Chẩn đoán vi khuẩn listeria bằng kỹ thuật gen

Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Trng i Hc Nụng Lõm Thnh ph H Chớ Minh B mụn Cụng Ngh Sinh Hc Lp DH06SH Tiu lun: CHN ON BNH GIA SC GIA CM CHN ON VI KHUN LISTERIA BNG K THUT GEN GVHD: Nguyn Ngc Hi Sinh viờn thc hin: Phm Ngc H MSSV: 06126033 Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn I T VN Trong s sỏu loi Listeria c bit n thỡ Listeria monocytogenes v Listeria ivanovii l nhng tỏc nhõn gõy bnh Nhng Listeria ivanovii rt him gõy bnh cho ngi v ng vt, trỏi li Listeria monocytogenes li gõy bnh Listeriosis rt ph bin c ngi v ng vt õy l mt loi bnh thc s nguy him vỡ nú cú th dn n t vong, c bit l i vi nhng ngi cú h dch yu nh ph n cú thai, tr s sinh, ngi gi yu Mc khỏc Listeria monocytogenes li tn ti thc phm nờn rt d lõy nhim cho ngi ũi hi phi cú cụng tỏc kim nghim thc phm kht khe i vi vi khun ny Thụng thng chun oỏn vi khun thng ỏp dng k thut nuụi cy phõn lp trờn mt s mụi trng chuyờn bit v xỏc nh vi khun thụng qua cỏc phn ng sinh húa Nhng i tng thao thỏc l trờn thc phm nờn s dng phng phỏp truyn thng l rt khú khn, tn kộm v mt thi gian Nh vy m cỏc k thut gene vi nhng u im ni tri nh nhanh, nhy, chớnh xỏc ó c s dng chun oỏn Listeria monocytogenes II TNG QUAN: II.1 ụi nột v Listeria: Ging vi khun Listeria thuc tc Lactobacilleae gm nhng trc khun nh, khụng sinh bo t, cú lụng mt u nờn cú th di ng, gam dng, cú phn ng catalase dng tớnh, oxydase õm tớnh Hiu khớ hoc ym khớ tựy ý v cú kh nng lờn men ng Ging ny gm nhiu loi gõy bnh cho gia sỳc v ngi, ú cú loi Listeria monocytogenes l loi gõy bnh sy thai truyn nhim cu v lm tng s bch cu n nhõn mỏu ca nhiu loi ng vt nh bũ, nga, dờ, cu, heo, chut, k c ngi II.1.1 Phõn loi: ging Listeria bao gm loi Listeria monocytogenes L innocua L ivanovii L seeligeri L welshimeri L grayi II.2 Gii thiu chung v Listeria motocytogenes Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn II.2.1 ng ngha v lch s Listeria monocytogenes ó c phõn lp t mu bnh phm ng vt nm 1926 bi Prior, nhng lỳc ú cha cú c tớnh chớnh xỏc xỏc nh nú Cng nm ú L monocytogenes ó c khỏm phỏ bi E.G.D Murray, Wenn v Swam nm 1926 t chut lang v th b viờm gan hoi t v cú tờn l Bacterium monocytogenes.Nm 1927, vi sinh vt ny cng c Pirie phõn lp t gan bi bnh ca chut nhy (tatera tobengulae) ti nam Chõu Phi, v c t tờn l Listeria hepalolytica Khi s tn ti ca vi sinh vt ny c xỏc minh, L monocytogenes chớnh thc c Bergay t tờn vo nm 1957 II.2.2 Phõn b v cỏch lõy lan L monocytogenes c phõn b rt rng rói, nú cú t, nc, phõn, dch tit ng sinh dc v niờm mc mi ca ng vt kheRau c cú th nhim khun t t hoc t phõn bún Sỳc vt nụng tri cú th nhim khun m khụng cú triu chng gỡ v thc phm t ng vt nh tht, tht gia cm v cỏc sn phm sa cú th b nhim khun Theo S giỏm sỏt v an ton thc phm thuc B nụng nghip, nhng trng hp bnh Listeriosis M u liờn quan n thc phm xỳc xớch nh xụng khúi, tht hp ti ngon, patờ lnh, xỳc xớch í, phỏt mm ca Phỏp, mỏt mm kiu Mờhicụ, tụm, b, rau qu ti v sa cha tit trựng Trn dch bnh bựng phỏt cú th liờn quan n sũ hn tụm cua, cỏ ti, thy sn xụng khúi, li heo, kem, x lỏch go, x lỏch ci bp v patờ tht Do ú, ngi cú nguy c nhim khun L monocytogenes cc k cao vi cỏc loi thc phm cha nu chớn k trc n v cỏc loi thc n lm sn Bnh th hin nhiu dng v s lõy truyn ca vi khun cú khỏc Nu nh dng ph tng, s lõy nhim qua ng n ung Nu nh dng thn kinh ch yu lõy nhim qua ng mt v mi II.2.3 Hỡnh thỏi v nhum mu L monocytogenes gm