1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Bước đầu phát triển bộ KIT chẩn đoán nhanh bệnh lao bằng kỹ thuật polymerase chain reaction

63 668 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 63
Dung lượng 1,35 MB

Nội dung

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯƠNG THỊ LOAN BƯỚC ĐÀU PHÁT TRIỂN Bộ KIT CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH LAO BẢNG KỸ THUẬT POLYMERAS

Trang 1

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH

HỌC

DƯƠNG THỊ LOAN

BƯỚC ĐÀU PHÁT TRIỂN Bộ KIT CHẨN ĐOÁN NHANH BỆNH LAO BẢNG KỸ THUẬT

POLYMERASE CHAIN REACTION

LUẬN VĂN THẠC sĩ KHOA HỌC Chuyên ngành CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã số : 60- 42- 80

Người hướng dẫn khoa học TS TRẦN NHÂN DŨNG

Năm 200

Trang 2

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

9LỜI BẢN QUYÈN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và thầy hướng dẫn Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất

kỳ luận văn nào trước đây

TS Trần Nhân Dũng Dương Thị LoanLuận văn đính kèm theo đây, với tên đề tài:

“Bước đầu phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh bệnh lao bằng kỹ thuật polymerase Chain reactỉon ” do Dương Thị Loan thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận

văn thông qua

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 3

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

Tôi muốn gửi lòi cám ơn đến tất cả các thầy cô giảng dạy, các anh, chị, em của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học trường Đại học cần thơ, đặc biệt là các em

Đỗ Tấn Khang, Trần Yăn Bé Năm, Nguyễn Thị Giáng Đan đã giúp đỡ tôi ữong suốt thời gian thực hiện đề tài

về phía trường Đại học Y Dược cần thơ, tập thể Bộ môn sinh lý bệnh - miễn dịch Khoa Y

đã có sự giúp đỡ, tạo cơ hội và cung cấp mọi thứ cần thiết cũng như luôn động viên, khích lệ tinh thần, để tôi có thể thực hiện và hoàn tất quyển luận văn

Tôi vô cùng biết ơn Ba mẹ hai bên, chồng, con và tất cả anh chị em trong gia đình đã yêu thương, luôn luôn thông cảm, cùng chia sẽ những khó khăn, tạo mọi thuận lợi cho tôi yên tâm, có điều kiện tốt nhất để hoàn thành và đạt được kết quả tốt trong suốt quá trình học tập của mình

Yà cuối cùng là lời cám ơn đến tập thể lớp cao học công nghệ sinh học K13

TÓM LƯỢC

Tóm lược Bệnh lao là một bệnh truyền nhiễm có khả năng lây lan trong cộng đồng rất

cao, phát hiện sớm vi khuẩn lao là điều chủ yểu trong chiến dịch kiểm soát bệnh lao, việc điều trị cho bệnh nhân sẽ đạt kết quả khả quan nếu như xét nghiệm phát hiện nhanh vỉ khuẩn lao có độ chính xác và độ nhạy đáng tin cậy, phản ứng PCR là thử nghiệm khả thi, đáp ứng được các yêu cầu như: nhanh, nhạy và chính xác Mặc dù vậy, cho đến nay kỹ thuật PCR dùng để chẩn đoán bệnh lao vẫn chưa được ứng dụng rộng rãi, vì thế chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm bước đầu phát triển bộ kit chẩn đoán nhanh bệnh lao tại

TP cần thơ Mau được thu nhận từ bệnh viện lao và bệnh phổi TP cần thơ, được bảo quản và xử lý ADN được ly trích bằng phương pháp tốt nhất để tránh ngoại nhiễm Chọn

ba cặp mồi trong sổ rất nhiều các cặp mồi đã được công bố, các thông số trong công thức của phản ứng PCR đã được điều chỉnh Theo kết quả nghiên cứu, bước đầu chúng tôi đã phát triển được bộ kit nhằm góp phần trong chẩn đoán bệnh lao, trong số 127 mẫu thu được chúng tôi phát hiện được 40,9 % so với soi trực tiếp là 0 % và tương đương với phương pháp nuôi cấy (được xem như tiêu chuẩn vàng) là 39,37%, và kết quả này gần như phù hợp với bộ kit thương mại.

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 4

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

Từ khóa: bệnh lao, phản ứng chuỗi, đoạn mồi, độ nhạy, độ đặc hiệu

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 4 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 5

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT ABSTRACT

Abstract Preliminary develop a tuberculosis diagnose kit by the use

of polymerase chain reaction (PCR) method at Can Tho City

Tuberculosis is a highly contagious disease Early detection on infected patient is

of most importance in the control of tuberculosis Benefit in therapy may be improved if a fast and reliable test could be developed Polymerase chain reaction (PCR), in principle, is a rapid, cost effective test to be used in the detection of Mycobacterium tuberculosis Although there are many PCR methods for this disease were published, but there are no standard PCR method have been introduced In this study, Can Tho Hospital for Tuberculosis was selected to collect samples Approriate method was used to treat samples to avoid contamination Selected method of DNA extraction was used to obtain best result Three primers among many primers have been introduced which were used to test in this study Different parameters that influence PCR were modified to obtain high specificity and high sensitivity To validate the kit, there are 127 samples were collected from the hospital Result showed that PCR test was much better than direct observing under microscope Among 127 samples, there was 40,9 % samples were positive while 0 % samples was observed under microscope PCR test as good as culturing test (a golden method), 39,37% samples were positive.

Keywords: tuberculosis, polymerase chain reaction, primer, sensitivity, specificity

Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcX Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh họcX Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 6

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

Trang 7

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

Trang 8

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

NA-carrier nucleotide acid carrier

PCR polymerase chain reaction

Tuberculin PPD tuberculin purified protein

derivativeWHO world heath organization

Trang 9

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

CHƯƠNGI GIỚI THIỆU

•Bệnh lao là một trong ba bệnh truyền nhiễm gây tử vong cao nhất trên thế giới HIV/AĨDS giết 3 triệu người mỗi năm, bệnh lao giết 2 triệu người và bệnh sốt rét giết

1 triệu người ( http://wikipedia.org/wiki/Lao ) Hơn 100 năm trước đây, Robert Koch

đã chứng minh được lao là bệnh nhiễm khuẩn khi ông tìm thấy trong đàm người bị bệnh lao phổi có một loại trực khuẩn hình que kháng cồn, kháng toan được gọi là trực khuẩn Koch (bacilie de Koch:viết tắt là BK)

