Khóa luận Quy trình chẩn đoán viêm gan C bằng kỹ thuật PCR Elisa và Real Time PCR

LỜI MỞ ĐẦU Hiện nay, người ta ước tính có khoảng phân nửa dân số giới bị nhiễm nhiều siêu vi gây viêm gan từ siêu vi A đến siêu vi G Nhiễm siêu vi A E gây bệnh lý cấp tính diễn tiến bệnh thường tự giới hạn, để lại hậu nghiêm trọng Ngược lại, viêm gan siêu vi B, C D dẫn đến nhiễm trùng dai dẳng mãn tính với nguy tiến triển sang xơ gan, ung thư gan đưa đến tử vong Hơn nữa, tỉ lệ mắc bệnh viêm gan siêu vi B C nhanh chóng gia tăng nhiều quốc gia làm cho bệnh trở thành vấn đề đáng quan tâm cho sức khoẻ cộng đồng Siêu vi viêm gan C bệnh nguy hiểm đáng lo ngại nay, số lượng người nhiễm bệnh, kiểu biến chứng gây nguy hiểm đến sức khỏe người xơ gan, ung thư thư gan… Ở Việt Nam, bệnh xuất gần nên chưa hiểu rõ nguyên nhân gây bệnh chưa biết cách phòng ngừa nhiều nên dễ dàng mắc phải Viêm gan siêu vi C xâm nhập vào thể nhờ virus HCV (Hepatitis C Virus), Houghton phát vào năm 1989 Từ đó, nhờ vào thử nghiệm tìm anti-HCV, tỉ lệ người bị nhiễm viên gan sau truyền máu giảm đáng kể Trong suốt thập niên 90 kỷ 20, nhà khoa học đạt nhiều thành tựu lãnh vực nghiên cứu cấu trúc phân tử siêu vi đặc biệt điều trị Hiện phương thức trị liệu siêu vi C chưa phải hoàn hảo ngày có thuốc hiệu cao đưa vào thử nghiệm lâm sàng Khả thường xuyên biến đổi cấu trúc di truyền siêu vi C trở thành thách thức lớn cho việc chế tạo thuốc chủng ngừa tương lai Cho nên, ta phát bệnh viêm gan siêu vi C sớm tốt ta biết nhiễm genotype C nào, để tìm loại thuốc điều trị tốt Để phát dòng virus nhiều nhà khoa hoc nghiên cứu nhiều phương pháp phát virus HCV dựa vào ứng dụng sinh học phân tử : phương pháp ELISA kết hợp với phương pháp PCR, phương pháp lai phân tử (Hybrid Capture, bDNA ) gần phương phát RealTime PCR phương pháp sử dụng nhiều phương pháp này, thao tác dễ thực hiện, gây sai sót, cho kết thời gian ngắn, định tính cách xác, độ nhạy cao kỹ thuật bDNA phương pháp xác định bệnh nhân có bị nhiễm viêm gan lại hay không, phương pháp khác xác định bệnh nhân có bị nhiễm cấp tính hay mãn tính không phân biệt chắn tình trạng nhiễm hay lành (hết mầm bệnh thể, không nguy lây lan), ví dụ : phương pháp PCR ELISA, sau điều trị bệnh hết, có nghĩa kháng nguyên lạ không còn, kháng thể tồn thể thời gian dài, có đến nhiều năm… Do đó, việc chẩn đoán viêm gan C nhu cầu cần thiết người Cho nên, em chọn đề tài để tìm hiểu quy trình chẩn đoán bệnh viên gan siêu vi C phương pháp Real-Time PCR phương pháp PCR ELISA hai phương pháp thông dụng CHƯƠNG1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH VIÊM GAN SIÊU VI C 1.1 Lịch sử phát bệnh [7] Bệnh viêm gan siêu vi C Hepatitis C Virus (HCV) gây Đây bệnh nguy hiểm, thường dẫn đến biến chứng xơ gan ung thư gan nguyên phát với tỉ lệ cao Hiện nay, số người nhiễm HCV giới ước tính khoảng 170 triệu người (số liệu năm 2000) ) Quá trình phát bệnh viêm gan siêu vi C: Năm 1975, Prince cộng nhận định có chứng bệnh viêm gan siêu vi sau truyền máu không HBV có thời kỳ ủ bệnh dài thời ủ bệnh HAV Sau đó, tác giả khác chứng minh mặt huyết học bệnh viêm gan siêu vi loại liên quan đến bệnh viêm gan siêu vi A từ lúc danh từ “bệnh viêm gan siêu vi không A không B” đời Vào tháng năm 1989, có phát viêm gan siêu vi không A không B công bố Bằng phương pháp ly tâm siêu tốc huyết tương thu từ tinh tinh bị bệnh viêm gan siêu vi, Choo cộng tách chiết nucleic acid virus, tổng hợp cDNA từ RNA tách chiết, chèn vào genome (bộ gene) λgt11 xâm nhiễm E coli Trong số hàng triệu dòng thu có dòng có phản ứng đặc hiệu với kháng thể có huyết người bị bệnh viêm gan siêu vi không A không B sau truyền máu Cuối cùng, họ xác định bệnh viêm gan siêu vi không A không B loại siêu vi gây ra, siêu vi C (HCV) 1.2 Đặc điểm virus gây bệnh viêm gan siêu vi C: [1, tr 8-12], [20] 1.2.1 Đặc điểm sinh học