nhng trc khun ngn, hai u trũn, Gram dng Trong mụi trng nuụi cy, t bo cũn non L.monocytogenes c tỡm thy dng trc khun Nhng tr hn dng hỡnh cu (0,5àmì1-2 àm) li chim u th, ụi vi khun xp thnh chui ngn(d nhm vi Streptococcus), lỳc ny chiờm mao di 6-20 àm Vi khun khụng sinh bo t, khụng to giỏp mụ, cú kh nng di ng 20-250C vi khun di ng mnh nht 370C vi khun di ng nh mt chiờm mao u Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Khi nhum t mụ bnh hoc dch nuụi cy, ụi vi khun cú dng hỡnh cu xp chui d nhm vi Streptococci Trong trng hp ny cú th dựng phn ng Catalase phõn bit Trong canh 3-6 gi 370C vi khun cú dng trc, nuụi cy 3-5 ngy vi khun cú dng di 6-20 àm hay hn(c bit chng R) S di ng ca Listeria dựng phõn bit vi Erysipelothrix II.2.4 c tớnh nuụi cy v yờu cu tng trng Vi khun cú th phỏt trin iu kim ym khớ Nhit thớch hp 30-370C, pH 7,2-7,4 phỏt trin trờn mụi trng nhng thng s dng mụi trng thch mỏu iu kin 5-10% CO2 cho khun lc trũn búng, mu trng, ng kớnh 0,5-1mm v gõy dung huyt Trờn mụi trng Trytose agar to khúm sỏng, trng m v cú mu xanh lam (mu bluegreen) quan sỏt di ỏnh sỏng nghiờng Trờn mụi trng LSA (Listeria selective agar) to vũng en quanh khúm s phõn gii Esculin sau 24-48 gi Mụi trng Gelatin khụng gõy tan chy II.2.5 c tớnh sinh húa Lờn men chm cỏc loi ng nh glucose, rhamnose, salicin, levulose Khụng lờn men mannitol, xylose, lactose, saccarose Phn ng Catalaza dng tớnh II.2.6 Sc khỏng Khi tin hnh phõn tớch chn oỏn Listeriosis v kho sỏt ngun nhim khun thỡ thy rng vi khun ny cú th tn ti thi gian di lõu cú th l 90 ngy t n phi thc phm nhim khun v xut hin triu chng Thi gian trung bỡnh t nhim khun vo c th n phỏt bnh khong 30 ngy Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Vi khun ny rt bn Nú khỏng nhit (mc du nhit khụng cao, di 600C), mui, nitrite v acid, sng sút iu kin lnh ụng v thm cú th sinh sụi phỏt trin chm chp t lnh( khong 40C) Vi khun b dit 600C 30 phỳt v 720C 15 giõy Vi khun khỏng vi s khụ hn Cú th sng sút thc phm v t nhng b dit bi nhng cht sỏt trựng thụng thng Nhay cm vi nhiu loi khỏng sinh nhng tetracycline cho kt qu tt nht Ngi ta cú th kt hp gia Trimethoprim vi Sulphamethazol iu tr, vi khun khỏng li vi Quinolones Erythromycine, ampicillin c dựng iu tr bnh cho ngi II.2.7 Cu trỳc khỏng nguyờn v c t Cu trỳc khỏng nguyờn ca L.monocytogenes phc tp, c chia thnh 16 serotype cn bn da trờn khỏng nguyờn O v H Khỏng nguyờn O: Bn vi nhit c chia thnh 14 loi, ký hiu 1-14 Khỏng nguyờn H: Khụng bn vi nhit, chia lm loi:a, b, c, d Hin cú chng l nguyờn nhõn gõy bnh chớnh cú cu trỳc khỏng nguyờn l: 1/2a; 1/2b; 4b SEROTYPE ANTIGENS O(HEAT STABLE) H(HEAT LABILE) I, II, (III) A, B 1a I, II, (III) A, B, C 1b I, II, (III) B, D II, (III), IV A, B 3a II, (III), IV A, B, C 3b A, B, C 4a (III), (V), VII, IX A, B, C 4b (III), V, VI A, B, C 4ab (III), V, VI, VII, IX A, B, C 4c (III), V, VII A, B, C (III), VI, VIII 4d (III), V, VI, VIII, IX) 4e A, B, C c t Vi khun sn sinh men hemolysinase cú tớnh khỏng nguyờn protein Cytolysin cú tỏc dng dit t bo Trờn b mt ca t bo vi khun cũn cú lipo-polysaccharid c i vi th II.2.8 Kh nng lõy bnh Trong t nhiờn vi khun gõy bnh Listeriosis v dng thn kinh ụi c gi l bnh quay mũng(circling disease) ph bin nht i vi ng vt nhai li nh bũ, cu c bit vo ụng v u xuõn vi mi la tui i vi dng ph tng thng gp ng vt d dy n Bnh cú th gõy sy thai nga Ngoi vi khun cũn gõy bnh cho gia cm v cỏ ngi thng gp sy thai, thai cht v viờm nóo vi ng vt