Chẩn đoán cúm gia cầm bằng kỹ thuật elisa

Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Bộ giáo dục đào tạo Trường đại học Nông Lâm TP HCM Bài tiểu luận CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA Giáo viên hướng dẫn: Nguyễn Ngọc Hải Sinh viên thực hiện: Trần Thị Quế Footer Page of 126 Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA MỤC LỤC Chương 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN 2.1 BỆNH CÚM GIA CẦM 2.1.1 LỊCH SỬ BỆNH 2.1.2.CĂN BỆNH 2.1.2.1 Hình thái cấu trúc 2.1.2.2 Quá trình tái sản virus 2.1.2.3 Sức đề kháng tác nhân vật lý hóa học 2.1.2.4 Độc lực virus 2.1.3 BỆNH DO VIRUS CÚM GIA CẦM GÂY RA 2.1.3.1 Đặc điểm dịch tễ a Loài cảm nhiễm b.Đường truyền lây vật mang mầm bệnh c Cơ chế sinh bệnh 2.1.3.3 Triệu chứng bệnh tích 2.1.3.4 Miễn dịch 2.1.3.5 Chẩn đoán a.Chẩn đoán lâm sàng b.Chẩn đoán phòng thí nghiệm 2.1.3.6 Phòng chống bệnh cúm gia cầm Chương 3: CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA 10 3.2 Giới thiệu chung kỹ thuật ELISA 10 3.2.1 mẫu bảo quản mẫu 10 3.2.2 Phát kháng nguyên 11 3.2.3 Phát kháng thể 12 3.2.4 Một số kit phát kháng thể 14 Chương 4: KẾT LUẬN 16 Footer Page of 126 Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA ĐẶT VẤN ĐỀ Những ngày giới nóng lên trước nguy lây lan dịch cúm gia cầm khắp toàn cầu Lịch sử nhân loại chứng kiến nhiều đại dịch cúm cướp sinh mạng hàng trăm triệu người giới mà điển hình vào năm 1889, 1918, 1957, 1968 với thiệt hại kinh tế Do mức độ thiệt hại đáng kể, nhiều biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm áp dụng nhằm hạn chế lây lan phát tán mầm bệnh Vì việc phát hiện, chẩn đoán virus cúm gia cầm cách có hiệu quả, nhanh, xác, rẻ tiền vấn đề thiết “ Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật ELISA” kỹ thuật đáp ứng yêu cầu thực tiễn áp dụng rộng rãi Footer Page of 126 Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA TỔNG QUAN 2.1 BỆNH CÚM GIA CẦM 2.1.1 ỊCH SỬ BỆNH Bệnh cúm gia cầm bệnh truyền nhiễm cấp tính virus gây bệnh cho gia cầm với tỷ lệ chết cao với biểu hô hấp, tiêu hóa hay thần kinh Bệnh ghi nhận vào năm 1878 Ý gọi dịch tả gà (fowl plague) Đến năm 1901, Centanni Savonuzzi chứng minh bệnh “virus qua lọc” gây ra, virus không định danh virus cúm năm 1955 Sau người ta thấy bệnh xuất nước Áo, Đức, Bỉ Pháp Hiện nay, bệnh xuất nước giới với subtyp khác xác định Một số ổ dịch gần nước khác thông báo: subtyp H5N1 (Anh,1991), Subtyp H7N3 ( Úc, 1992-1995), H5N2 (Mexico, 1994), H7N3 (Pakistan, 1995), H5N1 ( Hồng Kông, 1997), H5N2 (Ý,1992), H7N4 ( Úc, 1994), H7N1 (Ý, 1999) H5N1 (Hồng Kông, 2001) Từ cuối năm 2003 đến nay, bệnh cúm gia cầm subtyp H5N1 xuất số nước châu Á, có Việt Nam, sau lan sang nước châu Âu Trung Đông Bệnh có nguy lan rộng, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi đe dọa sức khỏe cộng đồng 2.1.2.CĂN BỆNH Giới thiệu chung virus cúm gia cầm 2.1.2.1 nh thái cấu trúc Cúm gà hay cúm gia cầm loại bệnh cúm virus gây cho loài gia cầm (hay chim), xâm nhiễm số loài động vật có vú Virus phát lần Ý vào đầu thập niên 1900 phát hầu hết nơi giới Footer Page of 126 Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Virus cúm gà có tên