virus HCV HCV virus thuộc họ Flaviviridae Đây loại virus RNA, có vỏ lipid, đường kính khoảng 55-65 nm Trọng lượng phân tử khoảng 4.106 daltons Bộ gen (genome) siêu vi chuỗi đơn RNA có cực tính (+), nằm bên phần nucleocapsid hình đa diện Ở lớp vỏ lipid chứa protein E1 E2 tạo thành phức hợp dimer ( Hính1.1) Điểm đặc biệt virus chưa có nghiên cứu xác định cấu trúc xác virus Cho đến nay, nhà khoa học thiết lập nên mô hình mang tính chất mô cấu trúc virus Nguyên nhân việc HCV gây nhiễm nhân tạo dòng tế bào có phòng thí nghiệm giới (không phân lập virus mà tách gen di truyền ( acid nhân ) huyết tương người bị nhiễm HCV RNA) Đây trở ngại lớn việc tìm hiểu cặn kẽ virus Mật độ hạt tử virus HCV huyết thay đổi, từ 1,03 đến 1,72g/ml Sở dĩ có thay đổi virion lưu hành máu nhiều dạng khác : dạng tự có tính lây nhiễm cao diên mật độ tương đối thấp ( khoảng 1,03 ) dạng kết hợp với đại phân tử đặc biệt lipoprotein diện phức hợp miễn dịch mật độ lại cao (khoảng 1,10) Thực nghiệm khỉ chimpanzee cho thấy tính lây nhiễm HCV tự cao rõ rệt so với dạng kết hợp với đại phân tử Một điểm quan trọng virus có khả biến thể nhanh tạo thành nhiều type sub-type kháng thuốc Chính khả biến thể nhanh mà chưa có loại vaccine có hiệu HCV Hình 1.1: Cấu trúc HCV 1.2.2 Cấu trúc genome virus HCV Genome virus HVC cuỗi RNA có cực tính dương, chia làm phần Bộ gene virus có kích thước khoảng 9400 nucleotide (Hình 1.2) Hinh 1.2 Cấu trúc genome virus n Đầu 5’ không mã hoá (5’UTR-untranslated region hay 5’NCR = noncoding region ) gồm 341 - 344 nucleotid Đây vùng tương đối bị biến đổi phân týp (subtype) khác Do đó, người ta sử dụng vùng chất mồi (primer) để phát RNA virus HCV phương pháp PCR Chức vùng tham gia vào việc điều hoà trình nhân đôi siêu vi Tại đây, có số cấu trúc uốn lượn (stem-loop structure ) gồm 27 nucleotid, giữ vai trò ức chế trình giải mã (translation ) theo chế điều hoà âm tính (negative regulation ) Vùng vị trí gắn kết với ribosome, gọi IRES (internal ribosome entry site ), để khởi phát trình giải mã cho việc tổng hợp chuỗi polyprotein tiền chất siêu vi o Vùng mã hoá đầu 5’ 3’ Vùng có khung đọc mở (open reading frame) gồm 9.379 - 9481 nucleotid, giải mã để tổng hợp polyprotein tiền chất (precursor) siêu vi gồm khoảng 3000 acid amin Sau đó, polyprotein enzyme protease siêu vi enzyme peptidase tín hiệu tế bào (host signal peptidases), phân cắt thành protein cấu trúc protein không cấu trúc - Protein cấu trúc : tạo từ gen C, E1 E2 *Protein capsid = protein C : mã hoá protein lõi, tạo nên phần nucleotid-capsid bao bọc bên chuỗi genom RNA siêu vi * Protein E1 E2 (envelope): mã hoá protein vỏ, hai glycoprotein lớp vỏ, liên kết với thành phức hợp dimer - Protein không cấu trúc * Protein NS2 enzyme Matallopproteinase, phân cắt polyprotein tiền chất chỗ nối NS2/NS3 * Protein NS3 (proteas/helicase ) enzyme thuỷ giải cắt đứt liên kết hydro * Protein NS4 : (Gồm NS4 A VÀ NS 4B ) : NS4 A cần thiết cho hoạt tính men protease NS3, NS4 B protein liên kết với màng tế bào * Protein NS5 (polymerase ) gồm NS5A NS5B NS5B dùng để tổng hợp chuổi RNA từ khuôn mẫu RNA p Đầu 3’ không mã hoá (3’UTR hay 3’ NCR ) bao gồm vùng : vùng có chiều dài thay đổi từ 28Æ 42 nucleotid, vùng poly (U) poly (A) để báo hiệu kết thúc trình giải mã Tận đoạn X gồm 98 nucleotid 1.2.3 Cách thức tồn khả gây bệnh Đầu tiên, HCV gắn vào receptor (thụ thể) chưa xác định bề mặt tế bào gan nhờ hai glycoprotein bề mặt E1 E2 HCV xâm nhập vào bên tế bào gan sau trình hòa màng (membrane fusion) RNA mạch (+) HCV dịch mã thành protein nhờ hệ thống dịch mã tế bào chủ Protein tiền thể tạo phân cắt enzyme tín hiệu (signalase) để tạo protein cấu trúc (C, E1, E2) protein không cấu trúc (NS1-NS5) Sau HCV tạo reverse transcriptase enzyme bắt đầu phiên mã ngược để tạo mạch RNA mạch (-) bổ sung với mạch (+) có Chính