Ngày nay, bệnh lao đang xuất hiện trở lại cùng với đại dịch HIV/AIDS trở thành một trong những căn nguyên gây mắc bệnh và tử vong chủ yếu, đặc biệt tại các nước đang phát triển Ở các nước này, người dân có mức thu nhập thấp nên sẽ có tỷ lệ nhiễm lao và mắc lao cao hơn những nước phát triển, nghèo đói và suy dinh dưỡng làm giảm sức đề kháng của cơ thể là nguyên nhân quan trọng và chủ yếu làm cho người ta dễ mắc lao (http://wikipedia.org/wiki/Laoỵ

Do vậy việc phát hiện, chẩn đoán sớm và chính xác bệnh lao là yêu cầu bức xúc của

cả xã hội Để phát triển các kỹ thuật chẩn đoán bệnh lao là điều tất yếu và cần thiết Hiện nay chỉ có một công ty ở TP.HỒ Chí Minh đã sản xuất bộ kit1 dùng để chẩn đoán bệnh lao bằng kỹ thuật PCR và vói xu hướng ngày nay PCR được xem là qui trình khá chuẩn góp phần trong việc phát hiện vi khuẩn gây bệnh, vừa nhanh chóng, vừa chính xác và là kỹ thuật xét nghiệm không thể thiếu khi cần chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm ở các phòng xét nghiệm hiện đại (Phạm Hùng Vân 1996) Tuy nhiên kỹ thuật này đòi hỏi các phòng xét nghiệm phải được trang bị những thiết bị phù hợp, với sự phát triển của xã hội hiện nay và trong tương lai gần sẽ có rất nhiều thành phố

1 Là hỗn hợp hóa chất được làm sẳn để xử lý mẫu, trích ADN và PCR master mix

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 9 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 10

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

trong vùng Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) có khả năng để trang bị những loại thiết bị này Như vậy, nhu cầu về kit xét nghiệm cho các bệnh nhiễm trùng sẽ rất lớn

và qua đó cho thấy rằng, bộ kit cần được phát triển nhằm có thể theo dõi về tính hiệu lực một cách thường xuyên trước khi đưa vào qui trình xét nghiệm, để làm được điều

đó bộ kit phải được nghiên cứu và sản xuất tại cho, vói những yêu cầu như trên,

chúng tôi thực hiện đề tài “ Bước đầu phát triển bộ kỉt chẩn đoán nhanh bệnh lao

bằng kỹ thuật polymerase Chain reaction”

Mục tiêu của đề tài:

- Chọn cặp mồi (primers) thích hợp và sử dụng các hóa chất cần thiết để tạo nên bộ

kit hổ trợ cho việc xét nghiệm bệnh lao

- So sánh bộ kit thử nghiệm chẩn đoán bệnh lao với các xét nghiệm hiện hành

So sánh kết quả của bộ kit thử nghiệm vói bộ kit được pha chế sẳn (bộ kit thương

mại)

.CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Tình hình bệnh lao trên thế giói và tại Việt Nam

2.1.1 Tình hình bệnh lao trên thế gỉói

Theo con số thống kê của WHO (Tổ chức Y tế thế giới:TCYTTG) có khoảng 2 tỷ người trên thế giới bị nhiễm bệnh lao Các chuyên gia cho rằng cần có nhiều loại thuốc trị lao mới cũng như nhiều phương pháp chẩn đoán mới nhằm phát hiện sớm bệnh lao đặc biệt là các chủng lao kháng thuốc Hiện nay bệnh lao vẫn là một trong

số các bệnh có tỷ lệ mắc và tử vong hàng đầu trong các bệnh nhiễm trùng trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển trong đó có nước ta Theo thông báo của TCYTTG mỗi năm có thêm 8-9 triệu người mắc lao mới và 98% số người chết do lao thuộc các nước đang phát triển

Năm 1993, TCYTTG đã tuyên bố tình trạng khẩn cấp toàn cầu của bệnh lao và mối

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 10 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 11

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

hiểm họa của nó trong tương lai là bệnh lao kháng thuốc, tỷ lệ điều trị thành công trên toàn cầu đạt 82%, nhưng ước tính tỷ lệ phát hiện chỉ đạt 37% số bệnh nhân Như vậy, còn rất nhiều bệnh nhân lao không được chữa trị đang tiếp tục lây bệnh cho cộng đồng, hơn 33% số bệnh nhân lao toàn cầu thuộc về khu vực Đông-Nam Châu Á Mức

độ nặng nề của bệnh lao đã ảnh hưởng tói thu nhập quốc dân và chỉ số phát triển con người của các quốc gia Các nghiên cứu về kinh tế y tế cho thấy, mỗi bệnh nhân lao

sẽ mất trung hình 3-4 tháng lao động, làm giảm 20-30% thu nhập bình quân của gia đình Những gia đình có người chết sớm vì bệnh lao có thể sẽ mất tới 15 năm thu nhập Bệnh lao đã tác động mạnh tới 70% đối tượng lao động chính của xã hội, làm lực lượng sản xuất bị giảm sút, năng suất lao động giảm (Trung tâm truyền thông giáo dục sức khỏe-BỘ Y tế)

Diễn đàn các đối tác chống lao lần thứ nhất diễn ra năm 2001 tại trụ sở của Ngân

hàng thế giới ở Washington D.c với sự có mặt của đại diện cấp Bộ trưởng từ các quốc

gia có tình hình bệnh lao nặng nề đã nhận định, bệnh lao là nguyên nhân chủ yếu làm nghèo đói dai dẳng và là trở ngại đối vói sự phát triển kinh tế xã hội Bệnh lao là bệnh của người nghèo, lây lan nhanh ữong cộng đồng có điều kiện sống chật chội, thiếu vệ sinh và dinh dưỡng kém Trên 98% số người chết do lao trên toàn cầu thuộc các nước

có thu nhập vừa và thấp, 75 % số người mắc bệnh lao ở các lứa tuổi 14-55, là tuổi

làm ra nhiều của cải nhất trong cuộc đời Bệnh lao là kết quả của nghèo đói và nghèo

đói lại là nguyên nhân làm cho bệnh lao phát triển Với chủ đề ' Bệnh lao có ở một nơi thì sẽ có ở khắp mọi nơi' mà “Chương trình chống lao thế giới đã đưa ra cho năm