khoa học avian influenza (AI) thuộc nhóm virus cúm A họ Orthomyxociridae Đây retrovirus, mang vật liệu di truyền đoạn phân tử RNA, sợi đối mã (sợi âm tính), có dạng đa hình thái, kích thước 80120nm Cấu trúc gene virus gồm phân đoạn, mã hóa cho protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS Các phân nhóm (subtype) virus cúm gia cầm xác định dựa cấu trúc protein bề mặt HA NA Đến người ta xác định có tất 16 subtype HA subtype NA phân lập loài dã cầm gia cầm khắp nơi giới qua nhiều giai đoạn khác Sự phối hợp 16 loại HA loại NA tạo nên đa dạng phong phú virus cúm (1) Haemagglutinin (HA) Là protein bề mặt, có khả bám thụ thể tế bào chứa sialic acid, giúp virus nhân lên gây bệnh Có khả gây ngưng kết hồng cầu Là kháng nguyên bề mặt, kích thích thể vật chủ sinh kháng thể bảo hộ HI Thường xuyên biến đổi tạo tính đa dạng kháng nguyên Footer Page of 126 Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Hemagglutinin The hemagglutinin molecule is actually a combination of three identical proteins (shown here as gray, green, and purple) that are bound together to form an elongated cylindrical shape A mutation that changes just one amino acid in the protein structure can alter the antigenic properties significantly (2) Neuraminidase (NA) Là protein bề mặt, có hoạt tính sialidase, giúp virus phân cắt HA khỏi màng Là kháng nguyên bề mặt kích thích thể vật chủ tạo kháng thể NI Neuraminidase Footer Page of 126 Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA The top consists of four identical proteins with a roughly spherical shape The picture below shows how each of these subunits is rotated by 90 degrees relative to the center of the arrangement Các yếu tố H N gene quy định nên gene biến đổi, yếu tố kháng nguyên biến đổi theo Có hai loại biến đổi mức độ phân tử: (1) Các đột biến điểm (point mutations): Thường xảy hai gene mã hóa thành phần kháng nguyên dẫn đến biến đổi nhỏ H N (người ta dùng thuật ngữ biến đổi trôi dạt - antigenic drift để mô tả đột biến kiểu này) Kết hình thành nhiều kiểu kháng nguyên H N khác ghi nhận ký hiệu H1, H2, H3 v.v N1, N2, N3, v.v Vì để ký hiệu loại virus ta dùng nhóm gồm hai ký hiệu từ H từ N như: H1N1, H1N2, H2N2, H5N1 Điều đáng lưu ý kết biến đổi trôi dạt dẫn đến đời chủng virus cúm mà kháng thể chủng virus trước không nhận (2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy virus cúm nhiễm từ loài sang loài khác trộn lẫn, tái tổ hợp gene virus cúm loài khác (ví dụ virus cúm A người virus cúm A gia cầm) Khi loại biến đổi xảy cho đời phân type virus mà tác hại khó thể lường trước Đây yếu tố để đại dịch bùng phát 2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy virus cúm nhiễm từ loài sang loài khác trộn lẫn, tái tổ hợp gene virus cúm loài khác (ví dụ virus cúm A người virus cúm A gia cầm) Khi loại biến đổi xảy cho đời phân type virus mà tác hại khó thể lường trước Đây yếu tố để đại dịch bùng phát Footer Page of 126 Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA (2) Các biến đổi lớn có tính chuyển đổi (antigenic shift) xảy virus cúm nhiễm từ loài sang loài khác trộn lẫn, tái tổ hợp gene virus cúm loài khác (ví dụ virus cúm A người virus