã được xác định

Một số ổ dịch gần đây ở các nước khác nhau đã được thông báo: subtyp H5N1 (Anh,1991), Subtyp H7N3 ( Úc, 1992-1995), H5N2 (Mexico, 1994), H7N3

(Pakistan, 1995), H5N1 ( Hồng Kông, 1997), H5N2 (Ý,1992), H7N4 ( Úc, 1994), H7N1 (Ý, 1999) và H5N1 (Hồng Kông, 2001)

Từ cuối năm 2003 đến nay, bệnh cúm gia cầm subtyp H5N1 đã xuất hiện tại một

số nước châu Á, trong đó có Việt Nam, sau đó lan sang các nước châu Âu và Trung Đông Bệnh có nguy cơ lan rộng, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi

và đe dọa sức khỏe cộng đồng

Virus cúm gà có tên khoa học là avian influenza (AI) thuộc nhóm virus cúm A của

họ Orthomyxociridae Đây là những retrovirus, mang vật liệu di truyền là những đoạn phân tử RNA, sợi đối mã (sợi âm tính), có dạng đa hình thái, kích thước 80-120nm

Cấu trúc bộ gene của virus gồm 8 phân đoạn, mã hóa cho các protein: PB2, PB1,

PA, HA, NP, NA, M, NS

Các phân nhóm (subtype) của virus cúm gia cầm được xác định dựa trên cấu trúc của các protein bề mặt HA và NA Đến nay người ta xác định có tất cả 16 subtype

HA và 9 subtype NA được phân lập trên các loài dã cầm và gia cầm khắp nơi trên thế giới qua nhiều giai đoạn khác nhau Sự phối hợp của 16 loại HA và 9 loại NA tạo nên sự đa dạng và phong phú của virus cúm

(1) Haemagglutinin (HA)

Là một protein bề mặt, có khả năng bám trên các thụ thể tế bào chứa sialic acid, giúp virus nhân lên và gây bệnh

Có khả năng gây ngưng kết hồng cầu

Là kháng nguyên bề mặt, kích thích cơ thể vật chủ sinh kháng thể bảo hộ HI Thường xuyên biến đổi tạo tính đa dạng của kháng nguyên

Hemagglutinin

The hemagglutinin molecule is actually a combination of three identical proteins (shown here as gray, green, and purple) that are bound together to form an elongated cylindrical shape A mutation that changes just one amino acid in the protein

structure can alter the antigenic properties significantly

(2) Neuraminidase (NA)

Là protein bề mặt, có hoạt tính sialidase, giúp virus phân cắt HA ra khỏi màng

Là kháng nguyên bề mặt kích thích cơ thể vật chủ tạo kháng thể NI

Neuraminidase

The top consists of four identical proteins with a roughly spherical shape The picture below shows how each of these subunits is rotated by 90 degrees relative to the center of the arrangement

Các yếu tố H và N do các gene quy định nên khi các gene biến đổi, những yếu tố kháng nguyên này biến đổi theo Có hai loại biến đổi ở mức độ phân tử:

(1)Các đột biến điểm (point mutations): Thường xảy ra trên hai gene mã hóa các thành phần kháng nguyên dẫn đến các biến đổi nhỏ của H và N (người ta dùng thuật ngữ biến đổi trôi dạt - antigenic drift để mô tả các đột biến kiểu này) Kết quả hình thành nhiều kiểu kháng nguyên H và N khác nhau được ghi nhận bằng các ký hiệu H1, H2, H3 v.v và N1, N2, N3, v.v Vì vậy để ký hiệu mỗi loại virus

ta dùng một nhóm gồm hai ký hiệu một từ H và một từ N như: H1N1, H1N2, H2N2, H5N1 Điều đáng lưu ý là kết quả của biến đổi trôi dạt dẫn đến sự ra đời của chủng virus cúm mới mà kháng thể đối với các chủng virus trước nó không nhận ra được

(2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy ra khi virus cúm nhiễm từ loài này sang loài khác hoặc do trộn lẫn, tái tổ hợp gene của virus cúm ở các loài khác nhau (ví dụ giữa virus cúm A ở người và virus cúm A ở gia cầm) Khi loại biến đổi này xảy ra sẽ cho ra đời một phân type virus mới mà tác hại của

nó khó thể lường trước được Đây cũng là một trong những yếu tố để một đại dịch bùng phát