mạch RNA (-) khuôn để tạo RNA genome HCV((+) ssRNA) (Hình 1.3 ) Hình 1.3 Chu kỳ sống HCV Sau đó, capsomer tạo từ protein thành phần C, E1, E2 kết hợp với RNA genome HCV ((+)ssRNA) để tạo thành dạng nucleocapsid Nucleocapsid tiến đến tương tác với màng tế bào để thoát ngoài, trở thành dạng virus hoàn chỉnh xâm nhiễm tế bào khác 1.3.Triệu chứng lâm sàng: [7], [21] 1.3.1- Giai đoạn cấp tính: Bệnh nhân nhiễm HCV giai đoạn cấp tính thường biểu bệnh lý có biểu bệnh nhẹ (rất khó quan sát mắt thường) Khoảng 60-70% bệnh nhân nhiễm triệu chứng, 2030% có biểu vàng da, 10% bệnh nhân thể số triệu chứng không đặc hiệu như: mệt mỏi, đau bụng… Triệu chứng biểu lâm sàng bệnh nhân giai đoạn cấp tính HCV tương tự bệnh nhân nhiễm virus gan gây bệnh gan khác Do vậy, việc xét nghiệm bệnh nhân thử nghiệm miễn dịch điều cần thiết để xác định bệnh nhân nhiễm loại virus Hepatitis Tuy nhiên, thử nghiệm miễn dịch có kết tốt (80%) sau 15 tuần kể từ có biểu bệnh lý Tỉ lệ tăng dần theo thời gian tối đa sau tháng 100% bệnh nhân nhiễm HCV phát virus kỹ thuật miễn dịch Do nhược điểm thời gian mà kỹ thuật miễn dịch tỏ hiệu việc phát sớm virus Tuy nhiên, kỹ thuật phát HCV sinh học phân tử mắc tiền kỹ thuật miễn dịch sử dụng phổ biến quốc gia phát triển 1.3.2-Giai đoạn mãn tính: Sau giai đoạn nhiễm cấp tính khoảng 15-25% bệnh nhân tự loại bỏ tất virus HCV thể trở lại bình thường chưa nhiễm virus Tuy nhiên, khoảng 75% bệnh nhân nhiễm HCV chuyển sang giai đoan mãn tính Hình 1.4 Các giai đoạn phát triển bệnh Trong giai đoạn nhiễm mãn tính bệnh nhân thường biểu bệnh lý Giai đoạn kéo dài từ 20-30 năm kéo dài trước bệnh nhân chuyển thành ung thư gan Vì người bệnh thường không chẩn đoán điều trị kịp thời Nhiều trường hợp bệnh phát có biến chứng nghiêm trọng : xơ gan với biểu báng bụng (ổ bụng có nước), giãn mạch máu đường tiêu hóa, vỡ gây chảy máu ạt tử vong Một biến chứng ung thư tế bào gan Khi xơ, gan khó hồi phục lại, cho dù tình trạng viêm có thuyên giảm Vì vậy, thầy thuốc khuyên nên điều trị sớm nhằm ngăn ngừa làm chậm tiến triển sang giai đoạn xơ gan 1.4 Chẩn đoán Chẩn đoán viêm gan siêu vi C, xét nghiệm đánh giá chức gan, siêu âm gan ( nhằm nghiên cứu cấu trúc gan phận xung quanh, tìm dấu hiệu xơ gan biểu bất thường), sinh thiết gan ( Xét nghiệm cho phép chuyên gia quan sát tế bào gan kính hiển vi, xác định mức độ viêm nhiễm, chẩn đoán giai đoạn bệnh, đánh giá hiệu điều trị.) xét nghiệm tìm HCV giữ vai trò quan trọng Anti-HCV: tìm thấy 70% trường hợp bắt đầu có triệu chứng khoảng 90% vòng tháng sau Tuy nhiên, nhiều người bị viêm gan C triệu chứng Anti-HCV không xác định nhiễm cấp tính, lành bệnh (đào thải hết virus) hay chuyển sang giai đoạn mãn tính HCV RNA : phát trực tiếp siêu vi máu, chứng nhiễm HCV virus tăng sinh, đồng thời định danh nhóm để lựa chọn phác đồ hợp lý Có thể phát HCV-RNA vòng đến tuần sau nhiễm virus Xét nghiệm sử dụng để tiên lượng đáp ứng tốt với điều trị 1.5 Dịch tễ học: Từ Choo Q.L phát siêu vi gan viêm gan C năm 1989 đến nay, nhiều nghiên cứu dịch tễ học nhiễm siêu vi C tiến hành để đánh giá tình trạng nhiễm siêu vi C cộng đồng, đường lây nhiễm diễn tiến trường hợp bị lây nhiễm 1.5.1 Tình trạng nhiễm bệnh viêm gan siêu vi C: [1], [22] Tình hình giới: Số người bị nhiễm viêm gan siêu vi C giới khoảng 170 triệu người, khu vực Đông Nam Á chiếm tỷ lệ cao với khoảng 32,3 triệu (xem hình 1.5) Con số gia tăng năm gần Virus viêm gan siêu vi C xem kẻ giết người thầm lặng bệnh nhân mắc phải virus triệu chứng khoảng 10 năm trước phát triển thành viêm gan mãn tính ung thư gan Khoảng 40-50% trường hợp ghép gan Hoa kỳ nhiễm virus viêm gan C Có chủng virus viêm gan C xác định (HCV1-6) tùy thuộc vào chủng virus nhiễm mà đáp ứng trị liệu khác 10 -Máy chụp hình kỹ thuật số (Olympus) lọc tia UV (Kodak) -Máy ly tâm thu huyết máy ly tâm Hình 