“Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RTPCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ”

Bệnh viêm gan virus C do virus viêm gan C (Hepatitis C Virus HCV) gây ra. Hậu quả trầm trọng nhất của bệnh là tình trạng xơ gan và ung thư gan. Hiện nay trên thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV và mỗi năm lại có thêm hàng triệu người nhiễm mới. Khoảng 80% người nhiễm HCV sẽ chuyển sang tình trạng nhiễm mạn tính, trong đó 10 – 20% sẽ chuyển sang xơ gan và 1 – 5% sẽ chuyển thành ung thư gan. HCV còn làm trầm trọng thêm bệnh viêm gan do các loại virus khác khi đồng nhiễm. Theo đánh giá của các chuyên gia thuộc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thì bệnh viêm gan virus C là một mối đe dọa sức khỏe cộng đồng lớn nhất trong thế kỷ này và có lẽ cả ở thế kỷ sau. HCV lan truyền trong cộng đồng qua con đường truyền máu và các sản phẩm của máu, quan hệ tình dục, mẹ truyền sang con. Hiện nay, chưa có vaccine để phòng chống HCV do tính biến động di truyền cao của virus này. Trước khi quyết định điều trị, việc xác định nồng độ HCVRNA trong cơ thể sẽ cung cấp các thông tin tiên lượng giúp cho việc quyết định phương cách và thời gian điều trị. Nếu người bệnh nhiễm HCV type 1 và có nồng độ HCVRNA trong cơ thể lớn hơn 2x106 copiesml máu thì thời gian điều trị là 48 tuần thay vì 24 tuần như các trường hợp khác. Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các biểu hiện lâm sàng, các xét nghiệm chức năng gan thậm chí cả hình ảnh mô học của gan cũng không cho phép xác định nguyên nhân gây viêm gan virus C. Việc chẩn đoán nhiễm HCV buộc phải dựa vào các xét nghiệm sinh học có tính đặc hiệu đó là các kỹ thuật miễn dịch học và các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện kháng nguyên, kháng thể và các acid nhân của virus . Các xét nghiệm miễn dịch hiện nay cho phép phát hiện phần lớn trường hợp nhiễm HCV mạn tính nhưng hoàn toàn không hiệu quả trong giai đoạn “cửa sổ”. Các kỹ thuật phân tử, đặc biệt là các kỹ thuật nhân bản vật liệu di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho phép phát hiện bệnh sớm và chính xác trước khi kháng thể kháng HCV xuất hiện trong máu, đặc biệt cần thiết cho các BN bị suy giảm miễn dịch. Mặt khác, một số kỹ thuật phân tử như Realtime PCR vừa cho phép xác định chính xác nồng độ HCVRNA trong máu, vừa cho phép xác định chính xác các type HCV, phục vụ hữu hiệu cho việc tiên lượng bệnh, chỉ định và theo dõi điều trị. Do nguyên liệu di truyền của virus C là RNA nên muốn thực hiện PCR phải có một giai đoạn chuyển RNA sang cDNA nhờ men sao chép ngược RT (reverse transcriptase). Sau khi có được cDNA thì ta thực hiện phản ứng PCR trực tiếp với đoạn đặc hiệu của virus C. Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RTPCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ”

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Bệnh viêm gan virus C do virus viêm gan C (Hepatitis C Virus - HCV) gây ra. Hậu quả trầm trọng nhất của bệnh là tình trạng xơ gan và ung thư gan. Hiện nay trên thế giới có khoảng 170 triệu người nhiễm HCV và mỗi năm lại có thêm hàng triệu người nhiễm mới. Khoảng 80% người nhiễm HCV sẽ chuyển sang tình trạng nhiễm mạn tính, trong đó 10 – 20% sẽ chuyển sang xơ gan và 1 – 5% sẽ chuyển thành ung thư gan. HCV còn làm trầm trọng thêm bệnh viêm gan do các loại virus