2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy ra khi virus cúm nhiễm

từ loài này sang loài khác hoặc do trộn lẫn, tái tổ hợp gene của virus cúm ở các loài khác nhau (ví dụ giữa virus cúm A ở người và virus cúm A ở gia cầm) Khi loại biến đổi này xảy ra sẽ cho ra đời một phân type virus mới mà tác hại của nó khó thể lường trước được Đây cũng là một trong những yếu tố để một đại dịch bùng phát

2.1.2.2 Quá trình tái sản của virus:

Quá trình sao chép và tái bản RNA xảy ra trong nhân của tế bào ký chủ

(1) Giai đoạn bám của virus trên bề mặt tế bào

Nhờ HA của virus gắn lên trên các thụ thể của tế bào ký chủ có chứa acid sialic

(2) Giai đoạn xâm nhập vào tế bào

Nhờ hoạt tính sialidase, NA phân cắt sialic acid ra khỏi HA và màng tế bào, giúp virus có thể xâm nhập vào bên trong tế bào tạo nên thể nội bào

(endosome)

(3) Giai đoạn phá vỡ màng

PH acid trong nguyên sinh chất tế bào chủ làm phá vỡ màng và giải phóng các ribonucleoprotein

HA bị phân cắt thành 2 tiểu đơn vị HA1 và HA2 bằng protease của ký chủ, khi

đó virus mới có khả năng gây bệnh

(4) Tổng hợp mRNA

Quá trình tái bản RNA của virus: xảy ra trong nhân tế bào

(2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy ra khi virus cúm nhiễm từ loài này sang loài khác hoặc do trộn lẫn, tái tổ hợp gene của virus cúm ở các loài khác nhau (ví dụ giữa virus cúm A ở người và virus cúm A ở gia cầm) Khi loại biến đổi này xảy ra sẽ cho

ra đời một phân type virus mới mà tác hại của nó khó thể lường trước được Đây cũng là một trong những yếu tố để một đại dịch bùng phát

RNA (-) => CRNA (+) => RNAs(-)

(5) Tổng hợp protein: HA, NA, PB1, PB2, PA, NS,M

Các protein HA và NA được đường hóa tại lưới nội mô có ribosome, gắn kết thành tam phân (trimer) và tứ phân (tetramer) tại bộ máy golgi, sau đó chuyển đến màng nguyên sinh chất hình thành nên lớp vỏ của hạt virus mới

(6) Đóng gói hạt virus

Phân tử RNA của thế hệ virus mới sẽ gắn kết với các protein (NP, PB1, PB2, PA,M2), di chuyển đến màng nguyên sinh chất, nơi các protein HA NA và M2 đang tập kết dđể đóng gói hình thành hạt virus

(7) Giai đoạn đâm chồi và phóng thích ra khỏi tế bào

NA đóng vai trò quan trọng trong việc phóng thích virus ra khỏi màng tế bào Protein làm gia tăng sự gắn kết của màng nguyên sinh chất và sự đâm chồi của hạt virus

2.1.2.3 Sức đề kháng đối với tác nhân vật lý và hóa học

Các virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu, không tồn tại lâu ngoài môi

trường Các yếu tố vật lý như sức nóng, pH quá thấp hoặc quá cao, điều kiện khô hạn có thể bất hoạt virus cúm gia cầm Dễ bị vô hoạt bởi các dung môi hữu

cơ và chất tẩy rửa

2.1.2.4 Độc lực của virus:

Dựa trên các chỉ số của tỷ lệ gây bệnh , tỷ lệ chết trên đàn gà gây bệnh… Độc lực của virus cúm gia cầm quyết định bởi 2 yếu tố chính: protein màng glycosylated HA (Hemagglutinin) và NA (neuraminidase)

Thường được chia thành 3 nhóm độc lực: độc lực cao (HPAI – High

Pathogenic Avian Influenza), độc lực trung bình (MPAI – Medium Pathogenic Avian Influenza) và độc lực thấp ( LPAI – Low Pathogenic Avian Influenza)

2.1.3 BỆNH DO VIRUS CÚM GIA CẦM GÂY RA

b Đường truyền lây và vật mang mầm bệnh

Virus cúm bài thải ra môi trường thông qua chất tiết đường hô hấp, miệng, kết mạc và phân

c Cơ chế sinh bệnh

Sự nhân lên trực tiếp của virus trong tế bào, mô, phủ tạng

Tác động gián tiếp của việc sản sinh các chất điều hòa tế bào như các cytokine Tắc mạch cục bộ do hình thành các huyết khối