cúm A gia cầm) Khi loại biến đổi xảy cho đời phân type virus mà tác hại khó thể lường trước Đây yếu tố để đại dịch bùng phát 2.1.2.2 uá trình tái sản virus: Quá trình chép tái RNA xảy nhân tế bào ký chủ (1) Giai đoạn bám virus bề mặt tế bào Nhờ HA virus gắn lên thụ thể tế bào ký chủ có chứa acid sialic (2) Giai đoạn xâm nhập vào tế bào Nhờ hoạt tính sialidase, NA phân cắt sialic acid khỏi HA màng tế bào, giúp virus xâm nhập vào bên tế bào tạo nên thể nội bào (endosome) (3) Giai đoạn phá vỡ màng PH acid nguyên sinh chất tế bào chủ làm phá vỡ màng giải phóng ribonucleoprotein HA bị phân cắt thành tiểu đơn vị HA1 HA2 protease ký chủ, virus có khả gây bệnh (4) Tổng hợp mRNA Quá trình tái RNA virus: xảy nhân tế bào Footer Page of 126 Header Page of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA RNA (-) => CRNA (+) => RNAs(-) (5) Tổng hợp protein: HA, NA, PB1, PB2, PA, NS,M Các protein HA NA đường hóa lưới nội mô có ribosome, gắn kết thành tam phân (trimer) tứ phân (tetramer) máy golgi, sau chuyển đến màng nguyên sinh chất hình thành nên lớp vỏ hạt virus (6) Đóng gói hạt virus Phân tử RNA hệ virus gắn kết với protein (NP, PB1, PB2, PA,M2), di chuyển đến màng nguyên sinh chất, nơi protein HA NA M2 tập kết dđể đóng gói hình thành hạt virus (7) Giai đoạn đâm chồi phóng thích khỏi tế bào NA đóng vai trò quan trọng việc phóng thích virus khỏi màng tế bào Protein làm gia tăng gắn kết màng nguyên sinh chất đâm chồi hạt virus 2.1.2.3 Sức đề kháng tác nhân vật lý hóa học Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Các virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu, không tồn lâu môi trường Các yếu tố vật lý sức nóng, pH thấp cao, điều kiện khô hạn bất hoạt virus cúm gia cầm Dễ bị vô hoạt dung môi hữu chất tẩy rửa 2.1.2.4 Độc lực virus: Dựa số tỷ lệ gây bệnh , tỷ lệ chết đàn gà gây bệnh… Độc lực virus cúm gia cầm định yếu tố chính: protein màng glycosylated HA (Hemagglutinin) NA (neuraminidase) Thường chia thành nhóm độc lực: độc lực cao (HPAI – High Pathogenic Avian Influenza), độc lực trung bình (MPAI – Medium Pathogenic Avian Influenza) độc lực thấp ( LPAI – Low Pathogenic Avian Influenza) 2.1.3 BỆNH DO VIRUS CÚM GIA CẦM GÂY RA 2.1.3.1 Đặc điểm dịch tễ a Loài cảm nhiễm Chim hoang vật tàng trữ mầm bệnh quan trọng xuất bệnh lâm sàng khả đề kháng tự nhiên Một số loài vịt, ngan, ngỗng vật mang virus loài chim nội tạng đặc biệt ruột chúng thải virus môi trường Virus cúm gia cầm gây bệnh cho nhiều loài heo, chuột lang, mèo, loài linh trưởng… b Đường truyền lây vật mang mầm bệnh Virus cúm thải môi trường thông qua chất tiết đường hô hấp, miệng, kết mạc phân c Cơ chế sinh bệnh Sự nhân lên trực tiếp virus tế bào, mô, phủ tạng Tác động gián tiếp việc sản sinh chất điều hòa tế bào cytokine Tắc mạch cục hình thành huyết khối 2.1.3.3 iệu chứng bệnh tích Footer Page 10 of 126 10 Header Page 11 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Triệu chứng: phá hủy nhiều quan phủ tạng, tim mạch thần kinh mức độ khác nhau: run rẩy đầu cổ, rối loạn vận động, uu3 rũ, giảm ăn uống, liệt, rối loạn tiền đình… Bệnh tích: hoại tử, xuất huyết, phù phủ tạng da Hầu hết HPAI gây hoại tử điểm