th hin s gia tng bch cu n nhõn Trong phũng thớ nghim: Dựng th v chut lang Chut nhy cm, cht sau tiờm nhim 48 gi vi bnh tớch hoi t gan Dựng test ANTON gõy viờm kt mc mt Mt bnh L.monocytogenes Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Viờm mng nóo m, hay viờm mng nóo nhim khun, l hin tng viờm ca cỏc mng bao bc quanh h thn kinh trung ng (nóo v ty sng) s hin din ca cỏc vi khun gõy bnh khoang dch nóo ty S viờm nhim ny s gõy nờn tỡnh trng sinh m bờn h thng thn kinh trung ng Nhng bnh nhõn suy gim dch nh ngi gi, tr s sinh, bnh nhõn iu tr thuc c ch dch, AIDS thng cú nguy c b bnh Viờm mng nóo m s sinh tỏc nhõn ny thng nm bi cnh nhim trựng huyt nng Cỏc du hiu nghi ng trờn lõm sng l: m thng cú st, sinh non khụng rừ nguyờn nhõn, thai cú tn thng ht II.2.9 C ch gõy bnh T lõu cỏc nh khoa hc ó phỏt hin rng vi khun Listeria lõy lan t t bo ny sang t bo khỏc c th ngi Vi khun ln lờn mt t bo v di chuyn nhanh chúng to thnh mt cu trỳc theo hỡnh ngún tay nhụ t t bo v y sang t bo lin k Khi ú vi khun s tip tc gõy bnh cho t bo lin k ú Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Hamon et al Nature Reviews Microbiology 4, 423434 (June 2006) | doi:10.1038/nrmicro1413 a | L monocytogenes i vo t bo nh th thc bo b | Vi khun bờn khụng bo (c bit nh l th thc bo) c,d | Mng ca khụng bo b phỏ v bi s tit hai loi phospholipases: PlcA v PlcB, and c t listeriolysin O Vi khun c gii phúng t bo cht, ni chỳng c nhõn lờn nhiu ln v bt u vi s trựng hp actin) e | S trựng hp actin cho phộp vi khun to thnh mt cu trỳc theo hỡnh ngún tay nhụ t t bo v vo t bo cht t bo lin k f |Trong t bo bờn cnh, vi khun hin din mng kộp khụng bo t ú chỳng cú th thoỏt s trỡ ca chu k Giỏo s Ireton v nhúm ca ụng ó phỏt hin mt quỏ trỡnh th hai h tr vic lõy lan ca vi khun sang nhng t bo khe mnh m trc õy cha tng c bit n Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Quỏ trỡnh ny dn dn ó lm suy yu kh nng t v vic nhim bnh ca t bo th hai v ó xut hin ln xut bn tun ny ca khoa hc Nature Cell Biology Vi khun Listeria di chuyn qua t bo cht ca t bo c th ngi s dng mt phn ca khung t bo gi l cỏc si actin, Vi khun Listeria cú my xanh v si actin mu Qua nh cú th nhn thy rng si actin hỡnh thnh mt cu trỳc dng uụi phớa sau vi khun Nhng si actin ny cú tỏc dng y Vi khun Listeria qua t bo cht ca t bo c th ngi Nhng mi tờn nh cho thy mt vi khun ang chuyn ng t bo cht (nh: Keith Ireton) Mng t bo, hay lp ngoi cựng ca nhng t bo khe mnh thụng thng cng Tỡnh trng cng ú c k vng l cú tỏc dng ngn chn vi khun khụng lõy lan sang nhng t bo cha nhim bnh lin k Tuy nhiờn, phũng thớ nghim ca giỏo s Ireton phỏt hin rng mt loi pro-tờ-in vi khun Listeria gi l InIC xut hin lm gim i cng ca mng t bo nhng t bo nhim bnh, iu ny s lm cho vic di chuyn ca vi khun xuyờn thng mng t bo v sau ú lõy lan sang cỏc t bo khe mnh lin k d dng hn Phũng thớ nghim ca giỏo s Ireton cng a bn bỏo cỏo cho thy cỏch m InIC lm gim cng l ngn chn chc nng ca protein Tuba c th ngi Thụng thng, chc nng ca Tuba t bo ngi khụng nhim bnh l to cng ca mng t bo Protein InIC vi khun Listeria ó khng ch s hot ng ca Tuba, lm gim cng v giỳp vi khun lõy lan sang cỏc t bo lin k II.2.10 Min dch C th thỳ cú th hỡnh thnh dch sau nhim Min dch trung gian t bo l ch yu Hin cú hai loi vaccine cht v nhc c cú th em li kt qu Vaccine thng s dng: 1a v 4b t kt qu phũng bnh trờn cu Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn II.2.11 Chn oỏn bng phng phỏp truyn thng Bnh phm: gan, lỏch, nóo, thai bi sy Nuụi cy trờn mụi trng LSA Nhum Gram Chn khun lc Tiờm nóo th (cht sau 2-3 ngy) Test ANTON Kim tra mỏu th(Bch cu n nhõn tng 420-820/mm3) Th b nhim Listeria Nh chỳng ta ó bit s dng phng phỏp trờn rt mt thi gian( ớt nht 10 ngy), c bit i vi cụng tỏc phũng chng dch bnh hay xỏc nh nguyờn nhõn gõy bnh ngi dch bnh bựng phỏt Mc khỏc L monocytogenes rt d nhm ln vi Erysipelothrix, ú xỏc inh chớnh xỏc vi khun ny phi tip tc s dung cỏc phn ng sinh húa nh: c tớnh Listeria Erysipelothrix Di dng Catalase Phõn gii Exculin Sn sinh H2S Thch mỏu Git cht b cõu + + + + - + + II.2.12: Tỡnh hỡnh dch bnh Listeriosis Ca u tiờn ca bnh Listeriosis ó c núi n cỏch 70 nm, nhng phi i n nhng nm 1980 vi khun L monocytogenes mi c chớnh thc xỏc nhn l tỏc nhõn gõy bnh ng c t thc phm T thỏng mt n thỏng tỏm nm 1985, ti M cú mt t bựng phỏt khỏc vi 142 ca nhim bnh Listeriosis Vo nhng nm 1990, B Nụng nghip M cho bit cú mt trn dch bnh ny t bỏnh mỡ kp xỳc xớch núng v cú th l cỏc ca hng bỏn tht ngon dn n ớt nht 101 ngi b bnh khin 15 ngi ln t vong v thai nhi b sinh non Nm 1999, loi L monocytogenes c bit cc c ó tin trin bỏo ng cỏc viờn chc y t v h buc nhng nh sn xut thc phm phi gii quyt Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page 10 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Nm 2002, t bựng phỏt dch bnh Listeriosis nhiu bang M mt cn bnh nguy him vi khun Listeria gõy -ó xỏc nhn cú 46 ca nhim bnh, ca t vong v ca hng bo thai Mc dự quy nh tm thi i vi cỏc sn phm tht v tht gia cm ch bin sn phỏt hnh nm 2003 giỳp kim soỏt s bựng phỏt vi khun, nhng rừ rng ó khụng th loi b c bnh hon ton Theo Trung tõm y t d phũng CDC, c tớnh 2.500 ngi b bnh Listeriosis nng mi nm, s ú cú 500 ngi t vong Ngi cú nguy c cao cú th mc bnh ny sau n thc phm thm ch nhim vi vi khun Nm 2008 dch Listeriosis Canada nguyờn nhõn t nh mỏy Maple Leaf Foods Toronto, Ontario lm hai mi hai ngi cht v cú tng s 57 trng hp nhim bnh III CC K THUT THNG S DNG CHUN ON L.MONOCYTOGENES III.3.1 Gii thiu k thut PCR , Real-Time PCR v Multiplex PCR PCR (Polymerase Chain Reaction) l phn ng nhõn bn trỡnh t DNA quan tõm test tube K Mullis ó phỏt minh PCR vo nm 1985 Chđ nm sau, K Mullis ó nhõn giđi Noben cho phỏt minh ny Nguyờn tc: PCR l k thut invitro dựng khuch i mt trỡnh t DNA da trờn nguyờn tc ca mt phn ng sinh húa nh hot ng ca enzyme polymerse Footer PagePhm 10 ofNgc 126 H 10 Header Page 11 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn ADN ớch 1 Bin tớnh (94o C) 2 Bt cp (55-65o C) 3 Kộo di (72o )C) n Nguyờn liu:DNA quan tõm, enzyme tng hp DNA chu nhit, on mi nucleotide, loi dNTP, dung dch m cho phn ng, Mg2+ Cỏc bc thc hin: - Giai on 1: bin tớnh (denateration), nhit 94-950C 30-60s - Giai on 2: bt cp (annealation), nhit 40-700C - Giai on 3: kộo di (elongation), nhit 720C 1-2 phỳt Qui trỡnh t hđc hiđn xột nghiđm PCR Chuđn bđ mđu, ly trớch DNA/RNA Ly tõm v un núng Thđc hiđn phđn đng PCR mỏy luõn nhiđt Footer PagePhm 11 ofNgc 126 H 11 Header Page 12 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Chn chng trỡnh chu k nhit Phỏt hiđn sđn phđm khuđch in di,quan sỏt v chp nh Mt phn ng PCR bỡnh thng khụng vt quỏ 40 chu k l tt nht phn ng PCR, sn phm c to theo cp s nhõn trờn c s nhng sn phm ban u nờn nu s chu k khuch i quỏ ln s lm cho sn phm cng b sai lch so vi sn phm ban u Real Time PCR l phn ng PCR m quỏ trỡnh nhõn bn DNA ang din theo tng chu trỡnh nhit c theo dừi trc tip Thc cht, h thng Real Time PCR gm mỏy luõn nhit (PCR) c ni vi mỏy quang ph hunh quang v mỏy vi tớnh Mỏy vi tớnh Quang ph hunh quang Mỏy luõn nhit Real Time PCR gm hai quỏ trỡnh din ng thi: nhõn bn DNA bng phn ng PCR v o phỏt hunh quang t l thun vi s lng on DNA to thnh Footer PagePhm 12 ofNgc 126 H 12 Header Page 13 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Qui trỡnh thđc hiđn Real time PCR Chđn bđ mđu, ly trớch DNA/RNA Ly tõm v un núng Thđc hiđn phđn đng PCR v phõn tớch bỏo cỏo kđt quđ trờn hđ thđng real time PCR Chn chng trỡnh real-time PCR iCycler iQ Cỏc khỏi nim: Chu k ngng (Ct)l chu k m ti ú sn phm khuch i ó c to tớn hiu hunh quang cú th c phỏt hin Melt-curve: ng cong núng chy Bng cỏch no cú tớn hiu Real- Time PCR, bit phn ng PCR ang xy ra: Phm nhum chốn vo si ụi DNA s phỏt hunh quang mnh hn khhi trng thỏi t Ethidium bromide sỏng gp 25 ln SYBR green sỏng 200 ln Probe c hiu cú gn cht phỏt hunh quang ch phỏt sang cú bt cp vi trỡnh t ớch.: Beacon, Taqman Footer PagePhm 13 ofNgc 126 H 13 Header Page 14 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn SYBR GREEN L thuc nhum liờn kt DNA c s dng rng rói nht hin nay,liờn kt khụng c hiu vi DNA mch ụi SYBR Green I ch phúng thớch mt lng nh tớn hiu hunh quang nú dung dch, nhng tớn hiu hunh quang s tng gng 1000 ln nú liờn kt vi DNA mch ụi Nh vy, tớn hiu hunh quang tng t phn ng s t l vi lng DNA mch ụi hin din, v gia tng trỡnh t mc tiờu c khuch i Thuc nhum liờn kt DNA phn ng Real-Time PCR Tớn hiu hunh quang gia tng rừ rt phõn t thuc nhum liờn kt vi DNA mch ụi Nhng u im v khoa hc v thc tin s thỳc y bn c gng thc hin phn ng multiplex, phn ng khuch i nhiu hn mt mc tiờu ng phn ng n Hin nay, ta cú th khuch i v nh lng nhiu nht l mc tiờu cựng ng phn ng vi nhng u im l: Gim lng mu cn thit ban u, iu ny quan trng lng mu ban u hn ch Gim hin tng õm tớnh gi, nu mt mu i chng c khuch i mi mu Gia tng s lng thớ nghim thc hin ng thi gim tiờu tn húa cht phn ng Gim m mc thp nht vic tỏc ng n mu v nguy c lõy nhim phũng thớ nghim III.3.2 Gii thiu v k thut dch t phõn tỏch (Immunomagnetic separation-IMS) Nguyờn tc ca phng phỏp IMS: Cỏc ht nha ng dng, siờu thun t, phõn tỏn riờng r c bao bc vi phi t c hiu vi mc tiờu c bit Vớ d nh khỏng th vi b mt khỏng nguyờn Footer PagePhm 14 ofNgc 126 H 14 Header Page 15 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Cỏc ht di ng s gn vi mc tiờu, nh t tớnh ca chỳng, to thnh mt phc hp mc tiờu-ht Mc tiờu s d dng phõn lp t mu s dng cỏc ht t tớnh trung (MPC) Tớnh linh ng: IMS cú th c biu hin hn hp mu c cung cp mu thớch hp c x lý trc nh: Thc phm Nc Phõn Mỏu t Tớnh linh hot:IMS c s dng vi nhiu h thng xỏc nh Mụi trng t bo PCR ELISA ATP Luminometry(mỏy c hunh quang) Microscopy(kớnh hin vi) Cỏc bc thc hin IMS: Chun b mu trc Cho 1ml dung dch mu v 20àl ht t vo ng ly tõm 10 phỳt ti nhit phũng Thc hin phõn tỏch dch vi cỏc ht t tớnh trung MPC-S Ra vi dung dch m PPS Tween Thu hi cỏc ht t 100 àl dung dch t Ngoi ta cú th s dng AIMS, tt c cỏc bc u t ng ta ch cn cho mu vo v cho mỏy hot ng III.4 Chun oỏn Listeria monocytogenes bng k thut gene Cỏc loi Listeria u cú gene chung: gene DTH-18 ( Miờu t bi Wernars et al), gene listeriolysin O (hly A) v iap Gen iap mó húa cho protein p60, thng gp tt c loi Listeria, gene ny c bo tn v c hiu cho loi P60 ca Listeria monocytogenes, cn thit cho s bỏm cht ca sinh vt ny vo t bo eukaryotic v bo v vi khun ny Vic xỏc nh s hin din ca vi khun Listeria