2.8 Máy ly tâm thu huyết Hình 2.9 Máy ly tâm -Miropipette 0.5-10µl, 20-100µl, 100-1000µl -Tủ cấy vô trùng -Vật liệu tiêu hao: găng tay, trang, đầu tip có phin lọc, eppendorf 2.2 Phương pháp [2], [3], [5], [7] Hình 2.10 Quy trình phát HCV 33 2.2.1 Ly trích RNA 2.2.1.1 Nguyên tắc: Việc tách chiết RNA bao gồm bước sau: (1) phá màng tế bào (2) loại protein (3) tủa RNA Để thu nhận RNA tinh sạch, người ta cần loại bỏ thành phần tạp nhiễm, mà quan trọng protein * Mục đích việc tách chiết RNA tinh là: +Chiết RNA tinh + Thu RNA tối đa + Loại protein Sự tách chiết dựa nguyên tắc hòa tan khác phân tử khác (acid nucleic/protein) hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nước) Các chất tách chiết: -Dung dịch (1): thành phần có phenol, guianidine thyocianat 0,8M, glycerol Dung dịch có tính nhớt, sử dụng để ổn định thành phần, đồng thời chúng chất làm biến tính protein mạnh Vì vậy, xử lý với hóa chất này, tế bào bị phá vỡ giải phóng thành phần nội bào: DNA, RNA, protein… -Dung dịch (2) chloroform: thường kèm với phenol phenol không hòa tan nucleic acid (làm biến tính protein yếu phenol), có tác dụng bổ sung loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol Sau ly tâm, mẫu xử lý với Trizol tách thành hai lớp: lớp phenol, lớp chứa RNA (khi Trizol có pH 4.0), phần protein bị biến tính nằm mặt phân cách hai lớp bị loại bỏ => thu lớp RNA + H2O phía -Dung dịch (3) Isopropanol: có vai trò tạo tủa kết tủa acid, RNA phần dịch thu nhận cách tủa với Isopropanol có bổ sung chất trợ 34 tủa Chất trợ tủa polymer có cấu trúc mạng lưới nên dễ dàng bắt phân tử RNA, không gây ức chế phản ứng PCR - Sau tủa, tủa rửa lại lần với dung dịch (4) (ethanol 70%) cuối bảo quản nước cất qua xử lý DEPC (Dung dịch (5)), bảo quản -20oC đến sử dụng 2.2.1.2 Phương pháp tiến hành a) Phương pháp thu nhận chuẩn bị mẫu -Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc đói buổi sáng tốt -Máu giữ 4o-8oC tối đa giờ, sau phải tách huyết -Lấy 3ml máu bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng -Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút 15 phút Thu khoảng 0.5ml huyết chuyển vào eppendorf 1.5ml vô trùng Giữ tube huyết -200C tiến hành xét nghiệm b) Phương pháp tách chiết RNA HCV Bước 1: Trước hết phá màng tế bào -Cho 200µl mẫu (huyết thanh) vào eppendorf có sẵn 900µl dung dịch 1, vortex 30s, để yên 10 phút Bước 2: loại protein - Thêm vào 200µl dung dịch 2, trộn Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút - Thu 600µl dịch (chú ý thu dịch nổi) có chứa RNA Bước 3: Tủa RNA - Lấy 600µl có chứa RNA hút vào eppendorf có sẵn 600µl dung dịch Trộn đều, để yên 10 phút Thêm 200µl dung dịch Ly tâm 13000 vòng/phút 10 phút -Loại bỏ dịch nổi, thu cặn màu xanh Cho từ từ 900µl dung dịch vào Ly tâm 13000 vòng/phút phút -Loại bỏ dịch (dùng pipet 200 µl hút phần dịch nổi), thu cặn tránh loại bỏ phần cặn Để khô 60oC, 10 phút Cho vào 50µl dung dịch 35 - Nếu chưa đặt phản ứng PCR phải bảo quản -20oC 2.2.2 Thực phản ứng phiên mã ngược - Thực bước với tube RT-Mix (gồm: dung dịch đệm thích hợp, đoạn mồi, dNTP ) giữ khay lạnh đá tan - Trước sau đặt phản ứng RT phải ly tâm tube để tất dung dịch nằm đáy tube - Đánh dấu tube ký hiệu mẫu Cho 15µl chứng (+), chứng (-) dịch RNA tách chiết vào tube Phải kiểm tra chắn dịch tip phải cho hết vào tube Thực mẫu nào, mở nắp tube tương ứng Thực xong đóng thật kỹ nắp tube để tránh nguy ngoại nhiễm Sau đó, ly tâm chuyển tube vào máy PCR - Lập chương trình cho máy PCR hoạt động: 25oC - 5’, 42oC - 30’, 85oC 5’, giữ 4oC Chọn chức chờ đến “Heat lid” đạt 1050 chương trình luân nhiệt bắt đầu Giai đoạn giai đoạn phiên mã ngược Z Trong hỗn hợp RT-PCR premix có chứa: dung dịch đệm thích hợp, đoạn mồi, dNTP… cần thiết cho trình chạy PCR Z Trong trình chạy RT-PCR, giai đoạn phiên mã ngược quan trọng + 250C phút, nhằm