lách, tim, tuyến tụy… phổi viêm phù, xung huyết xuất huyết Túi Bursa tuyến ức thường bị teo 2.1.3.4 Miễn dịch Gia cầm nhiễm virus tiêm vaccine cúm gia cầm kích thích đáp ứng miễn dịch cục niêm mạc miễn dịch toàn thân Mức độ đáp ứng miễn dịch virus cúm gia cầm thay đổi tùy loài: gà > gà lôi > gà tây > cút > vịt Sau ngày gây nhiễm, chủ yếu thấy xuất IgM IgG Đáp ứng sinh kháng thể từ protein bề mặt ( HA NA) kháng thể trung hòa có tính đặc hiệu cao Kháng thể HI ngăn cản hoàn toàn thải virus bên ngoài, kháng thể Ni làm giảm thải virus Miễn dịch cuả protein bên rút ngắn giai đọan nhân lên thải virus 2.1.3.5 Chẩn đoán: a Chẩn đoán lâm sàng: dựa vào dịch tễ, triệu chứng bệnh tích bệnh b.Chẩn đoán phòng thí nghiệm: hỗ trợ kết luận nguyên nhân gây bệnh xác Phát virus: Phát protein RNA virus trực tiếp từ mẫu mô: Miễn dịch mô gắn kết enzyme sử dụng kháng thể đơn dòng, miễn dịch huỳnh quang (FA) mẫu mô phết kính, ELISA, RT-PCR real-time PCR… Phân lập virus trứng gà có phôi 9-11 ngày tuổi cách tiêm xoang niệu mô, tế bào thường trực (cell line) MDCK Vero tế bào sơ cấp CEF thận gà Footer Page 11 of 126 11 Header Page 12 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Phát kháng thể: Sử dụng phản ứng huyết học ELISA, AGID, HI, miễn dịch huỳnh quang 2.1.3.6 hòng chống bệnh cúm gia cầm Ngăn ngừa kiểm soát bệnh Giám sát bệnh chặt chẽ để phát sớm báo cáo dịch Tăng cường an toàn sinh học trại chăn nuôi gia cầm Kiểm soát vận chuyển gia cầm sản phẩm Thay đổi phương thức chăn nuôi Tiêu hủy nhanh gia cầm bị bệnh có nguy bị bệnh Chủng ngừa: tiêm vaccine Footer Page 12 of 126 12 Header Page 13 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA Giới thiệu chung kỹ thuật ELISA ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) kỹ thuật sinh hóa để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫu xét nghiệm Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nông nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an toàn chất lượng sản phẩm sinh học Nguyên lý ELISA dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể Kỹ thuật ELISA chia thành loại: ELISA trực tiếp nhằm tìm kiếm kháng nguyên (ELISA capture ELISA sandwich) ELISA gián tiếp nhằm tìm kiếm kháng thể (indirect ELISA cạnh tranh = competitive ELISA) Sự liên kết kháng nguyên_kháng thể phát cách thêm chất phản ứng tạo màu xúc tác enzyme Enzyme thường dùng để đánh dấu : peroxidase, beta_galactoxidase, alkaline phosphatase, Mẫu dương tính có diện kháng nguyên hay kháng thể mẫu đượcc giữ lại khay xét nghiệm cho phản ứng tạo màu thêm chất Khả ứng dụng ELISA Ưu điểm quan trọng phương pháp ELISA độ nhạy cao, phát phức hợp nhỏ kháng nguyên- kháng thể, cho phép phát sớm tác nhân gây bệnh giai đoạn sớm mầm bệnh xâm nhiễm (cho phép phát lượng kháng nguyên virus nhỏ 1ng/ml) Footer Page 13 of 126 13 Header Page 14 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Dùng để phát nhiều loại protein, nhận diện virus, vi khuẩn, số hợp chất phân tử lượng nhỏ nhiều mẫu sinh học khác ELISA thuận tiên cho chẩn đoán xét nghiệm số lượng mẫu lớn Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật ELISA: Lấy mẫu bảo quản mẫu: Dùng tăm lấy mẫu dịch khí quản mẫu phân