khác khi đồng nhiễm. Theo đánh giá của các chuyên gia thuộc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) thì bệnh viêm gan virus C là một mối đe dọa sức khỏe cộng đồng lớn nhất trong thế kỷ này và có lẽ cả ở thế kỷ sau. HCV lan truyền trong cộng đồng qua con đường truyền máu và các sản phẩm của máu, quan hệ tình dục, mẹ truyền sang con. Hiện nay, chưa có vaccine để phòng chống HCV do tính biến động di truyền cao của virus này. Trước khi quyết định điều trị, việc xác định nồng độ HCVRNA trong cơ thể sẽ cung cấp các thông tin tiên lượng giúp cho việc quyết định phương cách và thời gian điều trị. Nếu người bệnh nhiễm HCV type 1 và có nồng độ HCVRNA trong cơ thể lớn hơn 2x10 6 copies/ml máu thì thời gian điều trị là 48 tuần thay vì 24 tuần như các trường hợp khác. Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), các biểu hiện lâm sàng, các xét nghiệm chức năng gan thậm chí cả hình ảnh mô học của gan cũng không cho phép xác định nguyên nhân gây viêm gan virus C. Việc chẩn đoán nhiễm HCV buộc phải dựa vào các xét nghiệm sinh học có tính đặc hiệu đó là các kỹ thuật miễn dịch học và các kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện kháng nguyên, kháng thể và các acid nhân của virus . Các xét nghiệm miễn dịch hiện nay cho phép phát hiện phần lớn trường hợp nhiễm HCV mạn tính nhưng hoàn toàn không hiệu quả trong giai đoạn “cửa sổ”. Các kỹ thuật phân tử, đặc biệt là các kỹ thuật nhân bản vật liệu di truyền với độ nhạy và độ đặc hiệu cao cho phép phát hiện bệnh sớm và chính xác trước khi kháng thể kháng HCV xuất hiện trong máu, đặc biệt cần thiết cho các BN bị suy giảm miễn dịch. Mặt khác, một số kỹ thuật phân tử như Realtime PCR vừa cho phép xác định chính xác nồng độ HCVRNA Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 1 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT trong máu, vừa cho phép xác định chính xác các type HCV, phục vụ hữu hiệu cho việc tiên lượng bệnh, chỉ định và theo dõi điều trị. Do nguyên liệu di truyền của virus C là RNA nên muốn thực hiện PCR phải có một giai đoạn chuyển RNA sang cDNA nhờ men sao chép ngược RT (reverse transcriptase). Sau khi có được cDNA thì ta thực hiện phản ứng PCR trực tiếp với đoạn đặc hiệu của virus C. Trên cơ sở đó, chúng tôi nghiên cứu đề tài “Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ” nhằm các mục tiêu sau: 1.2. Mục tiêu đề tài 1.2.1. Mục tiêu tổng quát Xác định type và nồng độ virus gây viêm gan C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR trên BN viêm gan virus C tại Bệnh viện đa khoa Trung ương Cần Thơ. 1.2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định tỉ lệ (+) HCV qua kỹ thuật Realtime RT-PCR - Xác định nồng độ HCVRNA trên BN qua kỹ thuật Realtime RT-PCR - Xác định type HCV gây bệnh qua kỹ thuật Realtime RT-PCR. - Tìm mối liên quan giữa type, nồng độ HCVRNA và một số xét nghiệm cận lâm sàng khác của bệnh nhân. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 2 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về virus gây viêm gan C 2.1.1. Cấu trúc virus viêm gan C Hepatitis C virus (HCV) thuộc họ Flaviviridae, có đường kính 55 – 65 nm. Trọng lượng phân tử vào khoảng 4.016 Dalton, hệ gen gồm một dây xoắn đơn RNA, nằm bên trong phần nucleocapsid hình đa diện. Ở ngoài cùng là lớp vỏ lipid chứa các protein E1 và E2 (Hình 2.1). Hình 2.1. Cấu trúc của HCV (www.expertreviews.org/) Protein E1 (37 kDa) và E2 (61 kDa) là hai glycoprotein của lớp vỏ. Ở protein E2 có hai vùng siêu biến (HVR: hypervariable region) là HVR1 và HVR2. Vùng siêu biến này thường xuyên bị biến đổi qua mỗi lần virus nhân đôi tạo ra sự khác biệt giữa các genome của HCV (Bùi Hữu Hoàng, 2000). Trong chu kỳ nhân đôi của virus phải sử dụng men RNA polymerase mà men này không có khả năng sửa sai trong quá trình tổng hợp RNA từ đó làm cho bộ gen của virus khá đa dạng nên người ta đã phân lập được nhiều type khác nhau (www.drthuthuy.com/research/VGClipa.htm). Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), genome của HCV là một chuỗi đơn RNA, gồm khoảng 9400 nucleotide, được chia làm 3 vùng (hình 2.2): Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 3 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT Hình 2.2. Những protein mã hóa cho bộ gen của HCV (www.expertreviews.org/) - Đầu 5’ không mã hóa (5' NCR: non-coding region, 5' UTR: untranslated region, 5’NTR: non-translated region) gồm 341 – 344 nucleotide. - Vùng được mã hóa nằm giữa hai đầu 5’ và 3’. Vùng này chỉ có một khung đọc duy nhất gồm 9379 – 9481 nucleotide. - Đầu 3’ không mã hóa gồm: vùng đầu tiên có chiều dài từ 28 – 42 nucleotide, tiếp theo là vùng poly U hoặc poly A để báo hiệu kết thúc quá trình giải mã. Cho đến nay, theo Dev (2002) và Mindie H. Nguyen (2004), để thực hiện chính xác type HCV là phải phân tích trên đoạn Core hoặc NS5B của bộ gen HCV (http://www.hcvadvocate.org/news/reports/DDW_2004/wednesday.htm.) 2.1.2. Các loại type và yếu tố nguy cơ nhiễm HCV 2.1.2.1. Các loại type của HCV Theo Châu Hữu Hầu (2006), các tương đồng trình tự giữa các thành viên của các type khác nhau là 55 – 72%. Các type được gọi bằng chữ số Ả Rập (type 1, 2…). Việc xếp loại các type dựa trên sự so sánh các vùng khác nhau trên bộ gen. Theo P. Simmonds (2002), tới nay có 6 type (1 – 6) và hơn 50 subtype (a, b, c ) đã được xác định, phổ biến là 1a, 1b, 2a, 2b (hình 2.3). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 4 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT Hình 2.3. Các loại type và subtype của HCV theo P.simmonds Để chuẩn hoá nhiều hệ gọi tên khác nhau, các chuyên gia đã so sánh trình tự ở vùng NS5 của các biến dị HCV. Các trình tự giữa các thành viên của các type giống nhau từ 55 – 72%. Sự giống nhau giữa chúng với các subtype có liên quan khoảng 75 – 86% và thể phân lập riêng biệt trong mỗi cụm có các trình tự giống nhau 88%. 6 type (1, 2, 3, 4, 5, 6) với các subtype (a, b, c ) (bảng 2.1) được xem là hệ thống chuẩn gọi tên các type HCV (McGarvey, 1998). Bảng 2.1. Các subtype của virus viêm gan C Type Subtype Type Subtype 1 a, b, c, d, e, f, g, h, i, j, k, l, m 4 a, b, c, d, e, f, g, h, k, l, m, n, o, p, q, r, s, t 2 a, b, c, d, e, f, g, h, i, k, l, m 5 a 3 a, b, c, d, e, f, g, h, i, k 6 a, b, d, f, g, h, i, j, k, l, m, n, o, p, q (http://www.drthuthuy.com/research/XetnghiemVGC.htm) 2.1.2.2. Các yếu tố nguy cơ nhiễm HCV  Chủng tộc và giới tính Chủng tộc và giới tính có thể cũng ảnh hưởng đến tình trạng nhiễm HCV mạn. Chủng tộc Mỹ Phi được cho là có khả năng nhiễm bệnh cao hơn. Một nghiên cứu trên 57 trường hợp cho thấy, nếu BN là nam, thì diễn tiến bệnh xảy ra nhanh hơn. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 5 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114); điều này phù hợp với một nghiên cứu ở châu thổ sông Nile, nơi có tần suất viêm gan C mạn khá cao thì nam có nguy cơ nhiễm viêm gan C mạn cao gấp 2,5 lần nữ (Habib et al., 2001). Theo Lorenzo Rosaro, M.D Đại học California, những tác nhân ảnh hưởng đến bệnh viêm gan virus C là: nam, tuổi, HBV và HIV (www.youtube.com/watch?v=kfIu9uQODgQ).  Tình trạng kinh tế xã hội Theo Desmond (2000), người càng nghèo tỷ lệ nhiễm HCV càng cao (www.medscape.com/viewarticle/500414).  Tuổi Nhiễm HCV ở người lớn trên 40 tuổi thường có bệnh mạn tính tiến triển nhanh hơn. Ngược lại, nhiễm dưới 10 tuổi chỉ có 50% nguy cơ phát triển viêm gan C mạn và thường có bệnh gan nhẹ hơn. Nhiễm HCV tăng theo tuổi. Trẻ em dưới 16 tuổi, nhiễm HCV hiếm gặp ở các nước đã phát triển nhưng hay gặp ở nhiều vùng Châu Phi và Châu Á. Tại Việt Nam, theo công trình của Lã Thị Nhẫn, anti-HCV tăng dần theo tuổi: 10 – 19 tuổi là 0,72%; 20 – 29 là 1,54%; 30 – 39 là 3,22%; 40 – 49 là 3,81% và trên 50 tuổi là 11,18%. Nhưng công trình của Trương Xuân Liên lại không thấy hình ảnh này với tỷ lệ nhiễm anti-HCV theo nhóm tuổi như sau: dưới 15: 2,6%; 16 – 25: 3,2%; 36 – 45: 1,2% và trên 45: 3,4%. Sự khác biệt này có lẽ do số liệu nghiên cứu còn ít. Một nghiên cứu ở Mỹ cho thấy chỉ có 30% trẻ mang anti-HCV (+) là có HCVRNA, cho thấy tỷ lệ mạn tính của HCV ỏ trẻ em chỉ bằng phân nửa ở người lớn. Điều này khác với viêm gan B, tỷ lệ trở thành viêm gan B mạn ở trẻ em cao hơn rất nhiều so với người lớn (Châu Hữu Hầu, 2006).  Các yếu tố nguy cơ khác Theo Bùi Hữu Hoàng (2000) và Châu Hữu Hầu (2006), liên quan với các yếu tố nguy cơ lây truyền bệnh, người ta nhận thấy type 1b thường gặp ở những BN bị nhiễm HCV do truyền máu, còn type 3a thường thấy ở những BN chích xì ke (bảng 2.2). Bảng 2.2 Type của HCV và các yếu tố nguy cơ lây nhiễm Ý (1) Pháp (2,3) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 6 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT Chích xì ke Chứng Chích xì ke Truyền máu Khác 1a 1b 2a 2b 3a 4 5 6 nc hỗn hợp Số BN 48% 14% 0% - 22% - - - - - 85 14,5% 37% 32% - 11,6% - - - - - 103 36% 12% - 4% 44% 4% - - - 5-10% 41 7% 56% 4% - 21% 5% - - - 5% 75 11% 65% 14% - 4% 4% - - 2% 2% 53 1. Silini. J Hepatol, 1994: 21: S33 (A); 2. Pol. Gastroenterology, 1995 3. Nousbaum, Ann Inter Med, 1995; 122:161-8 Nc: không xếp loại được; Bn: bệnh nhân Theo Bùi Hữu Hoàng (2000), hiện nay ở các nước Tây Âu, nhờ việc tầm soát nguy cơ lây nhiễm HCV ở những người hiến máu đã làm giảm rõ rệt tỉ lệ nhiễm HCV thuộc type 1b sau truyền máu. Tuy nhiên, type 3a lại có khuynh hướng gia tăng do việc chích xì ke đã trở thành cách lây nhiễm HCV chủ yếu ở các nước này. Nếu tiếp xúc nhiều lần với nguy cơ lây bệnh, ví dụ như BN truyền máu nhiều lần có thể sẽ bị nhiễm nhiều loại type khác nhau (Bendinelli et al., 1999). Một số tác giả cũng ghi nhận rằng sự khác biệt về type có liên quan đến các tổn thương tiến triển ở gan, ví dụ như type 1b có nguy cơ tương đối bị ung thư gan gấp 3 lần so với các type khác nhau (bảng 2.3) (Bùi Hữu Hoàng, 2000). Tuy nhiên, các nghiên cứu ở Pháp và Ý lại thấy các tổn thương mô học ở gan độc lập với các kiểu gen, như tình trạng xơ gan thường gặp ở những BN lớn tuổi bị nhiễm HCV do truyền máu từ hàng chục năm nên thường là type 1b; còn các type khác thường bị nhiễm ở người trẻ cho nên ít gặp các tổn thương