bng k thut PCR vỡ vy da trờn s nhõn lờn c hiu ca on gene ny Phõn lp L.monocytogenes t phụ mai: S dng phng phỏp Magnetic ImmunoPolymerase Chain Reaction (MIPA), kt hp IMS v PCR Da trờn gene DTH-18 v listeriolysinO 25g phụ mai ng nht vi 225ml dung dch tng sinh Listeria(LEB)-lm giu mu ln => Ly 0,1ml chuyn qua 10ml canh Fraser (Oxoid) v 24 gi 300C lm giu mu ln 2=>thu nhn t bo bng IMS => Ly 10àl thc hin phn ng PCR S dng primer c chn t mt v trớ ca gen listeriolysin O (gene ny cú mt phn nh trỡnh t trờn Streptolysin v pneumolysin) Primer 1: 5-CTAATCAAGACAATAAAATC-3 Gia v trớ 536bp v 555bp Footer PagePhm 15 ofNgc 126 H 15 Header Page 16 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Primer 2: 5-GTTAGTTCTACATCACCTGA-3 Gia v trớ 1037bp v 1056bp Hn hp phn ng PCR 100àl bao gm 10nM Tris HCl (pH=8.3), 50mM KCl, 1.5mM MgCl, 0.001% (Wt/vol) gelatin, 100àM mi loi dNTP, 0.5àM mi primer v 1.25U Taq polymerase Phn ng PCR c thc hin 30 chu k, mi chu k bao gm bc bin tớnh 940C/1 phỳt, bt cp 500C/1 phỳt, kộo di 720C/1 phỳt Sn phm to thnh c in di trờn gel agarose 1% nhum ethidium bromide hoc c lc bng Z-probe(Bio-Rad) v lai vi DNA probe mó húa cho gene DTH-18 Probe listeriolysin O c ỏnh du s dng PCR iu kin tng t nh miờu t trờn ngoi tr 100àl th tớch phn ng cha 90àM dNTP v 10àM digoxigenin-dUTP PCR da trờn gene listeriolysin O dựng xỏc nh kiu huyt 4a Footer PagePhm 16 ofNgc 126 H 16 Header Page 17 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Sn phm ca phn ng khuch i PCR t mu phụ mai cú cha Listeria monocytogenes sau ó lm giu mu (A) 1àl mu (lane n lane 4), 2àl mu (lane n lane 11) t dung dch lm giu mu (B) kt qu PCR sau thc hin dch t phõn tỏch(IMS) ca 100àl mu Listeria (lane n lane 4) Trc lm giu mu, 25g phụ mai phõn tớch cha (Bng A,lane v Bng B, lane 1), 0.4 (Bng A, lane v Bng B, lane 2), (Bng A, lane v 10 Bng B, lane 3), 40 ( Bng A, lane v 11 Bng B, lane 4) CFU/g phụ mai Lane khụng cha L monocytogenes S kim tra khng nh cha 0,05àg DNA L.monocytogenes tinh khit (lane 5) Phage lambda DNA Pst I s dng lm cht ch th phõn t (lane7) Footer PagePhm 17 ofNgc 126 H 17 Header Page 18 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Sn phm ca phn ng khuch i PCR t mu phụ mai c lm giu ln v (A) 1àl mu (lane n lane 4), 2àl mu (lane n lane 11) t dung dch lm giu mu ln (B) Kt qu thc hin PCR sau IMS ca 100àl mu Listeria (lane n 4) Trc lm giu mu, 25g phụ mai phõn tớch cha (Bng A,lane v 11 Bng B, lane 4), (Bng A, lane v 10 Bng B, lane 1), 10 (Bng A, lane v Bng B, lane 2), 100 ( Bng A, lane v Bng B, lane 3) CFU/g phụ mai Lane khụng cha L monocytogenes S kim tra khng nh cha 0,05àg DNA L.monocytogenes tinh khit (lane 5) Phage lambda DNA Pst I s dng lm cht ch th phõn t (lane7) Tuy nhiờn, theo Wernors et al, trỡnh t 300bp ca gene DTH-18 khụng xỏc nh c L.monocytogenes kiu huyt 4a-kiu huyt khụng thng c phỏt hin nhng trn dch bnh Listeriosis Vy phng phỏp MIPA xỏc nh L.monocytogenes Xỏc nh L.monocytogenes bng k thut lc, IMS v Real-Time PCR S dng hai dũng nghiờn cu: dũng cú c lc cao cú serotype 4b(CCUG 3998) c phõn lp t dch thn kinh ty sng ca ngi v dũng cú c lc thp hn, c phõn lp t cỏ hi xụng khúi T bo vi khun c phỏt trin qua ờm canh brain heart infusion(BHI)(Oxoid, London, England) 300C Thu nhn t bo L.monocytogenes bng ly tõm 7000vũng/phỳt Footer PagePhm 18 ofNgc 126 H 18 Header Page 19 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn v bng dung dch phosphate buffer