lỗ huyệt gia cầm sống chết Sau tăm bong cho vào môi trường vận chuyển vô trùng chứa kháng sinh để ức chế vi khuẩn phát triển Một số loại bệnh phẩm khác: mô (gan, lách, thận, tụy, não…) đặt vào túi plastic vô trùng Để kiểm tra virus quan thu thập bảo quản riêng mô đường ruột đường hô hấp Nếu thực xét nghiệm mẫu vòng 48 sau thu thập bảo quản 4oC, Nếu mẫu giữ lâu bảo quản -70oC TRước kiểm tra virus, mô nên nghiền thành huyễn dịch 5-10% môi trường bận chuyển lắng lọc ly tâm với tốc độ thấp Những điều cần thiết để làm thử nghiệm: Kháng thể tinh (Purified antibody- muốn phát hay định lượng kháng nguyên Dung dịch chuẩn (đối chứng dương âm) Mẫu để kiểm tra Dung dịch rửa (buffer) Kháng thể có gắn enzyme chất enzyme Máy đọc phản ứng PCR (spectrophotometer) a Phát kháng nguyên: Bản chất kháng nguyên cúm gia cầm phụ thuộc vào hai yếu tố H N Vì để phát virus cúm gia cầm đồng thời phân biệt loại subtype kháng nguyên virus cúm ta phải cần kit lần xét nghiệm Footer Page 14 of 126 14 Header Page 15 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Lần 1: Xác định yếu tố HA (Hemaglutinin) Lần 2: Xác định yếu tố NA ( Neuraminidase) Phương pháp: dùng ELISA trực tiếp (direct ELISA) Nguyên tắc: Nếu kháng nguyên diện mẫu gắn với kháng thể sơ cấp (đã gắn vào bề mặt cứng giếng), kháng thể thứ cấp (gắn enzyme) bổ sung vào gắn với kháng nguyên kháng thể thứ cấp không gắn bị rửa trôi trình rửa Khi bổ sung chất tương ứng với enzyme, chất không màu chuyển thành có màu Nếu kháng nguyên không diện mẫu màu Các bước tiến hành: (1) Người ta gắn kháng thể biết trước lên giá thể (2) Cho dung dịch mẫu chẩn đoán đối chứng cho vào giếng (3) Ủ điều kiện nhiệt độ thời gian định (tùy theo kit nhà sản xuất) (4) Rửa (5) Bổ sung kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần xác định có gắn enzyme đánh dấu (6) Ủ điều kiện nhiệt độ thời gian định (tùy theo kit nhà sản xuất) (7) Rửa mẫu (8)Cho chất tương ứng với enzyme (9) Dung dịch dừng phản ứng (10) Đọc so màu Footer Page 15 of 126 15 Header Page 16 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Direct ELISA: nhanh, tránh phản ứng chéo kháng thể thứ cấp với thành phần mẫu Tuy nhiên direct ELISA đòi hỏi đánh dấu tất kháng thể sử dụng=> tốn thời gian, chi phí Thêm vào số kháng thể không phù hợp với việc đánh dấu trực tiếp Phương pháp trực tiếp thường thiếu khuyếch đại tín tín hiệu thêm vào mà đạt với việc sử dụng kháng thể thứ cấp b Phát kháng thể: phát kháng thể vòng tuần sau nhiễm Bản chất kháng nguyên cúm gia cầm phụ thuộc vào hai yếu tố H N virus cúm xâm nhập vào thể kích thích thể tạo loại kháng thể trung hòa tương ứng với yếu tố HA NA có tính đặc hiệu cao HA kích thích thể tạo kháng thể HI NA kích thích thể tạo kháng thể NI Footer Page 16 of 126 16 Header Page 17 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Vì ta phải dùng kit ELISA, chẩn đoán lần: Xác định kháng thể kháng HA trước sau kháng thể kháng NA Phương pháp chẩn đoán: dùng ELISA gián tiếp Nguyên tắc: Nếu kháng thể diện mẫu gắn với kháng nguyên cố định với bề mặt rắn giếng Sau kháng thể thứ hai (được gắn với enzyme) cho vào giếng có diên kháng thể cần kiểm tra gắn vào kháng thể này, không bị rửa