ổn định RNA để chuẩn bị cho trình phiên mã ngược Enzyme reverse transriptase sử dụng để tổng hợp cDNA từ mạch khuôn RNA + RT-Enzyme mix hoạt động thích hợp nhiệt độ 420C Tại nhiệt độ này, RNA bắt cặp mồi đoạn oligonucleotide có sẵn RT-PCR premix, từ nhờ enzyme RT kéo dài, phiên mã ngược RNA thành cDNA Trong khoảng thời gian 30 phút 42oC, lượng RNA phiên mã ngược hoàn toàn thành cDNA + Sau nhiệt độ tăng lên 85oC vòng phút để phân hủy hết lượng reverse transcriptase dư đồng thời phá vỡ liên kết hydro RNA-cDNA tổng hợp 36 - Bảo quản 4oC nhằm giữ mẫu lâu - Sản phẩm cDNA dùng để thực phản ứng PCR ELISA/realtime PCR -Nếu chưa thực phản ứng PCR ELISA/real-time PCR phải bảo quản cDNA -20oC 2.2.3 Phương pháp PCR ELISA Trộn 20µl dung dịch digoxigenin với 20 µl dung dịch DNA biến tính, vortex nhẹ, để digoxigenin gắn vào DNA mạch đơn Để nhiệt độ phòng 10 phút để ổn định thành phần hỗn hợp trước tiến hành phản ứng lai Thêm 200µl dung dịch lai có chứa probe đặc hiệu cho HCV (probe xác định digoxigenin có gắn oligonucleotide đặc trưng cho virus HCV) Vortex nhẹ 10 giây Lúc này, probe đánh dấu đầu 3’ với digoxigenin bắt cặp bổ sung với mạch mang biotin đầu 5’ Cho tất 240µl vào giếng đĩa chạy ELISA Mặt vi giếng có phủ sẵn streptavidin chất giữ có khả mang protein kháng nguyên HCV, đặc biệt biotin chúng giữ mạch mang biotin đầu 5’ -Đặt đĩa chạy ELISA vào máy lắc ổn nhiệt.Lắc 55oC để thúc đẩy trình bắt cặp bổ sung digoxigenin bitotin hoàn toàn -Sau đó, hút bỏ dung dịch giếng, để loại bỏ kháng nguyên không chứa virus HCV -Rửa giếng với dung dịch rửa, để loại bỏ hoàn toàn kháng nguyên không chứa virus HCV Thực lần rửa, lại kháng nguyên có chứa virus HCV cố định Streptavidin -Cho vào giếng 200µl cộng hợp kháng thể digoxigenin-peroxidase -Đặt vào máy lắc ổn nhiệt, lắc 30 phút 37oC, thời gian kháng thể đặc hiệu huyết gắn với kháng nguyên virus HCV 37 -Rửa giếng với dung dịch rửa để loại bỏ huyết thành chuẩn bị cho bước Thực lần rửa -Cho vào giếng 200µl dung dịch ABTS, dạng chất đặc hiệu enzyme, có chứa chất hóa học chất màu, chất màu lai trạng thái bất hoạt dạng không màu, chuyển sang dạng hoạt hóa chúng dạng hòa tan có màu, thêm chất vào giếng, giếng có kháng thể gắn cộng hợp với kháng nguyên enzyme peroxidase hoạt hóa chất chất màu chuyển sang dạng hoạt hóa giếng màu giếng kháng thể gắn cộng hợp với kháng nguyên chất màu chất ABTS trạng thái bất hoạt không màu Cuối ta đặt giếng vào máy đọc ELISA, ghi nhận kết 20 phút ủ có lắc máy đọc ELISA 2.2.4 Phương pháp Real time - PCR - Thực bước với tube PCR mix giữ khay lạnh đá tan - Trước sau đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất dung dịch nằm đáy tube - Cho 2.5µl dịch cDNA từ phản ứng RT vào tube HCV qPCR mix Phải kiểm tra chắn dịch tip phải cho hết vào tube Thực mẫu nào, mở nắp tube tương ứng Thực xong đóng thật kỹ nắp tube để tránh nguy ngoại nhiễm Sau đó, ly tâm chuyển tube vào máy real-time PCR với standard - Bật máy real-time PCR, đèn đầu đọc real-time 15 phút trước chạy chương trình Bật máy tính chờ cho máy tính khởi động xong, gọi chương trình real-time PCR lên Phải kiểm tra chắn máy real-time PCR máy vi tính kết nối với Chọn chức chờ “Heat lid” đạt 1050 chương trình luân nhiệt bắt đầu 38 - Cài đặt vị trí mẫu “Plate setup” phần mềm với vị trí mẫu đặt máy real-time PCR - Với standard: chọn loại mẫu “Standard” khai báo nồng độ tương ứng với standard - Với mẫu: chọn loại mẫu “Unknown”, đặt tên số tương ứng với ký hiệu mẫu - Màu “Fam”: phát trình tự mục tiêu HCV, màu “Hex”: phát trình tự chứng nội - Cài đặt chương trình cho máy real-time PCR hoạt động: chu kỳ: 95oC-5’, 40 chu kỳ: 95oC-15’’, 60o-1’ (chọn đọc kết bước này) Chọn chức chờ “Heat lid” đạt 105o chương trình luân nhiệt bắt đầu chu kỳ: 95oC phút: hoạt hóa enzyme Taq polymerase tách mạch hoàn toàn gen cDNA 40 