saline(PBS) cú cha 150mM NaCl v 10mM Na2SO4 pH=7.2=>Pha loóng 10 ln dung dch NaCl 0.9% T bo cú th m c tri 100àl trờn a chromogenic Listeria agar( mụi trng hỡnh thnh sc t)(OCLA, Oxoid, Basingstoke, England) v 48 gi ti 370C Phõn lp chn lc v trung L.monocytogenes mụi trng t nhiờn s dng IMS Trong mụi trng BHI vi nng L.monocytogenes gim dn (10^8, 10^7, 10^6, 10^5, 10^4, 10^3, 10^2, 10^1 CFU/ml) c thu nhn bng ht t Dynabeads antiListeria (DynalBiotech, Oslo, Norway)(Uyttendaele et al, 2000) 20àl ht Anti-Listeria c thờm vo 1ml dung dch cha t bo vi khun, 10 phỳt nhit phũng cú khuy trn nh Mu c t hn hp ht t trung(Dynal MPC-M, Dynal Biotech) phỳt=> gii bng non-bufferred peptone water (0,1% peptone-0,85%NaCl), khụng chuyn qua mụi trng OCLA m khun lc L.monocytogenes Hiu qu IMS c tớnh bng bng so sỏnh s t bo cha sau IMS v tng s t bo bỏm vo ht t Lc v thc hin IMS L.monocytogenes cỏ hi Chia tỳi cỏ hi xụng khúi ly vo thi im khỏc siờu th v ct ming 5g(20-30 ming/con) Mu cỏ c gi a petri ó kh trựng v tr -200C cho n s dng 200àl L.momocytogenes phỏt trin qua ờm c ly nhim vo nhng ming cỏ, mc trung t 8ì10^0 n 8ì10^5 cfu/mu Mu i chng khụng gõy nhim c thờm vo non-buffer peptone water vụ trựng C mu i chng v mu lõy nhim L monocytogenes c 40C 24 gi hay ngy vi khun phỏt trin trờn b mt v gi iu kin lnh Sau mu cỏ c(5g) c chuyn vo tỳi lc ca mng lc(Interscience, Bois des Arpents, St Nom, France) v ng nht vi 15ml nonbuffered peptone water phỳt, lc qua mng lc tiờu chun(ng kớnh l >20àm, dy 100m; Duni, Duni AB Helmstad,Sweden) Thu nhn L.monocytogenes mu lc c c lng bng phng phỏp m a OCLA v mụi trng BHI agar Sau qua li lc, 2ml ca phn lc c ly tõm 10000 vũng/ phỳt 70C Kt qu c thu nhn li 1ml PBS vụ trựng ng ly tõm vụ trựng v sau ú thc hin IMS thu nhn t bo vi khun Ly gii t bo vi khun cho PCR Dch huyn phự L.monocytogenes mụi trng t nhiờn hay lõy nhim cho cỏ c ly tõm 13000 vũng/phỳt thu c cm t bo vi khun=> cho vo 100àl proteinase K trn vi 100àl dung dch ly gii Tz(Abolmaaty et al, 2000)( 2% TritonX-100 v 2,5mg/ml sodium ozide 0,1 Tris-HCl buffer ti pH=8) v 100àl saline magnesium sulphate solution(2ìTZ v 0,85%NaCl, 0,001M MgSO4) ng ly tõm nh 1,5ml T bo vi khun c ly gii bi nhit ng c nu sụi 20 phỳt ng ó x lý nhit c lm mỏt nhit phũng v ly tõm 10000 vũng/ phỳt=>50àl dch tan nguyờn c chuyn i v 9,5àl c s dng lm mu PCR S nh lng L.monocytogenes vi SYBR Green/Real-Time PCR Assay.Gen listeriolysin(hly A) c chn lm mc tiờu xỏc nh L.monocytogenes Mi xuụi: 5-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3 Mi ngc: 5-CACTGCATCTCCGTGGTACTAA-3 Footer PagePhm 19 ofNgc 126 H 19 Header Page 20 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn c s dng khuch i on 113bp ca gene hly A(Nogva et al,2000) nh lng Real-Time PCR c thc hin bi mỏy luõn nhit Mì3005(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 25àl th tớch cui cha 9,5àl mu DNA, 300mM mi xuụi v mi ngc(DNA Technology, Arhus, Denmark) v 12,5àl 2ìHigh power SWBR Green PCR Master M(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) PCR bao gm 45 chu k, mi chu k cú bc bin tớnh 950C/15 giõy,bt cp/ kộo di 600C-60 giõy Phõn tớch melt-curve gia 55-950C kim tra s c hiu ca phn ng khuch i Tt c cỏc mu c kim tra ln ng cong chun c xõy dng t cỏc nng pha loóng ca t bo vi khun v quan sỏt chu k ngng Ct Xỏc nh v phõn tớch s khỏc ca cỏc loi Listeria bng Multiplex PCR S dng gen iap Thit k mi khỏc xỏc nh cỏc loi Listeria bng Multiplex PCR