2007” trong điều kiện kinh tế, xã hội của đất nước, các địa phương đang đà phát triển mạnh mẽ sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho công tác phòng chống bệnh lao Để thực hiện

có hiệu quả mục tiêu trên cần phải tiếp tục củng cố mạng lưới phòng chống bệnh lao; tăng cường công tác phát hiện bệnh nhân lao tại tuyến quận, huyện, thị xã và các tuyến y tế cơ sở; hoạt động giáo dục truyền thông cần thường xuyên hom trên các phương tiện thông tin đại chúng; đào tạo cho các cán bộ và cung cấp đầy đủ thuốc

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 12

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

men, hóa chất, dụng cụ Bảo đảm tốt công tác phát hiện, quản lý và điều trị, thực hiện tốt các biện pháp ngăn ngừa, phòng bệnh một cách hợp lý và an toàn ( http://www.cimsi.org.vn/Lao/home.asp~ )

2.1.2 Tình hình bệnh Lao ở Việt Nam

Ở nước ta, bệnh lao còn phổ biến và ở mức độ trung bình cao Việt Nam đứng thứ

13 trong 22 nước có số bệnh nhân lao cao trên toàn cầu (TCYTTG., 2004) Trong khu vực Tây - Thái Bình Dương, Việt Nam đứng thứ ba sau Trung quốc và Philipinnes về

số lượng bệnh nhân lao lưu hành cũng như bệnh nhân lao mới xuất hiện hàng năm Năm 1995, trước những biến động xấu đi của tình hình dịch tễ bệnh lao toàn cầu, công tác chống lao thực sự bắt đầu phải đối mặt với những thách thức mới là bệnh lao kháng thuốc và Lao/HIV, nhà nước và Bộ Y tế Việt Nam đã quyết định đưa Chương trình phòng chống lao thành một trong những chương trình y tế Quốc gia ừọng điểm Cùng với sự đầu tư phát triển các Chương tình y tế quốc gia nói chung, Bộ Y tế và Chính phủ đã ưu tiên đầu tư đồng bộ lượng rất lớn cán bộ, kinh phí và trang thiết bị cho Chương trình phòng chống lao Ban chỉ đạo chương trình chống lao và Chính quyền địa phương các cấp đã tham gia tích cực triển khai công tác này, cùng với sự hợp tác và giúp đõ có hiệu quả về tài chính và kỹ thuật của các tổ chức quốc tế Hiện nay nguy cơ nhiễm lao hàng năm ở nước ta ước tính là 1,5% (ở các tỉnh phía Nam là 2%, ở các tỉnh phía Bắc là 1%)

Ước tính với dân số 70-80 triệu, hàng năm ở nước ta có:

SỐ mới mắc lao (mọi thể): 130.000

Số lao phổi BK dương tính mới: 60.000

Tổng số trường hợp lao: 260.000

Tổng số lao phổi BK dương tính: 120.000

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 12 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Bảng 1 Tình hình bệnh lao ở Việt Nam

(Nguồn Trung tâm truyền thông giáo dục sức khỏe trung ương

-Bộ Y tế, 2005 )

Trang 13

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

Nước ta thuộc loại trung bình về dịch tễ lao so với các nước vùng Tây Thái Bình Dương là vùng dịch tễ lao vào loại trung bình trên thế giới Trên thực tế chỉ số nguy

cơ nhiễm lao hàng năm có thể cao hơn 1,5% như vậy các con số nêu trên có thể sẽ còn lớn hơn Điều đó đã làm tăng thêm sự khó khăn đối vói công tác phòng chống lao không những trong những năm tới mà sẽ còn tồn tại trong thời gian khá dài, ngay cả khi đã bước sang thiên niên kỷ mới ( http://www.cimsi.or g vn/Lao/home.asp )

2.2 Vi khuẩn họ Mycobacteriaceae Họ Mycobacteriaceae bao gồm các trực khuẩn

có tính chất bắt màu thuốc nhuộm một cách đặc biệt Vi khuẩn khó bắt màu thuốc nhuộm base nhưng khi đã bắt màu thuốc nhuộm rồi thì không bị dung dịch cồn, acid tẩy màu Người ta gọi chúng là vi khuẩn kháng acid Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen ứng dụng đặc tính trên của vi khuẩn kháng acid Họ Mycobacteriaceae gồm nhiều loài; một số sống hoại sinh ở đất, nước, thực vật; một số gây bệnh ở người và động vật

Nhóm gây bệnh lao

+ Mycobacterium tuberculosis: vi khuẩn lao gây bệnh lao trên người.

+ Mycobacterium bovis: vi khuẩn lao bò có thể gây bệnh ở ngưòi.

+ Mycobacterium avium: vi khuẩn lao chim, ít gây bệnh ở người, thường gặp

trong lao hạch ở người

+ Mycobacterium microti: vi khuẩn gây bệnh lao ở chuột Mycobacterium Atipìques:

là các vi khuẩn kháng cồn kháng toan không điển hình: là nhóm vi khuẩn kháng acid

có thể gây bệnh cho người nhưng không gây bệnh ch

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 13 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 14

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

ochuột lang hoặc thỏ (phân biệt với nhóm gây bệnh lao) Dịch tể học cho thấy nó có thể gây nên sự nhiễm trùng rộng lớn ở nhiều vùng nhung chứng bệnh tương đối nhẹ

Mycobacteirum ỉeprae: gây bệnh phong.

2.3 Vỉ khuẩn ỉao (Mycobacterium tuberculosừ)

2.3.1 Đăc đỉểm sinh vât hoc

23.1.1 Hình thể

Trực khuẩn lao thường gọi là BK (Bacỉỉle de Koch) là trực khuẩn mãnh hơi cong kích thước 2 - 4|U,m X 0,2 - 0,5fim chúng đứng riêng rẽ hoặc thành từng đám trên tiêu bản Khỉ nhuộm Ziehl-Neelsen vỉ khuẩn bắt màu đỏ cố khỉ cho thấy những hạt màu đỏ bên trong tế bào vi khuẩn do không bị cồn và acid làm mất màu đỏ của Fuchsin (hình 1) và (hình 2)

Trang 15

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

học

tỷ lệ lipid cao chiếm 10-40% trọng lượng khô của vi khuẩn Vì sẳn lipid ở vách tế bào (60%) vi khuẩn có tính chất kị nước nên chúng có xu hướng dính liền với nhau lúc phát triển ở môi trường lỏng Tính chất kị nước cũng cắt nghĩã tính chất kháng acỉd và khả năng chậm phát triển của vi khuẩn Các chất lipid hay được nghiên cứu là mycozid

c, cord~faetor và các chất sáp Các chất lỉpỉd cố liên quan đến độc tính của vỉ khuẩn, như đối với vi khuẩn gây bệnh, sáp D chiếm 6-8%, còn ở chủng không gây bệnh sáp D

chỉ chiếm 2 %.