trôi trình rửa, bổ sung chất (không màu) => enzyme chuyển có màu Nếu diện kháng thể mẫu kháng thể thứ hai bị rửa trôi trình rửa => màu bổ sung chất Các bước tiến hành (1) Các kháng nguyên biết trước (purified antigen) gắn giá thể (các giếng vỉ nhựa màng lai…) (30-60 phút) (2) Dung dịch mẫu chẩn đoán đối chứng cho vào giếng (3) Ủ điều kiện nhiệt độ thời gian định (tùy theo kit nhà sản xuất) (4) Rửa (5) Bổ sung kháng thể có gắn enzyme (6) Ủ điều kiện nhiệt độ thời gian định (tùy theo kit nhà sản xuất) (7) Rửa mẫu (8) Bổ sung chất tương ứng với enzyme (9) Dung dịch dừng phản ứng (10) Đo OD thực phản ứng so màu Footer Page 17 of 126 17 Header Page 18 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Indirect ELISA to detect specific antibodies Indirect ELISA: kháng thể thứ cấp (được đánh dấu) sử dụng rộng rãi với nhiều kháng thể sơ cấp (vd: all mouse monoclonal antibodies – tất kháng thể đơn dòng chuột) Việc sử dụng kháng thể thứ cấp gia tăng độ nhạy phản ứng (do khuyếch đại tín hiệu thêm vào) Một số ví dụ kit phát kháng thể Kit ELISA phát kháng thể kháng virus cúm typ A (Avian influenza virus antibody test kit, Idexx laboratories, USA) Thành phần ✓ AI coated plate: đĩa 96 giếng gắn kháng nguyên virus cúm ✓ AI positive control: huyết dương tính với virus cúm chuẩn ✓ Negative control: huyết âm tính với virus cúm chuẩn ✓ (goat) Anti-chicken/Turkey: HRPO conjugate: cộng hợp gắn horseradishperoxidase từ dê chống lại kháng thể gà gà tây ✓ Sample diluent buffer (SDB): dung môi để pha loãng mẫu huyết xét nghiệm ✓ TMP (Tetremethylbenzidine) subtrate Footer Page 18 of 126 18 Header Page 19 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA ✓ Stop solution: dung dịch dừng phản ứng Chuẩn bị (1) CÁc chất dung cho phản ứng phải đạt nhiệt độ phòng (230C +/- 20C) trước tiến hành phản ứng (2) Mẫu huyết pha loãng 1/25 (120microlit SDB + microlit mẫu huyết thanh) đĩa pha loãng mẫu Tiến hành xét nghiệm Bảng phân bố mẫu đĩa 96 giếng 10 11 12 A - - + + 1 2 3 4 B 5 6 7 8 9 10 10 … … … … … … … … … … … … … H … … … … … … … … … … … … Ghi chú: - - (A1, A2) giếng chứa huyết âm tính với virus cúm chuẩn ++ (A3, A4) GIẾNG CHỨA HUYẾT THANH DƯƠNG TÍNH VỚI VIRUS CÚM 11, 22, 33,… (A5, A6,A7,…) giếng chứa mẫu huyết cần kiểm tra (1) Mẫu đối chứng (không pha loãng) + mẫu xét nghiệm (pha loãng 1/500 với dung dịch pha loãng mẫu) cho 100microlit theo sơ đồ thích hợp vào đĩa phản ứng (2) Ủ nhiệt độ phòng 30 phút (3) Rửa 3-5 lần với nước cất (4) Nhỏ 100 microlit cộng hợp vào lỗ giếng (5) Ủ nhiệt độ phòng 30 phút (5) Rửa 3-5 lần với nước cất (6) Cho 100 microlit chất tạo màu (TMB) vào lỗ giếng Footer Page 19 of 126 19 Header Page 20 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA (7) Ủ nhiệt độ phòng 15 phút (8) Thêm 100 microlit dung dịch dừng phản ứng vào lỗ giếng (9) Đo OD đánh giá kết sau 15 phút Kit ELISA phát kháng thể kháng virus cúm –kháng HA ( Influenza A, Avian, H5, Hemagglutinin Antibody (HA) BioAssay™ ELISA Kit (Bird Flu) ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) ELISA phát kháng thể kháng HA mẫu huyết Nguyên tắc: Dựa pha rắn Nếu kháng nguyên kháng HA diện mẫu cạnh tranh với kháng thể đơn dòng