xơ hóa gan nặng ở gan (Bùi Hữu Hoàng, 2000). Bảng 2.3. Type 1b và nguy cơ ung thư gan Nơi nghiên cứu Số BN Khoảng tin cậy 95% Silini et al (1996) Ý 166 2,0 (1,3-3,1) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 7 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT Hatzakis et al (1996) Hy Lạp 17 3,8 (1,1-14,0) Donato et al. (1997) Ý 172 2,9 (0,9-10,0) Theo Châu Hữu Hầu (2006), hành vi tình dục có nguy cơ, trình độ văn hóa thấp, tình trạng hôn nhân có vấn đề, hút thuốc, uống rượu cũng là các yếu tố nguy cơ. Một nghiên cứu ở Mỹ nhận thấy tiểu đường type 2 ở người nhiễm HCV cao hơn gần 4 lần người không nhiễm HCV trên 40 tuổi. Tuy vậy, khoảng 50% nguồn nhiễm HCV còn chưa được hiểu rõ. Lan truyền trong gia đình có thể xảy ra nhưng hiếm gặp. Nhiễm virus có thể do dùng chung dao cạo râu, bàn chải đánh răng, ống tiêm và kim tiêm không vô khuẩn với những người nhiễm virus, tiêm chích ma túy, châm cứu, cắt lễ (Bùi Đại và cộng sự, 2008). 2.1.3. Cách thức xâm nhập và sinh sản của HCV 2.1.3.1. Cách thức xâm nhập HCV xâm nhập thẳng vào cơ thể qua đường máu; rồi tấn công tế bào gan và sinh sôi nẩy nở tại đây. HCV làm cho tế bào gan sưng lên và đồng thời phá vỡ các tế bào gan. Có đến 85% những người bị nhiễm HCV có khả năng trở thành bệnh mạn tính (có nghĩa là 6 tháng sau khi bị nhiễm, bệnh vẫn không hết). Ða số những người bị viêm gan C mạn tính không thấy có triệu chứng nào và vẫn có cuộc sống bình thường. Tuy nhiên, trong số 10 – 25% người có HCV mạn tính, bệnh sẽ âm thầm tiến triển trong khoảng 10 – 40 năm, và có thể làm hư gan trầm trọng, xơ gan, hoặc ung thư gan (http://www.youtube.com/watch?v=kfIu9uQODgQ ). 2.1.3.2. Sự sinh sản của HCV HCV có thể xâm nhập vào tế bào gan và các tế bào khác như: tế bào đơn nhân máu ngoại vi và hạch bạch huyết. Tuy nhiên, sự sao chép của HCV chưa được biết nhiều (Châu Hữu Hầu, 2006). Theo PG, AKI, Zurich (2002) và Châu Hữu Hầu (2006), HCV xâm nhập vào các tế bào theo cơ chế nhập bào. Tuy nhiên, sự nhập bào cũng như các thụ thể liên quan chưa được biết nhiều. Khi HCV vào bên trong, glycoprotein E2 không đủ để dung hợp màng tế bào và một vùng kỵ nước của glycoprotein E2 được cho là giúp dung hợp vỏ ngoài virus vào màng. Lúc nhập bào, sự kết hợp của lõi virus với tiểu đơn vị 60S của ribosom vật chủ có thể góp phần vào việc cởi bỏ vỏ ngoài của RNA và khởi đầu dịch mã HCV. Sự chế biến phân giải HCV Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 8 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT polyprotein có thể cùng một lúc với dịch mã hoặc sau dịch mã và qua trung gian bởi protease của vật chủ cũng như của virus. Trước khi phóng thích ra khỏi tế bào chủ, HCV tạo vỏ ngoài cho mình và các hạt RNA được tạo vỏ nảy chồi qua màng bào tương. HCV kết hợp chủ yếu với lưới nội bào tương, không có protein virus định vị trong nhân. Cuối cùng virion HCV được phóng thích ra ngoài lưới nội bào tương với khoảng 10 12 virion HCV mỗi ngày. Giả sử 10% tế bào gan bị nhiễm HCV, mỗi tế bào gan phóng thích 50 hạt HCV mỗi ngày. Các tế bào gan duy trì nồng độ RNA nội tế bào thấp; khoảng 3x10 11 phân tử RNA được sản xuất mỗi ngày. Cũng như HBV, các thành phần quan trọng của các hạt HCV được phóng thích có thể là các virion sao chép khiếm khuyết, hoặc các cấu trúc lõi trần. Với thời gian bán tồn của một virion chỉ 4 – 7 giờ, đa số BN có nồng độ HCVRNA trong huyết thanh thấp là có thể hiểu được. 2.2. Tình hình dịch tễ học của bệnh viêm gan virus C 2.2.1. Trên thế giới Hiện nay, 3% dân số thế giới nhiễm HCV. Chính vì vậy, nhiễm HCV đang là vấn đề báo động (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=hstat4.section.22114). Theo số liệu của WHO cho thấy xấp xỉ 170 triệu người trên thế giới nhiễm HCV (www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi? rid=hstat4.section.22114;www.dr.thuthuy.com / research/peg_rib_geno6.html; www.youtube.com/watch?v=J4TCo-qVoKk). Hiện nay con số này đã lên đến 180 triệu người (www.who.int/immunization/topics/hepatitis_c/en/). Tình trạng nhiễm HCV ở các nước thay đổi từ 0,1 – 5 % dân số: Mỹ 4,1 triệu (1,6%) (Amstrong GL, 2006); Pháp 500 – 650.000 ( 1 – 1,3%); Úc 190.000 (1%). Ở các nước Á – Phi; tỉ lệ nhiễm ở Indonesia là 3,9%; Yemen 6%, Lebanon 0,11%; Ai Cập 21%. Ở các nước phát triển, HCV là nguyên nhân của 20% các ca viêm gan cấp độ virus , 70% viêm gan ghép gan (Trần Ngọc Bảo, 2000). Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 9 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT Hình 2.4. Phân bố HCV trên thế giới (http://international_abbotmolecular.com/HepatitisCDemographics_2562.aspx) Theo WHO, tình hình nhiễm HCV trên thế giới cho thấy có sự khác nhau nổi bật giữa các vùng, các nước. Bảng 2.4. Tình hình nhiễm HCV trên thế giới Các nước Dân số (triệu) Tỷ lệ nhiễm (%) Số người nhiễm (triệu) Châu Phi 602 5,3 31,9 Mỹ 785 1,7 13,1 Trung Đông 466 4,6 21,3 Châu Âu 858 1,0 8,9 Đông Nam Á 1.500 2,2 32,3 West Pacific 1.600 3.9 62,2 Tổng 5.811 3,1 169,7 Viêm gan virus C lây nhiễm chủ yếu do tiếp xúc trực tiếp từ máu hoặc các sản phẩm từ máu của người mang virus C với máu của người bị lây nhiễm. Các đường lây nhiễm khác chiếm tỉ lệ không đáng kể (Trần Ngọc Bảo, 2000). HCV là tác nhân gây bệnh viêm gan C mạn tính lây truyền qua đường máu phổ biến nhất ở Mỹ. Theo Trần Ngọc Bảo (2000), xấp xỉ 40% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 10 [...]... ĐHCT + Đặt tube ở trên vào máy Realtime PCR c ng với chứng dương, chứng âm và 1 bộ standard với 3 nồng độ kh c nhau (102, 104, 106) + Chọn màu FAM cho standard Màu FAM và HEX cho mẫu, chứng dương và âm + C i đặt chương trình cho máy Realtime PCR hoạt động: 1 chu kỳ 95 0C - 5 phút; 40 chu kỳ: 95 0C- 15 giây; 60 0C – 1 phút + Phân tích kết quả Chứng dương và chứng âm phải đạt yêu c u và tiếp t c c c bư c. .. bằng kỹ thuật SHPT  Nhóm kỹ thuật khuếch đại m c tiêu C rất nhiều kỹ thuật đang đư c sử dụng như: NASBA (nucleic acid sequence based amplification), LCR (ligase chain reaction) và RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)  Kỹ thuật NASBA (nucleic acid sequence based amplification) Là kỹ thuật khuếch đại tr c tiếp RNA c a virus ở nhiệt độ thường Th c tế khi sử dụng với virus C không cho... tính chưa đảm bảo c đáp ứng về virus ) Tuy nhiên kỹ thuật bDNA áp dụng vào định lượng virus c độ lặp lại và độ chính x c cao 2.4.2.2 Định lượng virus C bằng kỹ thuật Realtime RT-PCR Theo Phạm Hoàng Phiệt (2000), c c thử nghiệm phát hiện kháng thể (c EIA và RIBA) không cho phép ư c định lượng virus, kỹ thuật phát hiện kháng nguyên hiện chưa đư c áp Chuyên ngành C ng nghệ Sinh h c 20 Viện Nghiên c u và. .. kit định lượng C c bộ kit trên do c ng ty c phần thương mại – sản xuất và dịch vụ Việt Á sản xuất