chu kỳ: Z 95oC-15’’ biến tính cDNA mạch đôi thành hai mạch đơn Z 60o-1’ hạ nhiệt độ xuống để lai, bắt cặp bổ sung để tổng hợp đọan mạch mới, đồng thời phản ứng phát quang xảy Trong lúc máy tính ghi nhận lượng huỳnh quang giải phóng phản ứng, chu kỳ máy tính ghi nhận lần - Số lượng chu kỳ cho phân tử PCR không vượt 40 chu kỳ làm giảm hiệu khuếch đại, thoái hóa gene - Sau kết thúc chương trình luân nhiệt, chuyển qua chế độ PCR Quantitation, chọn nút Report, chọn chế độ hiển thị toàn phần in giấy kết đợt thí nghiệm lưu file liệu vào máy tính 39 Hình 2.11 Biểu đồ: chu trình nhiệt Real-time PCR 40 CHƯƠNG KẾT QUẢ-THẢO LUẬN 3.1 Kết [7],[9],[24] 3.1.1 Biểu đồ khuếch đại real-time PCR Trong real-time PCR, người làm thí nghiệm dùng biểu đồ khuếch đại (amplification graph) để quan sát trình nhân DNA ống phản ứng Biểu đồ có trục tung (Y) cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sách kích thích, trục hoành (X) chu kỳ nhiệt Hình 3.1 Biểu đồ đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát từ ống phản ứng nhận ánh sáng kích thích vào chu kỳ nhiệt 41 Trên biểu đồ khuếch đại (hình 3.1), người làm thí nghiệm thấy ống phản ứng cường độ huỳnh quang mà máy thu nhận thấp không thay đổi, hiến thị đường thẳng nằm ngang, gọi giai đoạn ủ.Vì giai đoạn này, dù DNA đích nhân thành số lượng chưa đủ để giúp cho chất phát huỳnh quang nhận ánh sáng Nhưng số lượng DNA đích đạt đến ngưỡng định ánh sáng huỳnh quang phát đủ cường độ để máy ghi nhận lúc thấy đường biểu khuếch đại bắt đầu ngóc lên Cường độ huỳnh quang ống phản ứng từ lúc trở tăng gấp đôi sau chu kỳ nhiệt, số lượng DNA đích tăng gấp đôi sau chu kỳ, giai đoạn lũy thừa cường độ huỳnh quang Cường độ huỳnh quang ống phản ứng tăng trưởng đến mức độ tăng trưởng chậm dần đạt đến bình nguyên, phản ứng cạn dần dNTP enzyme Taq polymertase không hoạt động hiệu nữa, giai đoạn “giai đoạn bình nguyên” Chu kỳ ngưỡng (Ct - Threshold cyle) chu kỳ nhiệt mà thời điểm thiết bị real-time ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang Chu kỳ ngưỡng thường số lẻ (ví dụ: Ct = 28.35), số chẵn chu kỳ ngưỡng trị số xác định số chu kỳ mà đường cắt đường biểu diễn khuếch đại Để xác định cường độ huỳnh quang nền, thiết bị real-time thường ghi nhận cường độ tín hiệu huỳnh quang xuất ống phản ứng số chu kỳ đầu, gọi chu kỳ (basal cycle), lấy trung bình cộng cường độ huỳnh quang làm cường độ huỳnh quang nền, đường cắt ngang qua qua cường độ huỳnh quang gọi đường Tùy theo số lượng DNA đích ban đầu (starting quantity) ống phản ứng nhiều hay ít, DNA đích nhiều Ct xuất sớm 42 DNA đích mà Ct xuất chậm Cho nên, Ct cao ta cần giảm chu kỳ nhiệt lại, thấp ta tạo thêm chu kỳ nhiệt 3.1.2 Biểu đồ đường chuẩn real-time PCR Hình 3.2 Biểu đồ đường chuẩn phản ứng reat-time PCR Đường biễu diễn nêu lên mối quan hệ chu kỳ ngưỡng với số lượng DNA đích ban đầu có mẫu chuẩn gọi đường biểu diễn chuẩn (standard curve) Đây đường thẳng tuyến tính qua điểm tọa độ xác định số lượng DNA đích ban đầu (trên trục tung) chu kỳ ngưỡng ống phản ứng chứa số lượng DNA đích (Hình 3.2) Trên biểu đồ chuẩn này, trục tung (Y) Ct, trục hoành (X) số lượng DNA đích ban đầu có mẫu chuẩn Để xác định biểu đồ đường chuẩn (standard curve) lý tưởng hay không, ta dựa vào hai thông số: * Hệ số tương quang (R2): hệ số phải đạt hay 0.99, người làm thử nghiệm không lấy thể tích xác chắn thể tích mẫu chuẩn cho vào real-time PCR mix xác được, nên R2 phải đạt hay 0.99 43 * Hiệu PCR: E nằm khoảng 90% Æ 105% 3.2 Thảo luận Để real-time PCR xác định xác số lượng đích ban đầu có mẫu thử, người làm thí nghiệm phải thực real-time PCR mẫu thử chứa số lượng DNA đích ban đầu, cần xác đích lúc với mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu biết rõ số lượng thường mẫu chuẩn mẫu pha loãng theo hệ số pha loãng 10 chứa số lượng DNA đích ban đầu Hình 