2.3.1.3 Tính chất nuôỉ cấy và khả năng đề kháng

Vi khuẩn lao là loại hiếu khí bắt buộc, nhiệt độ thích nghi 37°c, pH thích nghi

6.7-7.0, vi khuẩn được nuôi cấy ở môi trường giàu chất dinh dưỡng như môi trường đặc Lowenstein-Jensen, Ogawa Mark, môi ừường lỏng Sauton.ở môi trường Lowenstein- Jensen khuẩn lạc xuất hiện khoảng sau một tháng, khô nhăn nheo giống như hoa su lơ (hình 4) Ở môi trường lỏng Sauton vi khuẩn mọc nhiều ở bề mặt chất lỏng thành những mảng nhăn nheo, khô và dính vào thành ống

Vỉ khuần lao phát triển chậm, thời gian nhân đôi là 20-24 giờ trong khỉ của E coli là 20

phứt Những chủng cố độc lực cao sẽ tạo thành những khuẩn lạc R Những chửng cố độc lực kém tạo thành những khuẩn lạc ít nhăn nheo hơn và phát triển ít cố

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 15 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 15 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 16

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

trật tự hơn So với các vi khuẩn không sinh nha bào khác vi khuẩn lao không đề kháng hơn với nhiệt, tia cực tím và phenol Khử trùng theo phương pháp Pasteur (đun 62°c trong 30 phút) đủ để giết chết vi khuẩn lao Trái lại vi khuẩn lao đề kháng nhiều hơn với độ khô và một số chất sát trùng; rất khó giết chết vi khuẩn lao với những chất tẩy uế thông thường như dung dịch cresyl 5%, nước Javel; cồn iốt chỉ có thể giết chết vi khuẩn lao trong khoảng từ 2 đến 5 giờ

2.3.2 Khả năng gây bệnh

Khả năng gây bệnh của vi khuẩn lao phụ thuộc vào độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể Sự nhiễm trùng lần đầu ở một cá nhân thường tạo thành một thương tổn tự giói hạn nhưng đôi khi chứng bệnh có thể tiến triển, hình như do sức đề kháng kém hoặc do lượng vi khuẩn xâm nhiễm quá nhiều Do sự thăng bằng của sức đề kháng

và độc lực của vi khuẩn thương tổn lành và tiến triển có thể tồn tại ở một cơ thể và chứng bệnh cho thấy sẽ có một quá trình mạn tính lúc bệnh không được điều trị bằng kháng sinh Bệnh lao thường diễn biến qua 2 giai đoạn:

- Lao sơ nhiễm: Lần đầu tiên xâm nhập cơ thể vi khuẩn lao thường gây nên thương tổn ở vùng ngoại vi rất thông khí của phổi Lúc cơ thể trở nên quá mẫn trong 2-4 tuần

lễ sau thì thương tổn dạng hạt xuất hiện và hạt lao điển hình được hình thành Lúc này

vi khuẩn lao có thể đến những hạch bạch huyết kế cận và sau đó qua đường bạch huyết, đường máu và có thể đi khắp cơ thể

- Lao tái phát: Phần lớn bệnh lao ở người là do sự hoạt động trở lại của ổ bệnh trầm lặng của lao sơ nhiễm Những ổ bệnh thường khu trú ở phần dưới hoặc phần đỉnh hoặc gần đỉnh của phổi, ở đó sự nhiễm trùng dai dẳng nhờ nồng độ oxy cao Lúc chứng bệnh được khám phá thì thương tổn bã đậu thường đã hóa lỏng và hang lao hình thành tạo điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn lao phân tán nhanh chóng Vi khuẩn lao có thể lây truyền sang người khác qua đàm giải và theo phế quản đến những phần khác nhau của phổi Ngoài phổi phần lớn những cơ quan khác của cơ thể cũng có thể là vị trí của bệnh lao, thông thường là đường tiểu, xương, khớp, hạch, màng phổi, màng bụng

2.3.3 Miễn dịch và mẫn cảm trong bệnh lao

2.3.3.I.Hiện tượng Koch

Vi khuẩn lao được tiêm dưới da vào đùi phải của chuột lang 10 đến 14 ngày sau một

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 16 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 17

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

nốt sần được tạo thành ở chỗ tiêm, nốt sần phát triển thành loét Ngoài ra vi khuẩn còn xâm chiếm những hạch bạch huyết kế cận Cuối cùng trong vòng 6 - 8 tuần lễ chuột chết vì lao toàn thân Nếu trong tuần lễ thứ 2 hoặc thứ 3 tiêm vi khuẩn lao lần

2 vào đùi trái chuột lang thì sự đáp ứng lần này nhanh hơn, mạnh mẽ hơn nhưng cũng giới hạn hơn Thương tổn xuất hiện trong vòng 2-3 ngày, lập tức lở loét nhưng lại lành nhanh chóng Những hạch bạch huyết kế cận không bị xâm nhiễm Như thế cơ thể chuột lang đã hình thành một sự đáp ứng biến thể với sự nhiễm trùng lần hai, những vi khuẩn đưa vào lần sau khu trú hơn lần đầu và phát triển chậm hơn Con vật có thể loại

bỏ những vi khuẩn xâm nhập lần sau, như thế nó đã được miễn dịch một phần nào

2.3.3.2 Vaccine BCG

Được điều chế từ một chủng lao bò giảm độc bằng cách cấy truyền nhiều lần (230 lần trong 13 năm) ở môi trường chứa mật bò và glycerin Vaccine này tăng sức đề kháng của cơ thể đối với bệnh lao nhưng tính miễn dịch lại không hoàn toàn, ở người nó làm giảm số người mắc bệnh lao và tỷ lệ tử vong Tiêm trong da 0,1 ml vaccine, mỗi ml chứa 0,5 đến 1 mg BCG (BCG :Bacillus Calmette-Guerin là vaccine được hai nhà bác học người Pháp là Calmette và Guerin đã kiên trì nghiên cứu trong 13 năm từ 1908 đến 1921)