và cung c p 3.2 Phương pháp nghiên c u 3.2.1 Đối tượng nghiên c u 3.2.1.1 Đối tượng chọn mẫu - BN đư c chẩn đoán viêm gan C dựa vào những dấu hiệu lâm sàng tại Bệnh viện Đa khoa Trung ương C n Thơ 3.2.1.2 Tiêu chuẩn chọn mẫu - BN c anti-HCV (+) và c ho c không kèm theo những dấu hiệu lâm sàng sau: + BN. .. HCV và c c triệu chứng c a bệnh viêm gan virus C 2.3.1 Diễn tiến nhiễm HCV Với những BN nhiễm HCV, ở tuần 1 – 3 một số BN c biểu hiện tăng nồng độ ALT Trong năm đầu tiên nhiễm HCV, nồng độ ALT và HCV RNA c chiều hướng giảm một c ch ổn định Tuy nhiên, không c sự phù hợp tuyệt đối giữa ALT và HCVRNA Chẳng hạn, HCVRNA c trong máu một số BN nhiễm HCV với nồng độ ALT ở m c bình thường Hơn nữa, nồng độ. .. đường cong chuẩn thiết lập với những hàm lượng bản sao HCV x c định, c thể tính đư c số lượng bản sao HCV hiện diện trong mẫu ban đầu 2.4.2.3 Định type HCV  Kỹ thuật SHPT x c định đ c hiệu type c a c u tr c gen Th c ra kỹ thuật phân tích trình tự chuỗi acid nhân là chuẩn m c vàng, song kỹ thuật này không thể áp dụng trong th c tế do tốn kém tiền c a và thời gian Bởi lý do trên nên c c kỹ thuật kh c như... như chỉ phân tích một đoạn gen c a virus c c c thay đổi đ c hiệu với type thường đư c dùng phổ biến C c vùng gen thuờng đư c khuếch đại rồi phân tích là vùng 5’NCR (ít thay đổi nhất); vùng C và vùng NS5B (tương đối ít thay đổi) Sau khi khuếch đại với kỹ thuật PCR, sản phẩm c đư c cho lai với c c đầu dò đ c hiệu type ho c PCR tổ (nested-PCR) với đ c hiệu type ở vùng C và NS5B ho c phân tích RFLP c a... mẫu, chứng dương và chứng âm + C i đặt chương trình cho máy Realtime PCR hoạt động: 1 chu kỳ 95 0C - 5 phút; 40 chu kỳ: 95 0C - 15 giây; 60 0C - 1 phút + Phân tích kết quả Chứng dương và chứng âm phải đạt yêu c u và tiếp t c c c bư c phân tích kết quả nếu: Chuyên ngành C ng nghệ Sinh h c 26 Viện Nghiên c u và Phát triển C ng nghệ Sinh h c Luận văn tốt nghiệp Th c sĩ Khóa xiv - 2010 • Trường ĐHCT Chứng dương... nên c n ít đư c sử dụng NASBA đã đư c dùng để phát hiện HIV với độ nhạy cao và độ tin c y lớn  Kỹ thuật LCR (ligase chain reaction) Là kỹ thuật chuyển RNA c a virus sang cDNA và c ng dùng mồi và c c chu kỳ nhiệt tương tự như PCR nhưng enzyme để nhân DNA lên là DNA ligase Kỹ thuật bị giới hạn về độ nhạy và tính đ c hiệu nên chưa đư c ứng dụng nhiều  Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain... Sinh h c 33 Viện Nghiên c u và Phát triển C ng nghệ Sinh h c Luận văn tốt nghiệp Th c sĩ Khóa xiv - 2010 • Trường ĐHCT Xem hình ảnh về kết quả định lượng HCV bằng Realtime RT-PCR ở phụ chương phần III 4.1.4 Kết quả định type HCV Trong số 94 BN c HCVRNA (+), c 85 BN đư c định type HCV, kết quả như sau: 4.1.4.1 Kết quả định type HCV qua kỹ thuật Realtime RT-PCR Bảng 4.9 Kết quả định type HCV qua kỹ thuật . gan Nơi nghiên cứu Số BN Khoảng tin cậy 95% Silini et al (1996) Ý 166 2,0 (1,3-3,1) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 7 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ. 10 ng/ml) vào lúc 1 tuổi. 2.4.2. Các xét nghiệm sinh học phân tử (SHPT) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 19 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv. số xét nghiệm cận lâm sàng khác của bệnh nhân. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học 2 Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa xiv - 2010 Trường ĐHCT CHƯƠNG