Triệu chứng: phá hủy nhiều cơ quan phủ tạng, tim mạch và thần kinh ở những mức độ khác nhau: run rẩy đầu và cổ, rối loạn vận động, uu3 rũ, giảm ăn uống, liệt, rối loạn tiền đình…

Bệnh tích: hoại tử, xuất huyết, phù ở các phủ tạng và da

Hầu hết HPAI gây hoại tử điểm ở lách, tim, tuyến tụy… phổi viêm phù, xung huyết hoặc xuất huyết Túi Bursa và tuyến ức thường bị teo

2.1.3.4 Miễn dịch

Gia cầm nhiễm virus hoặc tiêm vaccine cúm gia cầm đều kích thích đáp ứng miễn dịch cục bộ tại niêm mạc và miễn dịch toàn thân Mức độ đáp ứng miễn dịch đối với virus cúm gia cầm thay đổi tùy loài: gà > gà lôi > gà tây > cút > vịt

Sau 5 ngày gây nhiễm, chủ yếu thấy xuất hiện IgM và một ít IgG Đáp ứng sinh kháng thể từ các protein bề mặt ( HA và NA) là các kháng thể trung hòa

Phát hiện virus:

Phát hiện protein hoặc RNA của virus trực tiếp từ mẫu mô: Miễn dịch mô gắn kết enzyme sử dụng kháng thể đơn dòng, miễn dịch huỳnh quang (FA) trên mẫu mô phết kính, ELISA, RT-PCR và real-time PCR…

Phân lập virus trên trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi bằng cách tiêm xoang niệu

mô, trên tế bào thường trực (cell line) như MDCK và Vero hoặc tế bào sơ cấp như CEF và thận gà

Phát hiện kháng thể: Sử dụng các phản ứng huyết thanh học như ELISA,

AGID, HI, miễn dịch huỳnh quang

2.1.3.6 Phòng chống bệnh cúm gia cầm

Ngăn ngừa và kiểm soát bệnh

Giám sát bệnh chặt chẽ để phát hiện sớm và báo cáo dịch

Tăng cường an toàn sinh học tại các trại chăn nuôi gia cầm

Kiểm soát vận chuyển gia cầm và sản phẩm

Thay đổi phương thức chăn nuôi

Tiêu hủy nhanh gia cầm bị bệnh và có nguy cơ bị bệnh

Chủng ngừa: tiêm vaccine

CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA

1 Giới thiệu chung về kỹ thuật ELISA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt

là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học Nguyên

lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể

Kỹ thuật ELISA được chia thành 2 loại: ELISA trực tiếp nhằm tìm kiếm kháng nguyên (ELISA capture hoặc ELISA sandwich) và ELISA gián tiếp nhằm tìm kiếm kháng thể (indirect hoặc ELISA cạnh tranh = competitive ELISA)

Sự liên kết giữa kháng nguyên_kháng thể được phát hiện bằng cách thêm cơ chất của một phản ứng tạo màu được xúc tác bởi enzyme Enzyme thường dùng để đánh dấu là : peroxidase, beta_galactoxidase, alkaline phosphatase,

Mẫu dương tính là có sự hiện diện của kháng nguyên hay kháng thể trong mẫu đượcc giữ lại trên khay xét nghiệm và cho phản ứng tạo màu khi thêm cơ chất

Khả năng ứng dụng của ELISA

Ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp ELISA là độ nhạy cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏ kháng nguyên- kháng thể, cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm (cho phép phát hiện lượng kháng nguyên virus nhỏ hơn 1ng/ml)

Dùng để phát hiện nhiều loại protein, nhận diện virus, vi khuẩn, và một số hợp

chất phân tử lượng nhỏ trong nhiều mẫu sinh học khác nhau

ELISA thuận tiên cho chẩn đoán xét nghiệm một số lượng mẫu lớn

2 Chẩn đoán virus cúm gia cầm bằng kỹ thuật ELISA:

Lấy mẫu và bảo quản mẫu:

Dùng tăm bông lấy mẫu dịch khí quản hoặc mẫu phân ở lỗ huyệt gia cầm sống hoặc chết Sau đó tăm bong được cho vào môi trường vận chuyển vô trùng chứa kháng sinh để ức chế vi khuẩn phát triển Một số loại bệnh phẩm khác: mô (gan, lách, thận, tụy, não…) đặt vào túi plastic vô trùng Để kiểm tra virus trong các cơ quan thu thập và bảo quản riêng các mô đường ruột và đường hô hấp Nếu thực hiện xét nghiệm mẫu trong vòng 48 giờ sau khi thu thập thì bảo quản ở 4oC, Nếu mẫu được giữ lâu hơn thì bảo quản ở -70oC TRước khi kiểm tra virus, mô nên được nghiền thành huyễn dịch 5-10% trong môi trường bận chuyển và được lắng lọc bằng ly tâm với tốc độ thấp Những điều cần thiết để làm thử nghiệm:

Kháng thể được tinh sạch (Purified antibody- nếu muốn phát hiện hay định lượng kháng nguyên

Dung dịch chuẩn (đối chứng dương và âm)

Mẫu để kiểm tra

Dung dịch rửa (buffer)

Kháng thể có gắn enzyme và cơ chất của enzyme Máy đọc phản ứng PCR (spectrophotometer)

a Phát hiện kháng nguyên: Bản chất kháng nguyên của cúm gia cầm phụ thuộc

chính vào hai yếu tố H và N Vì vậy để phát hiện được virus cúm gia cầm đồng

thời phân biệt được các loại subtype kháng nguyên virus cúm ta phải cần ít nhất 2

bộ kit và 2 lần xét nghiệm

Lần 1: Xác định yếu tố HA (Hemaglutinin)

Lần 2: Xác định yếu tố NA ( Neuraminidase)

Phương pháp: dùng ELISA trực tiếp (direct ELISA)

Nguyên tắc: Nếu kháng nguyên hiện diện trong mẫu sẽ gắn với kháng thể sơ cấp

(đã gắn vào bề mặt cứng của giếng), kháng thể thứ cấp (gắn enzyme) được bổ sung vào sẽ gắn với kháng nguyên và những kháng thể thứ cấp không gắn sẽ bị rửa trôi trong quá trình rửa Khi bổ sung cơ chất tương ứng với enzyme, cơ chất không màu chuyển thành có màu

Nếu kháng nguyên không hiện diện trong mẫu thì không có sự hiện màu

Các bước tiến hành:

(1) Người ta gắn kháng thể đã biết trước lên giá thể

(2) Cho dung dịch mẫu chẩn đoán và đối chứng được cho vào các giếng

(3) Ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản xuất)

Direct ELISA: nhanh, tránh được phản ứng chéo của kháng thể thứ cấp với các thành phần trong mẫu Tuy nhiên direct ELISA đòi hỏi sự đánh dấu tất cả các kháng thể được sử dụng=> tốn thời gian, chi phí Thêm vào đó một số kháng thể

có thể không phù hợp với việc đánh dấu trực tiếp Phương pháp trực tiếp thường thiếu sự khuyếch đại tín tín hiệu thêm vào mà có thể đạt được với việc sử dụng kháng thể thứ cấp

b Phát hiện kháng thể: có thể phát hiện kháng thểtrong vòng 1 tuần sau khi nhiễm

Bản chất kháng nguyên của cúm gia cầm phụ thuộc chính vào hai yếu tố H và N vì vậy khi virus cúm xâm nhập vào cơ thể nó kích thích cơ thể tạo ra 2 loại kháng thể trung hòa tương ứng với yếu tố HA và NA có tính đặc hiệu cao

HA kích thích cơ thể tạo kháng thể HI

NA kích thích cơ thể tạo kháng thể NI

Vì vậy ta cũng phải dùng 2 bộ kit ELISA, chẩn đoán 2 lần: Xác định kháng thể

kháng HA trước sau đó là kháng thể kháng NA

Phương pháp chẩn đoán: dùng ELISA gián tiếp

Nguyên tắc: Nếu kháng thể hiện diện trong mẫu sẽ gắn với kháng nguyên đã được

cố định ở với bề mặt rắn trong giếng Sau đó kháng thể thứ hai (được gắn với enzyme) được cho vào giếng nếu có sự hiện diên của kháng thể cần kiểm tra thì sẽ gắn vào kháng thể này, và không bị rửa trôi trong quá trình rửa, khi bổ sung cơ chất (không màu) => enzyme sẽ chuyển có sự hiện màu Nếu không có sự hiện diện kháng thể này trong mẫu thì kháng thể thứ hai bị rửa trôi trong quá trình rửa

=> không có sự hiện màu khi bổ sung cơ chất

Các bước tiến hành

(1) Các kháng nguyên đã biết trước (purified antigen) được gắn trên giá thể (các giếng của vỉ nhựa hoặc màng lai…) (30-60 phút)

(2) Dung dịch mẫu chẩn đoán và đối chứng được cho vào các giếng

(3) Ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tùy theo bộ kit của nhà sản xuất)