2.3.3.3 Man cảm đối với bệnh lao

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 18

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

Là mẫn cảm kiểu chậm phát sinh sau khi nhiễm vi khuẩn lao, khám phá tính mẫn cảm

đó bằng phản ứng tuberculin Phản ứng tuberculin là một loại xét nghiệm nội bì để đánh giá miễn dịch lao Bản chất của nó là một phản ứng quá mẫn muộn Tuberculin là một sản phẩm chuyển hóa của vi khuẩn lao Tuberculin dùng trong y tế hiện nay là dẫn chất protein tinh khiết (tuberculin purified protein derivative: tuberculin PPD) được điều chế từ sản phẩm chịu nhiệt của môi trường lỏng nuôi vi khuẩn lao Tiêm 0,1 ml tuberculin PPD chứa 5 đơn vị tuberculin (5 TU) vào trong da ở mặt trước cẳng tay (hình 4) Đọc kết quả sau 72 giờ Nếu tại nơi tiêm xuất hiện nốt cứng đỏ vói đường kính từ lOmm trở lên là phản ứng dương tính, tức là cơ thể đã có miễn dịch với vi khuẩn lao.PPD from

Ta iuseierta) 1s injected inio The area

Phản ứng tuberculin dương tính trong các trường hợp: BỊ bệnh lao, nhiễm

Mycobacteirum tuberculosis nhưng không mắc bệnh lao, nhiễm Mycobacteirum khác

và sau tiêm vaccine BCG, Phản ứng dương tính mạnh có thể gây hoại tử hoặc loét Phản ứng tuberculin xuất hiện khoảng một tháng sau khỉ nhiễm trùng và tồn tại trong

cơ thể nhiều năm và cố khỉ suốt đòi Phản úng âm tính lúc chưa nhiễm lao, lúc nhiễm lao chưa quá một tháng, ỉức bị lao nặng trong tình trạng suy nhược không còn phản ứng, lức mắc bệnh cấp tính như sồi, bệnh Hodgkin

2.4 Chẩn đoán lao bằng chụp hình x-quang phồỉ

Phương pháp phổ biến hiện nay dùng đề phát hiện bệnh lao là đọc kết quả hình ảnh phổi qua kỹ thuật chụp bằng tia X (hình 5) đây là một phương pháp quí báu gốp phần trong chấn đoán ỉao phổi Phương pháp x-quang cố độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu thấp Nhiều bệnh có hình ảnh x-quang phổi giống với lao phổi, lao phểỉ ngược lại cũng

cổ hình ảnh dễ nhầm lẫn với các bệnh phổi khác Mặt khác rất khó phân biệt tổn thương ở phổi do lao cũ đã ổn định hay lao mới đang tiến triển, vì thế x-quang không phải là yếu tố quyết định trong việc chẩn đoán lao phổi Kết quả chẩn đoán càng phức tạp hơn khỉ tồn thương ở những người mắc bệnh lao phổi đồng thời cũng bị nhiễm

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 18 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 18 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 19

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

HIV/AIDS thì tổn thương sẽ thay đồi nhiều so với những hình ảnh được mô tả trước đây Trong trường hợp này để chẩn đoán lao phổi phải phéi hợp nhiều biện pháp, đồng thời phải kết hợp với nhiều yếu tố khác

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 19 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 19 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 20

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

ADAJVL

Hình 5 Hình ảnh chụp X quang phổi (nguồn Medline plus

Medical Encyclopedia Tuberculosis)

2.5 Chẩn đoán vi sính vật

2.5.1.Nhuộm theo phương pháp Zỉehỉ~Neelsen và đem soỉ tươi trực tiếp

Đề biết được một người cố mắc lao hay không thì từ trước đến nay ngoài việc chụp X- quang phổi còn cố các phương pháp kỉnh điển khác dùng trong chẩn đoán bệnh lao là làm xét nghiệm đàm tìm vi khuẩn lao (phương pháp soi trực tiếp) mẫu đàm được soi trực tiếp trên kính hiển vi sau khỉ đã được nhuộm bằng phương pháp Ziehl - Neelsen (ZN) Chẩn đoán lao phổi bằng xét nghiệm đàm tìm vi khuẩn lao là biện pháp rất cơ bản, đơn giản, rẻ tiền rất phù hợp vói hoàn cảnh và điều kiện của các nước nghèo, đang phát triển Người bệnh nghỉ là bị lao khỉ đến khám, phải lấy đàm 3 lần, mỗi lần mỗi ngày khác nhau để xét nghiệm tìm vi khuẩn lao

Cách mẫu lấy như sau:

MSu 1: lấy đàm tại chỗ khi bệnh nhân đến khám

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 20 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 20 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 21

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

Mau 2: sau khỉ lấy đàm tại chỗ để cố xét nghiệm đàm lần thứ nhất, người bệnh được giao cho một cốc đựng đàm để sáng sớm hôm sau khi mới ngủ dậy lấy mẫu đàm đưa đến phòng khám (xét nghiệm đàm lần thứ hai)

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 21 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngỉtnh Công nghệ Sùứi học 21 Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 22

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

Mẩu 3: Lấy khỉ bệnh nhân đến đưa mẫu đàm lần 2 Bệnh nhân phải được điều trị ngay nếu kết quả xểt nghiệm cố 2 lần dương tính trở lên (Chuyên trang Lao của Viện Thông tin Thư viện Y học Trung ương, Bộ Y tế Việt Nam)

Điều quan trọng là phải hướng dẫn bệnh nhân lấy đàm đứng cách (hình 6) và đủ số mẫu cần thiết, đem nhuộm và soi tươi trên kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn lao Cách đánh giá kết quả đang được sử dụng ở nước ta như sau:

-Khi không có AFB trên 100 vi trường: kểt quả âm tính (-)

-Từ 10 đến 99 AFB trên 100 vi trường: kết quả dương tính (+)

-Từ 1 đến 10 AFB trên 1 vi trường: kết quả dương tính (++)

Sputum sample is obtained by coughing and is examined

(nguồn Medline plus Medical

Trang 23

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

Theo công trình nghiên cứu của một số nhà khoa học nếu trong lml đàm cố chứa trên

5000 BK (vi khuẩn lao) khỉ đem nhuộm soỉ trực tiếp mẫu đàm sẽ cố kết quả BK dương tính (+) (thấy được vi khuẩn lâo trên kính hiển vi) Nếu mẫu đàm chứa dưới