3.3 Biễu đồ khuếch đại vẽ lên đường biễu diễn khuếch đại mẫu thử mẫu chuẩn Sau hoàn tất chu kỳ nhiệt real-time PCR, biểu đồ khuếch đại (Hình 3.3), mẫu chuẩn mẫu thử có đường biễu diễn khuếch đại tương ứng với đường biểu diễn khuếch đại này, mẫu chuẩn mẫu thử có chu kỳ ngưỡng ( Ct ) Đường biểu diễn khuyếch đại yếu tố thiếu phương pháp real-time PCR nhờ vào ta nhận biết mẫu dương, mẫu âm dựa vào chu kỳ ngưỡng cường dộ khuếch đại huỳnh quang 44 Hình 3.4 Biểu đồ khuếch đại biễu diễn khuếch đại mẫu dương mẫu âm Nhìn vào biểu đồ (hình 3.4) ta biết mẫu có qua chu kỳ ngưỡng có khuyếch đại cường độ huỳnh quang mẫu mẫu dương, mẫu nằm chu kỳ ngưỡng mẫu âm Qua biểu đồ ta biết mẫu có hay virus HCV Các mẫu chuẩn mẫu thử nghiệm có chu kỳ ngưỡng (Ct) Do biết số lượng ban đầu mẫu chuẩn, ta xây dựng phương trình đường chuẩn thể mối tương quan chu kỳ ngưỡng số lượng Chu kỳ ngưỡng = a*log(số lượng ban đầu) +b (1) Từ Ct mẫu xét nghiệm phương trình (1) ta xác định số lượng ban đầu mẫu xét nghiệm 45 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Phương pháp Real Time PCR chứa nhiều tiềm tương lai, lĩnh vực phương có nhiều áp dụng nghiên cứu khoa học, chọn giống, y học, khoa học hình sự, tư vấn di truyền y học v.v… Viêm gan virus C khó khăn chẩn đoán, điều trị đắt tiền mà hiệu hạn chế, chưa có thuốc chủng ngừa Tần suất mang HCV RNA bệnh nhân anti HCV[+] 70% Như vậy, trường hợp anti HCV[+] mà HCV RNA chiếm 30% trường hợp Hàng năm giới có 500.000 người bị ảnh hưởng bệnh ung thư gan Một nửa số người Trung Quốc, vùng hạ Sahara Châu Phi có tỉ lệ ung thư cao Ngày nay, nguyên nhân gây tỉ lệ lớn người bị mắc bệnh ung thư gan xác định rõ ràng Khoảng 50% ca bệnh ung thư gan liên quan đến nhiễm Hepatitis B virus (HBV) 25% liên quan đến nhiễm Hepatitis C virus (HCV) 50 HBV Măc dù chiếm khoảng 25% ca mắc bệnh ung thư gan Tuy nhiên, theo số nghiên cứu gây nhiễm HBV thường có biểu rõ năm năm đầu kể từ nhiễm, HCV thường ảnh hưởng giai đoạn sau Chính mà khoảng 75% số người mắc bệnh ung thư gan độ tuổi dưới, HCV xem virus nguy hiểm HBV Cho tới thời điểm nay, có vaccin để phòng HBV HCV giai đoạn nghiên cứu Hơn nữa, việc điều trị virus viêm gan C lại vô tốn phức tạp so với điều trị bệnh nhân nhiễm HBV Nhiễm virus HCV vấn đề quan trọng y tế cộng đồng việc chẩn đoán xác tác nhân HCV, mục tiêu quan tâm hàng đầu bác sĩ, từ tiến hành điều trị, theo dõi diễn tiến biến chứng bệnh, phòng 46 ngừa lây lan HCV Hiện nay, giới có nhiều phương pháp chẩn đoán HCV như: sinh thiết gan, siêu âm gan, phương pháp khuếch đại tín hiệu, PCR ELISA, real-time PCR, … Trong phương pháp kể trên, phương pháp real-time PCR sử dụng rộng rãi việc xét nghiêm virus HCV phương pháp cho ta kết nhanh chóng, cho biết xác thể có bị nhiễm virus HCV hay không theo dõi HCV genotype để ta điều trị cách Ngoài phương pháp real-time PCR có phương pháp PCR ELISA sử dụng rộng rãi truyền máu giúp xác định bệnh nhân có mang virus viêm gan C máu hay không, xét nghiệm định tính HCVRNA xét nghiệm anti-HCV xét nghiệm sàng lọc cho truyền máu xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng, người có kết anti-HCV[+] không mang virút viêm gan C mà kết tình trạng nhiễm mầm bệnh trước khỏi 4.2 Kiến nghị Cần giải phát toàn diện chẩn đoán sinh học phân tử bệnh viêm gan C mạn tính Nên nhanh chóng đẩy mạnh phát triển vá ứng dụng kỹ thuật Real-time PCR kỹ thuật sinh học phân tử khác vào chẩn đoán hổ trợ cho việc theo dõi điều trị bệnh nhân Việt Nam 47 [...]