kháng HA cộng hợp với horseradish peroxidease (anti-HA “mAb” HRP) với kháng nguyên chuẩn bị sẵn gắn với bề mặt rắn giếng Nếu kháng thể kháng HA diện mẫu, anti-HA “mAb” HRP gắn với HA có giếng HPR-conjugate không gắn bị loại bỏ trình rửa Cơ chất tạo màu Chromogen A and B solutions cho vào giếng, Chromogens không màu bị thủy phân (hydrolyzed) HPR-conjugate (đã gắn vào giếng) tạo thành sản phẩm có màu xanh ( a blue colored product) Màu xanh chuyển thành màu vàng dừng phản ứng với sulfuric acid Không màu biểu màu (no or low corlor) => chứng tỏ diện kháng thể kháng HA mẫu Protocol Tiền xử lý mẫu với buffer ly giải virus (pre-treat the samples with virus lysis buffer) Cho mẫu vào, 100 ul Ủ, 60 phút Rửa lần Cho HRP-conjugate, 100 ul Ủ, 30 phút Rửa lần Cơ chất tạo màu 50ul A + 50 ul B Footer Page 20 of 126 20 Header Page 21 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Ủ 30 phút Cho 50ul dung dịch dừng phản ứng Đọc phản ứng bước song 450nm 630 nm Kit components Đĩa 96 giếng Mẫu âm tính 1x1ml Mẫu dương tính 1x1ml HRP-conjugate 1x12ml Dung dịch ly giải virus 1x100ml Buffer rửa 1x50ml Chromogen A/B/ dung dịch dừng phản ứng 1x6 ml Footer Page 21 of 126 21 Header Page 22 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA KẾT LUẬN Việc chẩn đoán virus cúm gia cầm phương pháp ELISA giúp cho việc phát phân loại virus nhanh chóng dễ dàng Đây phương pháp đơn giản, đặc hiệu, nhạy nhanh Đồng thời ta xét nghiệm số lượng mẫu lớn Phát cúm gia cầm ELISA giúp tầm soát nguồn bệnh tốt Do phương pháp ứng dụng rỗng rãi thực tế đại dịch cúm bùng phát diện rộng Footer Page 22 of 126 22 Header Page 23 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA TÀI LIỆU THAM KHẢO Công nghệ sinh học thú y 2007 Nguyễn Ngọc Hải Khảo sát số đặc tính sinh học chủng virus cúm gia cầm NIBRG-14 subtyp H5N1 Nguyễn Văn Dung http://www.sanidadanimal.info/cursos/inmun/quinto1.htm http://www.currentprotocols.com/print/49908 http://www.proteopedia.org/wiki/index.php/Avian_Influenza_Neuramini dase,_Tamiflu_and_Relenzawww.khoahoc.com.vn http://en.wikipedia.org/wiki/Bird_flu http://thuvienkhoahoc.com/tusach/H%C3%ACnh:Microtiter.jpg http://www.komabiotech.co.kr/www/techniques/immunodection/elisaProtocol.htm l http://www.nature.com/nrd/journal/v6/n12/fig_tab/nrd2400_F2.html http://wisdom.eu-egee.fr/avianflu/pictures/ http://www.fluwiki.info/pmwiki.php?n=Consequences.NeuraminidaseInhibitors http://www.scientificpsychic.com/health/virus.html Footer Page 23 of 126 23 Header Page 24 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA Footer Page 24 of 126 24 ... Header Page 13 of 126 Chẩn đoán virus cúm gia cầm ELISA CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA Giới thiệu chung kỹ thuật ELISA ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) kỹ thuật sinh hóa để phát... 2.1.3.5 Chẩn đoán a .Chẩn đoán lâm sàng b .Chẩn đoán phòng thí nghiệm 2.1.3.6 Phòng chống bệnh cúm gia cầm Chương 3: CHẨN ĐOÁN CÚM GIA CẦM BẰNG KỸ THUẬT ELISA. .. cúm gia cầm áp dụng nhằm hạn chế lây lan phát tán mầm bệnh Vì việc phát hiện, chẩn đoán virus cúm gia cầm cách có hiệu quả, nhanh, xác, rẻ tiền vấn đề thiết “ Chẩn đoán virus cúm gia cầm kỹ thuật