5000BK/ml thì ít cố khả năng quan sát được chứng dưới kính hiển vi, do đố trong thực

tế nhiều khỉ về lâm sàng và chụp hình phổi đã cố bỉểu hiện bệnh lao phổi rõ rồỉnhưng khi thử đàm thì lại cho kết quả BK âm tính (-) (không thấy được vi khuẩn bằng cách đem nhuộm soi trực tiếp trên kính hiển vi) vì thế cần thực hiện các phương pháp nuôi cấy

2.5.2 Phân lập vi khuẩn

Dù kết quả nhuộm thế nào cũng cần nuôi cấy vi khuẩn, vì nuôi cấy nhạy hơn nhuộm Hơn nữa đặc tính khuẩn lạc còn cho phép phân biệt vi khuẩn lao với những vi khuẩn kháng acid không gây bệnh ở người và vi khuẩn kháng cồn kháng toan không điển hình Ngoài ra vi khuẩn phân lập còn được sử dụng để làm kháng sinh đồ.Vi khuẩn lao thuộc loại hiếu khí, chúng phát triển rất chậm, thường từ 1 đến 2 tháng mới tạo được khuẩn lạc trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt chứa đường, đạm, dưỡng khí và các loại muối (Na,Cl,K,Mg ) ngoài ra chúng còn cần các sinh tố nhóm B và hàng loạt các acid amin, các acid vô cơ và lipid Tất cả các chất này đều có trong trứng, máu và khoai tây (môi trường Loeweintein- Jensen) vi khuẩn lao phát triển tốt nhất ở môi trường có pH

từ 6.8 đến 7.2 nhưng vẫn phát triển được trong môi trường có pH acid :5.5 và pH kiềm:

8.0 Nhiệt độ môi trường để BK có thể phát triển là 29°c - 42°c nhiệt độ thuận lọi nhất

là 37°c - 38° c (Bệnh học lao và bệnh phổi, (1994), Tập 1, Nhà xuất bản y học Hà Nội)

Phương pháp nuôi cấy là phương pháp chỉ có thể tiến hành ở các nơi có điều kiện trang bị kỹ thuật tốt, phải chờ từ 2-3 tháng sau mới trả lòi kết quả được vì vi khuẩn lao tăng trưởng rất chậm trong điều kiện bình thường, trung bình từ 20 - 24 giờ/1 lần).Vì vậy việc nuôi cấy để nhận định vi khuẩn cần nhiều thời gian Các kỹ thuật nuôi cấy như

kỹ thuật BACTEC, MGIT ở các nước phát triển cũng ngày càng được hoàn thiện

2.5.3 Kỹ thuật sinh học phân tử: kỹ thuật PCR (polymerase Chain reactỉon)

Những năm gần đây các kỹ thuật sinh học phân tử được đưa vào sử dụng trong lâm sàng cùng vói một số kỹ thuật hóa sinh và vi sinh học khác đã làm cho việc phát hiện, chẩn đoán các bệnh nhiễm trùng trở nên nhanh chóng, chính xác hơn Kỹ thuật được nói đến nhiều và đã được đưa vào sử dụng trong nghiên cứu và trong thực tiễn lâm sàng đó là kỹ thuật PCR do Kary Mullis phát hiện, nhờ đó ông đã nhận được giải

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 23 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 24

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

thưởng Nobel về hóa học năm 1993 Trong chuyên ngành lao, PCR được dùng để xác định nhanh vi khuẩn lao trong môi trường nuôi cấy và trong các mẫu bệnh phẩm Ngoài

ra PCR có thể xác định type, gen của các chủng vi khuẩn lao, qua đó phát hiện vi khuẩn lao gây bệnh cũng như có thể phát hiện nhanh vi khuẩn lao kháng thuốc (Phạm Hùng Vân, 1996)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 24 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 25

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

Nguyên lý của kỹ thuật PCR là sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN vói việc dùng các đoạn ADN mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mói bổ sung với sợi này Đầu tiên các sợi ADN khuôn mạch đơn sẽ được tạo ra theo cách đơn giản là đun

nóng dung dịch có chứa ADN mạch kép đến nhiệt độ (94°c hoặc 95°C) để làm biến

tính (dénaturation) acid nucleic từ dạng sợi đôi (ds ADN) biến thành sợi đơn (ss ADN) Giai đoạn tiếp theo là giai đoạn bắt cặp (annealing) lúc này nhiệt độ cho phản ứng phải

được hạ xuống vào khoảng (55°c - 65°C) với sự hiện diện của những đoạn mồi

(primers) chuyên biệt có sẳn trong dung dịch sẽ bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung vào hai đầu của chuỗi acid nucleic khuôn (các đoạn ADN mồi là những đoạn ADN ngắn có chiều dài từ 18 - 22 nu) Cuối cùng là giai đoạn kéo dài (extension) nhiệt độ của phản ứng ở giai đoạn này là (72°C) là nhiệt độ tối ưu để các men ADN polymerase xúc tác nhằm nối dài đoạn mồi để hình thành một mạch đôi ADN mói Như vậy, nếu ta cung cấp hai đoạn mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN đích ta

sẽ chỉ tổng hợp được một đoạn ADN nằm giữa hai đoạn mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự ADN đích xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó

đủ để thiết kế tạo các đoạn mồi bổ sung chuyên biệt Các mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược Phản ứng PCR là một sự khuếch đại in vitro một trình tự ADN mạch khuôn vói xúc tác của enzyme trong khoảng 35 hoặc 40 chu kỳ Phản ứng sẽ được thực hiện trong một ống nhựa đặt trong một máy có thể điều chỉnh nhiệt độ gọi là máy chu

kỳ nhiệt (máy PCR hay thermal cycler), máy này có thể cài đặt chương trình làm nóng

và làm nguội theo chu kỳ cần thiết (hình 7) Quá trình phản ứng sẽ làm gia tăng số bản sao một trình tự ADN khuôn ban đầu Cả hai sợi ADN đều được dùng để làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi được cung cấp đủ cho cả hai sợi Trong phản ứng PCR, các đoạn mồi được chọn để chặn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên sao cho các sợi ADN tổng hợp mới được bắt đầu từ mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia Như vậy sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi ADN mới được tổng hợp Hỗn hợp phản ứng lại được đun nóng lên để tách sợi ban đầu khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đố lại được dùng làm khuôn tiếp cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước gắn đoạn mồi, tổng hợp ADN và tách rời

các đoạn Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ phản úng sẽ tạo ra 2 rn