... PCR -Kích thư c sản phẩm PCR trong phản ứng Reat -time PCR Chiều dài tối ưu c a sản phẩm PCR trong phản ứng Real- time PCR thường nhỏ hơn 100bp Sản phẩm c kích thư c ngắn nhân bản hiệu quả hơn và chịu c c điều kiện bất lợi c a phản ứng tốt hơn so với c c sản phẩm c kích thư c lớn Sản phẩm kích thư c nhỏ c thể biến tính ở nhiệt độ 92oC và chỉ c n 15 giây để Taq polymerase tổng hợp hoàn toàn một mạch... -C p primer C n phải c n thận trong vi c chọn l c mồi, probe quy t định sự thành c ng trong vi c khuếch đại c a PCR Mồi phải đạt đư c sự c n bằng giữa sự chuyên tính và sự hiệu quả c a PCR Thành phần GC c a c p primer gần giống như thành phần GC c a probe khoảng 20% - 80%, c n tránh c c nucleotide lặp lại, đ c biệt là G, nếu giá trị Tm c ng lớn, c hội cho priming nhầm c ng cao Nhiệt độ nóng chảy c a... nóng chảy c a c p primer trong khoảng 58-60oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy c a probe từ 8-10 0C -Chu kỳ ngưỡng (threshold cycle – Ct): Đây là khái niệm trung tâm c a kỹ thuật real- time PCR Nguyên t c định lượng c a kỹ thuật này dựa vào một đường cong chuẩn (standard curve) đư c xây dựng từ c c giá trị chu kỳ ngưỡng c a c c mẫu đã biết trư c nồng độ nucleic acid Chu kỳ ngưỡng c a một mẫu là chu kỳ mà tại... tất c dung dịch nằm dưới đáy tube - Đánh dấu c c tube bằng ký hiệu mẫu Cho 15µl chứng (+), chứng (-) ho c dịch RNA tách chiết vào tube Phải kiểm tra ch c chắn dịch trong tip phải đư c cho hết vào tube Th c hiện mẫu nào, chỉ mở nắp tube tương ứng Th c hiện xong đóng thật kỹ nắp tube ngay để tránh nguy c ngoại nhiễm Sau đó, ly tâm và chuyển ngay c c tube vào máy PCR - Lập chương trình cho máy PCR hoạt... protein * M c đích c a vi c tách chiết là RNA tinh sạch là: +Chiết đư c RNA tinh sạch + Thu đư c RNA tối đa + Loại đư c protein Sự tách chiết dựa trên nguyên t c hòa tan kh c nhau c a c c phân tử kh c nhau (acid nucleic/protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nư c) C c chất trong tách chiết: -Dung dịch (1): thành phần c phenol, guianidine thyocianat 0,8M, glycerol Dung dịch này c tính... tránh đư c có thể tiếp x c tr c tiếp với máu c a người mang bệnh Những người mẹ bị HCV c thể truyền bệnh cho con vào l c trư c ho c sau khi sinh Sự lây truyền này tùy thu c vào m c độ HCV c trong máu c a người mẹ 1.5.2.2 C c biện pháp phòng ngừa : Cho đến nay vẫn chưa c thu c chủng ngừa siêu vi viêm gan C Ngay c những hy vọng về một loại thu c chủng ngừa cho c n bệnh này trong tương lai c ng chưa thấy... một c ch tương đối tại một thời điểm c thể ho c ở những tế bào ho c mô c thể Sau khi nhân bản, c c sản phẩm PCR m c tiêu sẽ đư c theo dõi hàm lượng theo một thời gian thật (real time) c a phản ứng ) Thiết bị Th c chất, thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ c n đáp ứng đư c yêu c u thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính x c và c ng không c n phải qua bư c điện di ho c lai phân tử như kỹ thuật PCR. .. quencher c a Taqman probe sẽ đóng vai trò tạo tín hiệu nền cho phản ứng 27 -Đường cong chuẩn (standard curve): Vi c định lượng trong phản ứng real- time PCR đư c th c hiện bằng c ch so sánh hàm lượng sản phẩm PCR c a mẫu thử nghiệm với hàm lượng sản phẩm PCR từ c c mẫu chuẩn c nồng độ đã biết đư c nhân bản đồng thời C c thiết bị th c hiện phản úng real- time PCR sẽ tự động xây dựng một đường cong chuẩn... mạch mới từ đoạn mồi Thời gian này tùy thu c độ dài c a trình tự DNA c n khuếch đại (từ 30 giây đến vài phút) Thông thường một phản ứng PCR không đư c vượt quá 40 chu kỳ 1.6.3.3 C c chỉ tiêu ảnh hưởng đến phản ứng PCR Một phản ứng PCR thường gồm 6 thành phần c bản sau: - Khuôn acid nudcleic DNA mẫu phải thật tinh sạch, nhưng nếu DNA thu nhận tr c tiếp từ dịch chiết tế bào thì vi c chẩn đoán bằng PCR. .. Trong sinh hoc phân tử Real - time PCR (PCR đúng thời điểm) là kỹ thuật phòng thí nghiệm dựa trên phản ứng PCR dùng để nhân bội và định lượng đồng thời phân tử DNA đích Nó c khả năng vừa phát hiện vừa định lượng trình tự đ c hiệu trong mẫu DNA ) Nguyên t c real- time PCR c ng dựa trên PCR thường, đ c điểm c bản c a Reat - time PCR là DNA nhân bội đư c định lượng đúng thời điểm sau mỗi chu kỳ phản ứng,