sau ú in di trờn gel.Xỏc nh mi c hiu cho loi Listeria v mi c hiu cho L.monocytogenes, L.innocua, L.grayi, nhúm L.ivanovii, L.seeligeri v L.welshimeri Cỏc loi mi s dng: Ino 2[5-ACTAGCACTCCAGTTGTTAAAC-3] Lis 1B[5-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3] Khuch i on gene ca L.innocua di 870bp Siwi 2[5-TAACTGAGGTAGCGAGCGAA-3] Lis 1B[5-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3] Khuch i on gene ca nhúm L.ivanovii, L.seeligeri v L.welshimeri di 1,2kb Mono A[5-CAAACTGCTAACACAGCTACT-3] Lis 1B[5-TTATACGCGACCGAAGCCAAC-3] Khuch i on gene ca L.monocytogenes di 660bp Primer Mugrad v Lis 1B khuch i on gene ca L.gayi v L.murrayi di 480bp Cỏc loi Listeria khỏc khụng cú sn phm Sn phm PCR ca L.monocytogenes vi cp mi Mono A v Lis 1B 30 chu k(950C/15 giõy,580C/30 giõy, 720C/45 giõy) vi lane chun Da trờn ú cú th thc hin Multiplex PCR vi cỏc primer Ino 2, Lis 1B, Siwi 2, Mugrad, Mono A vi tin trỡnh tng t cho cỏc on cú kớch thc khac v khụng cú phn ng chộo Footer PagePhm 20 ofNgc 126 H 20 Header Page 21 ofoỏn 126.vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Xỏc inh v phõn bit cỏc loi Listeria da trờn Multiplex PCR cha primers MugraI, MonoA, Ino2, and Siwi2, and Lis1B (Lis-Mix) Thc hin phn ng 30 chu k (bin tớnh 95C/15 giõy, bt cp 58C/30 giõy, kộo di 720C/45 giõy) vi lane chun VI: Kt lun Cng ngy cú nhiu nguy c gõy hi cho sc khe ca ngi v vt nuụi, Listeriosis l mt nhng nguy c nguy him v nú cng ỏng quan tõm hn nguyờn nhõn xy hin din khp mi ni c bit l thc n ca ngi S dng phng phỏp truyn thng nhn bit s tn ti ca Listeria ũi hi phi thc hin cỏc phn ng sinh húa nh lờn men ng, CAMPtrong phũng thớ nghim v tin trỡnh ny cn thi gian ti thiu l ngy theo International Dairy Federation (IDF) tiờu chun 143:1995 iu ny khụng ỏp ng c yờu cu chn oỏn bnh nht l bc phỏt dch bnh Vi s i v c ci tin tng bc k thut PCR l phng phỏp nhanh, nhy, chớnh xỏc xỏc nh vi khun Listeria núi chung v L.monocytogenes núi riờng Mt khỏc hiu qu ca PCR cũn c tng lờn rt nhiu ln s dng kt hp vi phng phỏp IMS Thờm vo ú ci tin PCR ta cú c Multiplex PCR phng phỏp ny cho phộp ta phõn bit rừ rng gia cỏc loi Listeria, vỡ cho dự ch cú L.monocytogenes l tỏc nhõn gõy bnh thc s nguy him nhng trờn thc t s tn ti ca loi ny khụng nhiu thỡ ớt cng cú liờn quan n s hin din ca cỏc loi Listeria khỏc V Ti liu tham kho Http://www.khoahoc.vn.com Tụ Minh Chõu- Trn Th Bớch Liờn(2001) Vi khun v nm gõy bnh thỳ y Http://www.nature.com http://scholar.google.com.vn http://www.khoahoc.net/baivo/nguyenthuongchanh/130907-vikhuanlisteria.htm http://en.wikipedia.org/wiki http://www.pasteur-hcm.org.vn/tinchitiet.jsp?ma_bv=146 http://www.springerlink.com/content/100229/ William Burrows, Robert Murdoch Lewert, John Willarel Rippon(1968) Fex book of microbiology- The pathogenic Microorganisms Footer PagePhm 21 ofNgc 126 H 21 ... oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn I T VN Trong s sỏu loi Listeria c bit n thỡ Listeria monocytogenes v Listeria ivanovii l nhng tỏc nhõn gõy bnh Nhng Listeria ivanovii rt... (V), VII, IX A, B, C 4b (III), V, VI A, B, C 4ab (III), V, VI, VII, IX A, B, C 4c (III), V, VII A, B, C (III), VI, VIII 4d (III), V, VI, VIII, IX) 4e A, B, C c t Vi khun sn sinh men hemolysinase... 48 gi vi bnh tớch hoi t gan Dựng test ANTON gõy vi m kt mc mt Mt bnh L.monocytogenes Ngc H Footer PagePhm of 126 Header Page of oỏn 126 vi khun Listeria monocytogens bng k thut gene Chn Vi m mng