Trang 26

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa X1U-2009 Tr ường ĐHCT

Hình 8 Nguyên lý của phản ứng PCR (nguồn images.google.com)

Hình 9 Máy đọc gel Bỉo Rad

Như vậy từ một số lượng N ban đàu của ADN đích sau n chu kỳ nhiệt, phản ứng PCR có thể tổng hợp được Nx2n bản sao chép của một chuỗi acid nucleic đích Các ADN đã được khuếch đại sẽ được xác định bằng điện di trên thạch agarose (hình 10)

Hình 10 Phát hỉện sản phẩm PCR qua điện di trên thạch

Trang 27

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

Như vậy khi ứng dụng kỹ thuật PCR, trình tự một đoạn ADN của vi khuẩn lao có thể được sao chểp một cách đặc hiệu từ mẫu bệnh phẩm cố mang vỉ khuẩn lao, đây là kỹ thuật nhằm tạo ra hàng triệu bản copy một trình tự ADN của vi khuẩn lao đã được biết trước, đoạn olỉgonucleotíd sử dụng làm đoạn mồi gồm 20 cặp base tương ứng vcd trình

tự base của đoạn IS 6110 đặc hiệu với M tuberculosis Đoạn IS 6110 không phải là gen

mà là một đoạn của ADN, chức năng của nó chưa được biết rõ, đoạn IS 6110 cố thể tự nhân lên và hợp nhất với gen của vật chủ Kỹ thuật này đã được đưa vào sử dụng trong

chẩn đoán, phát hiện lao, giám sát điều trị Vi khuẩn Mycobacterium có 4 loại là M tuberculosis, M bovis, M africanum, M microti (gọi chung là M tuberculosis

complex) đều cố chứa đoạn IS 6110 vớỉ cấu trúc gồm 1361 cặp base Chính vì vậy nố

được sử dụng gần như đặc hiệu để phát hiện M tuberculosis gây bệnh ở người, sự phân biệt giữa M tuberculosis và M bovis cũng có thể bằng đoạn IS 6110, vì đối với M bovỉs thường chỉ có một đoạn IS 6110 còn M tuberculosis thường cố nhiều đoạn Một

ưu điểm quan trọng của kỹ thuật PCR so vcti các phương pháp khác là chỉ cần một lượng nhỏ vi khuẩn (1-3 vi khuẩn /lml bệnh phẩm là đủ lượng ADN) để cho kết quả dương tính Thời gian để có kết quả ở kỹ thuật này cũng nhanh 24 giờ kể từ khỉ nhộn

bệnh phẩm (Trần Văn Sáng, 2000).Những nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán bệnh lao.

Tại Khoa Vi sinh, Bệnh viện Lao-Bệnh phổi trung ương nhận thấy với chủng vi khuẩn lao châu Á thì 71% vi khuẩn có từ 5 đoạn IS 6110 trở xuống, trong khi vi khuẩn

cổ điển tỷ lệ này là 10% (Nguyễn Văn Hưng, 1999) Tại Việt Nam đã có các đề tài nghiên cứu như:

-“Chẩn đoán lao hạch ở bệnh nhân nhiễm HIV/AIDS bằng phương pháp PCR” thử nghiệm được thực hiện với PCR mix có đoạn mồi (primers) là Ptl8 và INS2 đặc hiệu

cho M tuberculosis (Trần Thị Bích Liên et al., 2003).

-“Phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn lao trên một số đối tượng khác nhau” đã thực

hiện với PCR mix có đoạn mồi (primers) là Ptl8 và INS2 đặc hiệu cho M tuberculosis

(Mai Nguyệt Thu Hồng et al., 2005)

-“Chẩn đoán nhanh lao màng não ở trẻ em bằng phương pháp PCR” phản ứng khuếch đại được thực hiện với PCR mix mà đoạn mồi được sử dụng trong nghiên cứu này là Ptl8 và INS2 Đây là những oligonucleotid nằm trong trình tự IS 6110 (Nguyễn Ngọc Lan et al., 1999)

-“Vai trò thử nghiệm PCR trong chẩn đoán lao màng phổi” (Âu Thanh Tùng, 2001)

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 27 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 28

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

Tính ưu việt của PCR là trội hẳn so với các kỹ thuật chẩn đoán vi khuẩn lao cổ điển đã được nhiều công trình nghiên cứu ở trong nước và nước ngoài khẳng định, tuy nhiên điều kiện tiến hành kỹ thuật phải hết sức đảm bảo để tránh những sai sót, ví dụ ADN không bị phân rã của vi khuẩn đã chết cũng có thể được khuyếch đại Để đạt được độ nhạy và độ đặc hiệu mong muốn, theo Grosset (1996), phải loại bỏ được chất ức chế có trong bệnh phẩm Chất ức chế đó là ADN (không phải chuỗi đích) của các tế bào miễn dịch, tế bào viêm có trong bệnh phẩm Phải làm sao có được ADN tinh khiết đó là điều rất khó trong thường qui Một trong những nghiên cứu đầu tiên sử dụng PCR trong chẩn đoán lao trực tiếp tò các mẫu đàm là nghiên cứu của Eisenach et al (1991) trên

162 mẫu đàm Các tác giả đã phân biệt được trực khuẩn lao với các Mycobacterium

không lao khác bằng cách sử dụng đoạn tình tự IS 6110 Tiếp đó, Brisson-Noel et al (1991) tiến hành trên 514 mẫu bệnh phẩm khác nhau (đàm, dịch hút từ dạ dày, dịch màng phổi) Kolk (1992) trên 75 bệnh nhân, Forbes và Karen (1993) trên 734 mẫu bệnh phẩm De Wit D et al (1993).Clarridge J.E et al (1993) trên các mẫu bệnh phẩm

rất lớn (5000mẫu) Các nghiên cứu như Yuen L.K w et al (1993), Schluger N et al

(1994) đều cho những kết quả rất khích lệ Trong lao phổi, theo một số tác giả, PCR có

độ nhạy là 83.5%, độ đặc hiệu là 99% Trong lao ngoài phổi, đặc biệt trong các thể lao nặng, PCR cũng có vai trò quan trọng trong việc phát hiện, chẩn đoán nhanh, chính xác các thể lao này Berenguer et al (1992) sử dụng PCR trong chẩn đoán lao màng não PCR còn được sử dụng trong chẩn đoán trực khuẩn lao kháng thuốc Zhang Y et al (1992) sử dụng PCR xác định được chủng trực khuẩn lao kháng INH do thiếu gen catalase (gen Kat G) Imboden p et al (1993) phát hiện đột biến kháng thuốc

rifamicine của trực khuẩn lao bằng kỹ thuật PCR Donnabella V et al (1994) phân lập được gen kháng rifamicine của trực khuẩn lao bằng PCR Những kỹ thuật PCR có thể góp phần vào việc hổ trợ cùng vói các phương pháp chẩn đoán cổ điển giúp người thầy thuốc lâm sàng chẩn đoán sớm để từ đó có thể chọn lọc và sử dụng hợp lý các kỹ thuật

này trong quá trình điều trị bệnh lao.CHƯƠNG III

PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1.Thiết bị

Máy ly tâm eppendorf 5417C, máy hút chân không, máy quang phổ Backman Coulter,

máy PCR Perkin Elmer 9700, máy chụp gel BIORAD uv 2000, máy vortex, cân điện

tử, các loại ống nghiệm, bộ điện di, tủ lạnh -20°c, microwave, tủ cấy, nồi khử trùng, tủ

ủ, tủ hút, bộ micropipette

3.1.2.Hóa chất

Agarose, Ethanol 70% và 96%, bộ xử lý SPUTA_ PREP, bộ ly trích DNA-PREP BOOM, Aceton, Ethidium Bromide, Taq polymerase, nước cất, primers, BiH20, MgCl2, dNTPs,

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 28 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 29

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1.Phưomg pháp thu mẫu.

127 mẫu thử -Lao thưòng:

Xử lý mẫu Ly trích ADN Phản ứng PCR Đọc kết quả So sánh kết quả

.lao phổi lao ngoài phổi

^-Lao kháng thuốc

Nhuộm Đọc dưói KHV

Hình 11 Quỉ trình thu nhận mẫu

Mẩu thử là 127 mẫu bệnh phẩm được thu thập từ những bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện lao và bệnh phổi TP cần Thơ từ tháng 08/2008 đến tháng 12/2008, những mẫu thử này sẽ được bệnh viện lao lấy theo đúng qui cách Mỗi mẫu thử được chia làm ba phần và thực hiện theo chỉ định của bệnh viện như sau: một phần đem nhuộm

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 29 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 30

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

soi trực tiếp trên kính hiển vi, một phần đem nuôi cấy trong môi trường thích hợp đối vói vi khuẩn lao Song song với các thử nghiệm thường qui như vừa nêu, một phần của mẫu thử đươc đưa về phòng thí nghiệm Sinh học phân tử trường Đại học Y Dược Cần Thơ, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học Trường Đại học cần Thơ để tiến hành thử nghiệm tiếp theo như: xử lý mẫu bênh phẩm, ly trích ADN, khuếch đại ADN bằng phản ứng PCR (thực hiện phương pháp PCR song song giữa bộ kit thương mại và bộ kit thử nghiệm)

Mau bệnh phẩm được chia thành hai nhóm

1- Nhóm lao thường:là những bệnh nhân có những triệu chứng nghi bị bệnh lao đến khám lần đầu tiên gồm:

-Lao phổi: 43 mẫu bệnh phẩm là đàm và dịch rửa phế quản

-Lao ngoài phổi: 40 mẫu bệnh phẩm là dịch màng phổi, dich não tủy.2- Nhóm lao kháng thuốc: 44 mẫu bệnh phẩm là những bệnh phẩm được lấy từ những bệnh nhân có triệu chứng lâm sàng biểu hiện lao đã được điều trị theo các phác

đồ chỉ định nhưng kết quả thất bại

3.2.2 Xử lý mẫu bệnh phẩm

Theo “Phương pháp thuần nhất và loại trừ tạp nhiễm cho mẫu đàm” dựa trên phương pháp của Kubica et al (1963) và Samuel Ratnam et al (1987)

Nguyên tắc: Trên nguyên tắc làm thuần nhất và loại trừ tạp nhiễm các mẫu đàm bằng

dung dịch có chứa N-Acetyl-L.Cysteine (NALC)&NaOH Sau khi trung hòa bằng đệm phosphate, vi khuẩn mycobacteria trong mẫu đàm sẽ được tập trung trong cặn của dung dịch nhờ ly tâm Thuốc thử được cung cấp là SPUTA_PREP

- Mucoprep: là dung dịch chứa NaOH (0.5M) và tìisodium citrate (0.05 M) giữ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (T° PTN)

- N-Acetyl-Cysteine: giữởT°PTN

- Phosphate buffer 10X (0,67M); pH 6.8: giữ ở T° PTN

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Trang 31

Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Khóa XIII-2009 Tr ưòng ĐHCT

3 Cho không quá 3ml đàm vào mỗi tube falcon có chứa 5ml HDB, sau đó lắc nhẹ

để làm tan đàm Đe yên ở T°PTN trong 20 phút

4 Thêm vào 5ml đệm Phosphate IX, lắc nhẹ để trộn đều rồi ly tâm trong máy ly tâm (3000 vòng /phút) trong 30 phút

5 Đổ bỏ phần nước nổi, giữ lại phần cặn khoảng 0.5ml để thực hiện tiền ly trích ADN vói thuốc thử ProK-prep (proteine K/detergent) và sau đó tiến hành ly trích ADN vói bộ thuốc thử, ADN này được dùng để làm ADN làm khuôn cho phản ứng PCR.Cặn này còn có thể dung để nhuôm Ziehl-Nelsen và nuôi cấy

3.2.3 Ly trích ADN

Theo phương pháp của Boom et al (1990)

Nguyên tắc : Dựa trên nguyên tắc dùng guanidine thiocyanate (GuSCN) để ly giải hoạt tính nuclease và các ADN trong mẫu sẽ bám vào các hạt diatom, nhờ đó ly trích

và tình khiết được ADN từ mẫu bệnh phẩm.Thuốc thử được cung cấp: DNA-PREP BOOM

- Dung dịch Diatom: giữ ở T° PTN

- L6 : là đệm ly giải gồm GuSCN,EDTA và Triton X100 trong đệm Tris giữ trong

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện Nghiên cứu vồ Phát triển Công nghệ Sinh học

Ngày đăng: 09/09/2015, 16:49

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TRÍCH ĐOẠN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w